用于有效治疗、预防或改善痤疮的二氢卟吩e6

摘要

本发明涉及包含二氢卟吩e6作为活性成分的药物组合物或化妆品组合物，所述二氢卟吩e6具有对抗痤疮丙酸杆菌的优异的抗菌活性。

权利要求

1.具有对抗痤疮丙酸杆菌的抗菌活性的二氢卟吩e6在制备用于治疗和预防痤疮的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中二氢卟吩e6被制成用于皮肤外用的制剂，所述制剂选自液体、乳剂、悬浮剂、软膏剂和贴剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其中二氢卟吩e6是由日光或荧光活化并产生活性氧簇的光敏化合物。

4.根据权利要求1所述的用途，其中二氢卟吩e6用于通过光动力疗法治疗和预防痤疮。

5.具有对抗痤疮丙酸杆菌的抗菌活性的二氢卟吩e6在制备用于预防和改善痤疮的化妆品中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其中二氢卟吩e6被制成选自化妆水、洗剂和霜剂的制剂。

7.根据权利要求5所述的用途，其中二氢卟吩e6是由日光或荧光活化并产生活性氧簇的光敏化合物。

8.根据权利要求5所述的用途，其中二氢卟吩e6用于通过光动力疗法预防和改善痤疮。

说明书

用于有效治疗、预防或改善痤疮的二氢卟吩e6

技术领域

[0001] 本发明涉及含有二氢卟吩e6作为活性成分的药物组合物或化妆品组合物，所述二氢卟吩e6具有对抗痤疮丙酸杆菌的优异的抗菌活性。

背景技术

[0002] 皮肤在保护人体免受外部环境伤害中发挥重要作用。各种细菌定居于皮肤上，并引起许多皮肤疾病。痤疮是最有代表性的疾病。词语痤疮(acne)由希腊词语“akme”发展而来，其含义是“斑点”。尽管痤疮最常在青春期出现，但是由于空气污染、药物滥用等，其近期也在广泛的年龄组中出现。痤疮在某些情况下发生，在所述情况中，连接于毛囊的被称为皮脂腺的油腺过度分泌皮脂，其与死的皮肤细胞一起堵塞毛囊。随着皮脂和其它杂质被困在毛囊中，它们变为硬块，或者随着细菌聚集而发展为炎症。

[0003] 通常，痤疮是由多种因素引起的，包括增加的皮脂生成、皮肤菌群在毛囊中的增殖、遗传因素等。引起痤疮的代表性细菌物种是痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne；P.acne)。根据囊壁是否破裂，痤疮的损伤可以分为化脓性的和非化脓性的。痤疮还分为1期，其中随着浅色的粉刺生长使毛囊角质化，2期，其中出现丘疹，3期，其中由于严重的炎症出现脓疱型痤疮，4期，其中形成囊肿，以及5期，其中出现结节并形成疤痕。非化脓性痤疮被定义为黑头粉刺和白头粉刺。

[0004] 痤疮丙酸杆菌产生低分子量的肽，已知其化学性地诱导多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes；PMNK)，从而引起炎症。此外，已知由痤疮丙酸杆菌产生的各种炎症因子触发免疫细胞产生细胞因子(cytokine)，如白细胞介素(IL)-8、IL-1β、TNF-α等，从而加重皮肤上的炎症反应。使用口服抗生素和维甲酸类以治疗经此机制所产生的痤疮。特别地，尽管可以通过抗生素减轻由细菌感染所导致的炎症性痤疮的症状，但是其可能会引起副作用。尽管近期使用四环素(tetracycline)、克林霉素(clindamycin)、红霉素(erythromycin)等作为抗生素以抑制痤疮丙酸杆菌的增殖并降低炎症反应，但是由于抗生素耐药性不能长时间使用它们，并且已知它们引起严重的肝毒性。此外，由于副作用，肾上腺皮质激素(类固醇)或雌激素的使用在减少。尽管近期受青睐的维生素A衍生物异维甲酸(isotretinoin)具有减少皮脂、使角质化的和封闭的毛孔正常化、以及抑制痤疮丙酸杆菌的增殖和毛囊中炎症的作用，但是其具有常见的副作用如口腔干燥，以及致命的副作用(出生缺陷)。

[0005] 为了克服这些问题，已积极地进行用于食品或化妆品的防腐剂和用于医疗目的的抗菌剂方面的研究，所述防腐剂和抗菌剂使用相对较少刺激皮肤的且对人体无害的天然物质。在这点上，近期开发并应用了外科治疗，如挤压、化学脱皮、物理脱皮、激光脱皮、氦-氖激光疗法，光疗法等。最近，使用光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)用于痤疮等的简单皮肤病学治疗。

