作为神经保护剂的EphA4抑制剂转让专利
申请号 : CN201480039831.8
文献号 : CN105473591B
文献日 : 2018-02-23
发明人 : 叶玉如 , 傅洁瑜 , 叶翠芬 , 傅颖瑜 , 顾硕 , 黄旭辉 , 洪国宏
申请人 : 香港科技大学
摘要 :
本发明提供了EphA4信号转导在诸如阿尔茨海默氏病（Alzheimer's Disease）的涉及β‑淀粉样蛋白诱导的神经毒性的神经变性病症中的作用的发现。提供了用于治疗由过度激活的EphA4信号转导所引起或加重的疾病的新的治疗方法、治疗剂、以及试剂盒。还提供了用于鉴定作为可用于治疗涉及过度活跃的EphA4。
权利要求 :
1.一种式I的化合物：
或其药学上可接受的盐；其中
每一个R1是C1-C6烷基；
每一个R2是氢；
每一个Rq是C1-C6烷基或电子对；
L是C1-C12亚烷基；
X选自由化学键、-O-、-S-、以及-N(R4)-组成的组；
R3选自由以下各项组成的组：氢、卤代、C1-C6烷基、C1-C12烯基、C1-C14芳基、(C1-C14芳基)(C1-C6烷基)、(C5-C10杂芳基)(C1-C6烷基)、酰基、以及(R4)2N-(C1-C6亚烷基)；以及4
每一个R独立地选自由以下各项组成的组：氢、杂芳基烷基以及酰基；
其中酰基独立地选自取代的或未取代的苯甲酰基，取代的或未取代的C2-C12烯酰基或生物素基；
前提条件是所述化合物是EphA4抑制剂。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1是甲基。
3.如权利要求1所述的化合物，其中Rq是甲基或电子对。
4.如权利要求1所述的化合物，其中L是式-(CH2)n-，其中n是3至12的整数。
5.如权利要求4所述的化合物，其中n是5至10的整数.
6.如权利要求4所述的化合物，其中n是5至9的整数.
7.如权利要求4所述的化合物，其中n是6至10的整数.
8.如权利要求4所述的化合物，其中n是6至8的整数.
9.如权利要求1或2所述的化合物，其中X是化学键、-O-、或-NH-。
10.如权利要求1所述的化合物，其中(i)R3不是氢；
(ii)R3是卤代；
(iii)R3是甲基、或(C5-C10杂芳基)(C1-C6烷基)；
(iv)R3是C6-C14芳基；
(v)R3是(C1-C14芳基)(C1-C6烷基)；
(iv)R3是酰基；或者
(v)R3是(4-甲氧基苯甲酰基)甲基、烯丙基、肉桂基、6-氨基己基、或3-咪唑-1-基丙基、或(R4)NH-(C1-C6亚烷基)。
3
11.如权利要求1所述的化合物，其中R是氯或溴。
12.如权利要求1所述的化合物，其中R3是苯基、4-苯甲氧基苯基、4-羟苯基、或3,4-二甲氧基苯基。
13.如权利要求1所述的化合物，其中R3是苯甲基、2-苯基苯甲基、3-氯苯甲基、3-甲氧基苯甲基、4-苯甲酰基苯甲基、4-溴苯甲基、4-叔丁基苯甲基、4-甲基苯甲基、4-甲氧基苯甲基、或2,6-二氯苯甲基。
14.如权利要求1所述的化合物，其中R3是苯甲酰基、2-碘苯甲酰基、2-碘-4-溴苯甲酰基、3,4-二甲氧基苯甲酰基、5-甲氧基-2-硝基苯甲酰基、生物素基、或3-苯基丙烯酰基.