[0006] 在光动力疗法中，已知各种光敏感化合物和光线引起细菌DNA的损伤，并通过使细菌细胞膜运输失活和减弱细胞组分而损伤细胞膜，从而影响细菌的失活。此外，光动力疗法具有一些有利特征：其在由病原微生物引起的感染性疾病的治疗中具有广泛的抗菌谱，其使耐抗生素菌株有效地失活，其具有低的突变可能性，并且没有耐光的细菌。这有力地支持了光动力疗法可以是用于治疗感染性疾病的实用的策略。

[0007] 同时，二氢卟吩e6是众所周知的在恶性肿瘤的光动力疗法(PDT；Photodynamic therapy)中使用的光敏化合物。已知当与其他光敏化合物相比时，二氢卟吩e6具有更高的恶性细胞选择性，并且对正常细胞不表现出毒性。在许多文献中报道，二氢卟吩e6作为抗癌剂是有用的(韩国专利登记号808,630和841,959)。然而，尚未报道过二氢卟吩e6对抗痤疮丙酸杆菌的优异的抗菌活性。

发明内容

[0008] 技术问题

[0009] 本发明意在提供用于治疗、预防或改善痤疮的药物组合物或化妆品组合物。

[0010] 技术方案

[0011] 在一个方面，本发明提供用于治疗和预防痤疮的药物组合物，其含有二氢卟吩e6作为活性成分。

[0012] 在另一个方面，本发明提供用于预防和改善痤疮的化妆品组合物，其含有二氢卟吩e6作为活性成分。

[0013] 有益效果

[0014] 目前可用的大多数痤疮药物是合成的抗生素，如过氧化苯甲酰、四环素、红霉素和克林霉素，它们在副作用和安全性方面具有问题。相反，二氢卟吩e6是一种天然产物，并且与人体是相容的。

[0015] 另外，由于二氢卟吩e6具有抗菌、抗炎和抗氧化活性，其作为活性成分用于治疗、预防和改善各种皮肤疾病是有用的，特别是针对痤疮具有显著的作用。

[0016] 此外，由于二氢卟吩e6是由日光、荧光等活化的光敏化合物，当将二氢卟吩e6涂抹于皮肤上并暴露于自然光下时，其通过破坏皮脂细胞和引起痤疮的细菌，表现出治疗、预防和改善痤疮的作用。

附图说明

[0017] 图1显示二氢卟吩e6对抗革兰氏阳性的痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的抗菌作用。

[0018] 图2显示二氢卟吩e6对抗革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗菌作用。

[0019] 图3显示二氢卟吩e6对抗革兰氏阴性的大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌作用。

具体实施方式

[0020] 本发明涉及用于治疗、预防或改善痤疮的药物组合物或化妆品组合物，其含有二氢卟吩e6作为活性成分。

[0021] 本发明的组合物中所含有的作为活性成分的二氢卟吩e6是一种从叶绿素(chlorophyll)提取物中分离并纯化的天然产物。例如，在韩国专利登记号1,180,695中，公开了用于从叶绿素提取物中分离并纯化高纯度二氢卟吩e6的方法。

[0022] 1.药物组合物的制备

[0023] 除了二氢卟吩e6作为活性成分之外，可以通过进一步包含制药领域中常用的合适的载体、赋形剂或稀释剂，将本发明的药物组合物制成用于外用的制剂，如液体、悬浮剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。本发明的组合物中可以含有的载体、赋形剂或稀释剂可以为，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、褐藻胶、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。可以通过使用常用的稀释剂或赋形剂如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等，制备药物组合物。

[0024] 可以经皮施用本发明的药物组合物，并且可以由本领域技术人员适当地选择药物组合物的具体施用剂量，尽管其依据患者的身体状况和体重、疾病的严重程度、药物类型、施用途径和施用周期而变化。可以以0.0001-1g/kg，特别地0.001-200mg/kg的每日剂量施用本发明的组合物，以达到期望的效果。可以每日一次或每日数次进行施用。但是，本发明的范围不受施用剂量以任何方式的限制。

[0025] 2.化妆品组合物的制备

[0026] 本发明的化妆品组合物可以为水性的、含水醇的或油性的溶液，水包油、油包水或多重乳剂，水性或油性凝胶，液体，糊状或固态无水产品，或者在水性相中使用小球体的油性分散体的形式。更特别地，其可以为离子和/或非离子脂质囊泡的形式。

[0027] 本发明的化妆品组合物可以为流体的形式。其还可以为白色或彩色霜剂、软膏、乳洗剂、精华素(serum)、精油、糊剂或摩丝的形式。其可以以气雾剂的形式涂抹于皮肤，或者其可以为固体的形式，例如棒状物。其可以用作皮肤护理产品和/或化妆产品。

[0028] 根据本发明的化妆品组合物可以进一步含有化妆品领域中常用的佐剂，例如亲水性或亲脂性胶凝剂、亲水性或亲脂性活化剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填充剂、阻断剂、颜料、除臭剂和染料。可以含有相关领域中常用量的这些不同的佐剂，例如，基于化妆品组合物的总重量0.0001-10重量％。基于其性质，可以将佐剂引入油性相、水性相、脂质囊泡和/或纳米颗粒。在任何情况下，应当挑选佐剂及其数量，使得它们不会不利地影响根据本发明的化妆品组合物的期望效果。

[0029] 将通过实施例更详细地描述本发明。但是本发明的范围并不受它们的限制。

[0030] [实施例]二氢卟吩e6的作用

[0031] 实施例1.对抗痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes，KCTC3314)的抗菌作用[0032] 痤疮丙酸杆菌是一种主要栖息于毛孔周围或毛囊的漏斗部中的细菌。其主要以皮脂为食，将皮脂的主要成分(即，甘油三酯)降解为脂肪酸和甘油。所产生的游离脂肪酸严重刺激皮肤，引起毛囊壁或毛孔周围细胞的炎症。当在黑暗条件下在200μM的浓度处理时，相比于未处理的对照组，二氢卟吩e6抑制痤疮丙酸杆菌的生长约50％。作为结果，仅有约50％的细菌可以增殖。相反，在相同的条件下5-ALA抑制细菌的生长约25％，并且约85％的细菌可以增殖。当使用卤素灯向痤疮丙酸杆菌照射3,000Lux的光线持续1小时时，二氢卟吩e6在1.562μM的浓度抑制约45％的细菌生长，并且仅有约55％的痤疮丙酸杆菌可以增殖。在相同的条件下，即使在200μM的浓度，5-ALA仅抑制细菌的生长约10％。当照射30,000Lux的光线持续1小时时，二氢卟吩e6在1.562μM的浓度抑制约55％的细菌生长，并且仅有约45％的细菌可以增殖。然而在相同的条件下，即使在200μM的浓度，5-ALA仅抑制细菌的生长约25％(图1)。

[0033] 3,000Lux的光照条件相当于晴天窗户旁边的光线强度，而30,000Lux则相当于下午3至5时室外条件的光线强度。

[0034] 实施例2.对抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗菌作用

[0035] 金黄色葡萄球菌是一种与败血症、肠感染、皮肤感染和关节感染相关的细菌。其可以通过受污染的手、眼睛或皮肤传播，并且可以引起炎症或食物中毒。近期，已发现耐抗生素的金黄色葡萄球菌。图2显示测定二氢卟吩e6和5-ALA对抗金黄色葡萄球菌的抗菌作用的结果。在黑暗条件下，相比于对照组，二氢卟吩e6在100μM的浓度抑制金黄色葡萄球菌的生长约35％。在相同的条件下，5-ALA抑制细菌的生长约10％。当照射3000Lux的光线持续1小时时，二氢卟吩e6在12.5μM的浓度抑制约45％的细菌生长，并且仅有约55％的细菌可以增殖。相反，5-ALA在200μM的浓度抑制约20％的细菌生长。当照射30,000Lux的光线持续1小时时，二氢卟吩e6在3.125μM的浓度抑制约40％的细菌生长，并且约60％的细菌可以增殖。相反，5-ALA在200μM的浓度抑制约10％的细菌生长。

[0036] 实施例3.对抗大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌作用

[0037] 图3显示二氢卟吩e6对抗大肠杆菌的抗菌作用。尽管大肠杆菌在肠道中通常不显示致病性，但是其可能在身体的其他部位引起膀胱炎、肾盂炎、腹膜炎、败血症等。此外，某些抗原性的大肠杆菌甚至可以在肠道中引起感染性腹泻。