15.如权利要求1所述的化合物，其中R3是3,4-二甲氧基苯甲酰基或5-甲氧基-2-硝基苯甲酰基；
16.如权利要求1所述的化合物，其中X是-O-；并且其中R3是4-羟苯基、4-苯甲氧基苯基、或3,4-二甲氧基苯基。
17.如权利要求1所述的化合物，其中R4是氢或生物素基。
18.一种EphA4信号转导抑制剂在制备用于治疗患有涉及EphA4信号转导的疾病的受试者的药物中的用途，其中所述抑制剂是权利要求1所述的化合物。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述抑制剂连同药学上可接受的赋形剂一起存在于药物组合物中。
20.如权利要求18所述的用途，其中所述疾病是(i)淀粉样蛋白β相关的神经变性病症；或者(ii)创伤性脑损伤、中风、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)、脊髓损伤、癌症、炎症、抑郁症、或焦虑。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述淀粉样蛋白β相关的神经变性病症是阿尔茨海默氏病。
22.一种用于治疗涉及EphA4信号转导的疾病的试剂盒，所述试剂盒包含EphA4信号转导抑制剂，其中所述抑制剂是权利要求1所述的化合物。
23.如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒包括容纳每日施用剂量的所述抑制剂的多个容器。
24.如权利要求22所述的试剂盒，其中所述抑制剂连同药学上可接受的赋形剂一起存在于药物组合物中。
25.如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒还包括说明手册。
26.如权利要求22所述的试剂盒，其中所述药物组合物被配制用于口服施用。
说明书 :
作为神经保护剂的EphA4抑制剂
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年7月17日提交的美国临时专利申请号61/847,432的优先权，该美国临时专利申请的内容出于所有目的以引用方式整体并入本文。
发明内容
[0003] 特征在于认知功能衰退的阿尔茨海默氏病(AD)已经作为突触衰竭的疾病而出现。本申请的发明人发现受体酪氨酸激酶EphA4对于介导AD中的海马体突触功能障碍来说是重要的并且特异性抑制EphA4信号转导会逆转AD小鼠模型的突触损伤。在AD转基因小鼠的海马体中观测到增强的EphA4信号转导，并且被认为促使AD中的突触丧失的可溶性淀粉样蛋白-β肽低聚物(Aβ)诱导大鼠海马体切片中的EphA4激活。阻断EphA4-配体相互作用抑制了Aβ诱导的兴奋性突触传递缺失。此外，观测到海马体的CA1区中的EphA4水平的耗竭或干扰EphA4功能会逆转对AD转基因小鼠的海马体长时程增强(LTP)的抑制。重要的是，本申请的发明人鉴定出一种小分子，即钩藤碱(Rhy)作为有效消除神经元中的EphA4依赖性信号转导的候选EphA4抑制剂。体内施用Rhy在AD小鼠模型中恢复了正常的LTP并且减轻了病变。此外，Rhy的各种化学衍生物已经被合成并且被证实与Rhy相比具有相当的或增强的作为EphA4抑制剂的活性。综上所述，本申请的发明人的发现揭示了EphA4在介导与AD相关的突触功能障碍中以及在由EphA4信号转导所引起或加重的其它神经变性病症中的先前未知的作用。这些发现表明一种用于治疗具有这种性质的疾病的新型治疗方法。
[0004] 在第一个方面，本发明提供了一种用于治疗由EphA4信号转导，特别是在过度激活的EphA4信号转导的情况下所引起或加重的疾病或病况的新型方法。包括神经变性病症在内的各种疾病和病况已知涉及过度激活的EphA4信号转导，例如淀粉样蛋白β-诱导的神经病症，如阿尔茨海默氏病、脊髓损伤、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、头部损伤(例如创伤性脑损伤)、外周神经再生、肌萎缩性侧索硬化(ALS，常常被称为卢伽雷氏病(Lou Gehrig's Disease))、中风、听觉障碍、多发性硬化、情绪障碍、各种类型的癌症。可以使用抑制EphA4信号转导的任何化合物来实现治疗这些疾病以缓解它们的症状的目的。举例来说，干扰和抑制EphA4与它的配体之间的特异性结合的化合物可以用作EphA4信号转导抑制剂并且因此可用于实现这种特定的治疗目的。往往，这种类型的抑制剂经由竞争性结合EphA4或EphA4配体来破坏和减弱EphA4与它的配体之间的结合来起作用。作为另一个实例，可以在RNA水平或蛋白质水平上抑制EphA4或它的配体的表达的化合物也可用于通过减少EphA4信号转导的方式来实现治疗这些神经变性疾病的目的。在一些情况下，已知的EphA4抑制剂，如钩藤碱(或Rhy)、KYL肽(KYLPYWPVLSSL，Murai等,Mol.CellNeurosci.2003年12月；24(4):1000-1011)、APY肽(APYCVYRRGSWSC)和VTM肽(VTMEAINLAFPG)(这两者均描述于WO2004/028551中)、Cpd1和Cpd2(Noberini等,J Biol Chem.2008年10月24日；283(43):29461-29472中所述的两种异构的2,5-二甲基吡咯基苯甲酸衍生物)可以用于实现这种治疗目的。
[0005] 钩藤碱(Rhy)描述于各种文献中，参见例如Xiong等,Hypertension Research 2013年7月；36(7):570-579；以及Zhou等,Fitoterapia 85(2013):125-129。它的化学名称是(7β,16E,20α)-16-(甲氧基亚甲基)-2-氧代柯诺辛-17-酸甲酯(methyl(7β,16E,20α)-
16-(methoxymethylene)-2-oxocorynoxan-17-oate)。它的分子式是C22H28N2O4并且它的化学式是：