[0038] 在黑暗条件下，相比于对照组，二氢卟吩e6在800μM的浓度抑制大肠杆菌的生长约40％。相反，5-ALA在任何浓度都不显示抑制细菌生长的作用。在3000Lux的光照条件下，二氢卟吩e6在800μM的浓度抑制约35％的细菌生长。然而，在相同的光照条件下，5-ALA在任何浓度都不显示抑制细菌生长的作用。当照射30,000Lux的光线持续1小时时，二氢卟吩e6在
800μM的浓度抑制约20％的细菌生长。在相同的光照条件下，5-ALA不显示对抗大肠杆菌的抗菌作用。

[0039] 实施例4.二氢卟吩e6对皮脂细胞中脂质积累的变化的测定

[0040] 在CO2恒温器(37℃,5％CO2)中，在补充有10％胎牛血清(FBS,Gibco RBL Co.)的皮脂细胞基础培养基(sebocyte basal medium,Biochrom Ag Co.,德国)中培养人类永生化皮脂细胞(human immortalized sebocytes)SZ95细胞。

[0041] 将SZ95细胞转移至腔室载玻片，然后在用睾丸素刺激并用不同浓度的二氢卟吩e6处理之后孵育。孵育之后，先后用油红(Oil red)和哈里斯苏木精(Harris’hematoxylin)将细胞染色。然后，通过光学显微镜观察SZ95细胞中积累的脂滴(Lipid droplet)。

[0042] 将SZ95细胞(1×105个细胞)转移至100Φ平皿中，并培养48小时。然后，在皮脂细胞无血清培养基(sebocyte serum-free medium)中将细胞培养5天。收集经培养的细胞，并在超声下使用裂解缓冲液(lysis buffer；EDTA 10μL,100mM SPB溶液,PMSF 1μL,曲拉通X-10010μL)将其裂解，然后确定蛋白质的量。在向细胞裂解物中加入氯仿:甲醇(2:1)溶液之后，以2000rpm离心15分钟，然后收集沉淀。在向上清液中加入氯仿:甲醇(2:1)溶液之后，以相同的方式再次进行离心，然后收集沉淀。然后，通过氮气吹扫从沉淀中提取脂质。

[0043] 将提取的脂质(lipid)溶解于300μL乙醇中。在加入至H2SO4后，将50μL脂质溶液煮沸10分钟。然后，通过在4℃冷却形成酮体(keton body)。在37℃用6mL磷酸-香草醛(Phospho-vanillin)试剂处理100μL冷却的样品持续15分钟，然后在540nm的波长测量吸光度。参考值为1-50mg/mL。

[0044] 为了观察二氢卟吩e6对SZ95细胞的细胞毒性，用二氢卟吩e6在10μg/mL和25μg/mL的浓度处理之后将细胞培养5天，然后通过MTT法测定细胞存活力。作为结果，发现相对于对照组，在分别的浓度，经二氢卟吩e6处理的SZ95细胞的存活力为101.3(±6.3)和102.1(±2.2)。因此，证实了二氢卟吩e6处理并不影响SZ95细胞的存活力。此外，为了观察细胞死亡是否由二氢卟吩e6所引起，观察了形态变化。作为结果，在10μg/mL和25μg/mL的浓度用二氢卟吩e6处理的SZ95细胞显示了与对照组细胞相似的密度和结构。

[0045] 为了观察对SZ95细胞脂质合成的作用，在10μg/mL和25μg/mL用二氢卟吩e6处理细胞持续5天，然后测定总脂质的量。作为结果，相比于对照组，SZ95细胞显示了分别为24.4(±0.3)mg/mL和20.2(±0.2)mg/mL的总脂质的显著下降。

[0046] 作为通过油红染色观察细胞脂滴中变化的结果，SZ95细胞在细胞质中显示大量脂滴，这是皮脂细胞的特征。在HaCaT细胞(其是毛囊中的角化细胞)中没有观察到脂滴。相反，相比于正常的SZ95细胞，经二氢卟吩e6处理的SZ95细胞显示出显著减少的脂滴。

[0047] 实施例5.二氢卟吩e6对皮脂细胞中胆固醇含量的变化的测定

[0048] 将提取的脂质(lipid)溶解于300μL乙醇中，并使用总胆固醇试剂盒(total cholesterol kit)测定皮脂细胞中胆固醇的浓度。将1mL酶试剂与100μL样品混合并在37℃孵育5分钟，然后在500nm的波长测量吸光度。通过将20μL标准溶液加入至3mL酶试剂，制备3mg/mL浓度的标准胆固醇溶液。

[0049] 总胆固醇(mg/mL)＝(样品的吸光度/标准溶液的吸光度)×标准溶液的浓度[0050] 对于分别在10μg/mL和25μg/mL用二氢卟吩e6处理的皮脂细胞，胆固醇浓度为0.78(±0.01)mg/mL和0.73(±0.02)mg/mL。也就是说相比于对照组，二氢卟吩e6处理组显示了降低的胆固醇含量。

[0051] 实施例6.二氢卟吩e6对皮脂细胞中甘油三酯含量的变化的测定

[0052] 将提取的脂质(lipid)溶解于300μL乙醇中，并使用甘油三酯试剂盒(triglycerides kit)测定皮脂细胞中甘油三酯的浓度。将1mL酶试剂与100μL样品混合并在37℃孵育5分钟，然后在546nm的波长测量吸光度。通过将20μL标准溶液加入至3mL酶试剂，制备3mg/mL浓度的标准甘油三酯溶液。

[0053] 甘油三酯(mg/mL)＝(样品的吸光度/标准溶液的吸光度)×标准溶液的浓度[0054] 对于分别在10μg/mL和25μg/mL用二氢卟吩e6处理的皮脂细胞，甘油三酯浓度为0.69(±0.01)mg/mL和0.62(±0.01)mg/mL。也就是说相比于对照组，二氢卟吩e6处理组显示了降低的甘油三酯含量。

[0055] [药物的制备]

[0056] 药物1.乳剂的制备

[0057] 称量0.5g二氢卟吩e6、5g硬脂醇、0.8g聚山梨醇酯-60、4g环甲基硅氧烷、2g荷荷巴油、0.2g对羟基苯甲酸甲酯、8g 1,3-丁二醇、0.15g卡波姆、0.05g黄原胶、1.2g聚丙烯酰胺/C13-14异链烷烃/月桂醇聚醚-7、0.2g咪唑烷基脲、0.15g三乙醇胺、0.1g芳香剂和适量水。在这些成分中，通过在辅助油相罐中加热至75℃溶解油性成分，并通过在乳化罐中加热至75℃溶解水性成分。在减压下将油性成分注入乳化罐之后，在匀化器(Homogenizer)3500rpm和踏板混合器(Pedal Mixer)25rpm的条件下，在75℃进行乳化持续5分钟。在真空脱气接着冷却后获得乳剂。

[0058] 药物2.贴剂的制备

[0059] 在室温，通过在溶解罐中将15g甘油、2g聚丙烯酸、2g丙烯酸酯共聚物、0.4g氢氧化铵、0.05g EDTA二钠和0.2g酒石酸搅拌均匀获得黏稠液体。将在室温溶解的0.2g对羟基苯甲酸甲酯、1g乙醇、0.1g甘草酸二钾和0.05g芳香剂注入溶解罐，然后将混合物搅拌均匀。通过将在60℃溶解于纯化水中的0.5g二氢卟吩e6和5g丙二醇分批注入溶解罐，制备贴剂中使用的凝胶。

[0060] 使用配备有敷抹器的适当的涂布机将制得的凝胶涂布于硅化聚酯膜上。通过将聚酯膜插入袋状层合膜中制备贴剂，所述袋状层合膜由纸、低密度聚乙烯和铝构成。

[0061] 药物3.液体的制备

[0062] 根据一般的液体制备方法，将100mg二氢卟吩e6、10g高果糖玉米糖浆和5g甘露醇溶解于适量纯化水中。在加入适量的柠檬香精之后，通过加入纯化水将总体积调至100mL。最后，通过灭菌制备液体药物。

[0063] [化妆品的制备]

[0064] 化妆品1.化妆水的制备

[0065] 通过将30mg二氢卟吩e6、5mg聚氧乙烯氢化蓖麻油、30mg甘氨酸、1mg甘草酸二钾、30mg 1,3-丁二醇、1mg透明质酸钠、50mg乙醇、1mg抗氧化剂、1mg三乙醇胺和1mg EDTA与适量纯化水混合制备化妆水。

[0066] 化妆品2.洗剂的制备

[0067] 通过将15mg二氢卟吩e6、100mg L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐、100mg水溶性胶原(1％水溶液)、10mg柠檬酸钠、5mg柠檬酸和300mg 1,3-丁二醇与适量纯化水混合制备洗剂。

[0068] 化妆品3.霜剂的制备

[0069] 通过将12mg二氢卟吩e6、200mg聚乙二醇单硬脂酸酯、500mg自乳化单硬脂酸甘油酯、400mg鲸蜡醇、600mg鲨烯、600mg三(2-乙基己酸)甘油酯、100mg鞘脂和700mg 1,3-丁二醇与适量纯化水混合制备霜剂。