16-(methoxymethylene)-2-oxocorynoxan-17-oate)。它的分子式是C22H28N2O4并且它的化学式是：
[0006]
[0007] Rhy可用作EphA4信号转导抑制剂以治疗涉及过度活跃的EphA4信号转导的疾病和病况。尽管异钩藤碱(IsoRhy)也已经被报道为表现出一定的神经保护活性的化合物，但是本申请的发明人发现IsoRhy在抑制EphA4信号转导方面是无活性的。IsoRhy因此不意图用于本发明中。
[0008] 除Rhy之外，多种其它EphA4信号转导抑制剂是已知的，例如KYL肽、APY肽、以及VTM肽(Murai等(同上))、化合物1和化合物2(Noberini等(同上))以及未聚簇的肝配蛋白-A5-Fc和EphA4-Fc(Goldshmit等,Plos One 6,e24636,2011)。另外的EphA4信号转导小分子抑制剂描述于Van Linden等,Eur.J.Med.Chem.2012,47(1):493-500；以及Parmentier-Batteur等,J.Neurochem.2011,118(6):1016-1031中。虽然在本发明的一些实施方案中，这些已知的抑制剂中的每一种由于它们作为EphA4抑制剂的共有的功能性作用而对于根据本发明的所要求保护的方法的使用来说是有效的，但是本发明的所要求保护的方法中所使用的EphA4信号转导抑制剂不是Rhy，而是另一种抑制剂。在一些情况下，EphA4信号转导抑制剂不是KYL肽、APL肽、或VTM肽，而是另一种抑制剂。在一些情况下，EphA4信号转导抑制剂不是Cpd1或Cpd2，而是另一种抑制剂。在一些情况下，本发明的所要求保护的方法中所使用的EphA4信号转导抑制剂是被新鉴定为EphA4抑制剂的不同于包括上文所提到的那些在内的先前已知的EphA4抑制剂中的任一种的化合物。这些新化合物包括但不限于本文所述的那些化合物，例如补骨脂异黄酮和石斛碱(描述于本公开的实施例2中)以及从Cpd1修饰的化合物(例如本公开的实施例3中所述的化合物6、14以及21)。
[0009] 这些EphA4抑制剂——无论它们是先前已知的还是新鉴定出的——均可用于实现治疗涉及过度活跃的EphA4信号转导的疾病或病况的目的，包括阿尔茨海默氏病和由淀粉样蛋白β诱导的神经毒性所引起的其它疾病。然而，为了实施本发明，先前已知的EphA4抑制剂中的任一种或任何组合在一些实施方案中可以被排除在实施范围之外。
[0010] 在第二个方面，本发明提供了新型化合物，所述新型化合物是在与Rhy相比时具有至少相当的并且往往更强效的针对EphA4信号转导的抑制活性的Rhy化学衍生物。所述新型化合物在总体上被描述为具有式I的结构
[0011]
[0012] 或其药学上可接受的盐；其中每一个R1是独立地选自由氢和烷基组成的组的成员；每一个R2是独立地选自由氢和酰基组成的组的成员；每一个Rq是独立地选自由电子对、低级烷基、烯丙基以及芳基甲基组成的组的成员；L是选自由化学键、亚烷基以及芳基亚烷基组成的组的连接基团；X选自由以下各项组成的组：化学键、-O-、-S-以及-N(R4)-；其中当L是化学键时，X也是化学键；R3选自由以下各项组成的组：氢、卤代、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、酰基、酰基烷基、(R4)2N-亚烷基以及
[0013]
[0014] 其中当L是化学键时，R3选自由以下各项组成的组：氢、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、酰基以及酰基烷基；其中当X是-O-、-S-或-N(R4)-时，R3选自由以下各项组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳酰基甲基、酰基、酰基烷基、以及(R4)2N-亚烷基；并且每一个R4独立地选自由以下各项组成的组：氢、烷基、烯基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、酰基、以及酰基甲基。一般来说，这些Rhy衍生物不是Rhy本身或其盐。这些Rhy衍生物的示例性化合物提供于表1-3中。通常首先合成可用于实现治疗涉及过度活跃的EphA4信号转导的疾病和病况的目的的Rhy化学衍生物，然后在相关的研究领域已知的或本文所述的一种或多种功能测定(例如肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定、EphA4依赖性生长锥塌陷测定，或进一步在APP/PS1和APP突变小鼠模型中)中对它们进行测试以验证它们针对EphA4信号转导的抑制活性以及治疗诸如阿尔茨海默氏病的病况的治疗功效。
[0015] 此外，本发明还提供了可用于实现治疗涉及过度活跃的EphA4信号转导的疾病或病况，特别是涉及斑块或聚集体形成的那些疾病或病况(例如淀粉样蛋白β相关的神经变性病症，如阿尔茨海默氏病)的目的的药物组合物，所述疾病或病况包括但不限于上文所提到的疾病和病况。除了阿尔茨海默氏病之外，包含EphA4信号转导抑制剂(包括本文所公开的Rhy衍生物)的药物组合物还可以用于治疗诸如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、中风、癌症、以及脊髓损伤的疾病和病症，它们全部均具有由EphA4所介导的过度活跃的或过度的细胞信号转导的组成部分。淀粉样蛋白β相关的神经变性病症是其中淀粉样蛋白斑块的存在促使病症发作和/或进展的一种变性神经病症。这样的病症的一个实例是阿尔茨海默氏病。在本发明的一些实施方案中，如常规上所定义的运动神经元病症被排除在“淀粉样蛋白β相关的神经变性病症”的类别以外。
[0016] 所述组合物通常包含作为活性成分的EphA4信号转导抑制剂以及药学上或生理学上可接受的赋形剂。常常，针对向需要这种治疗的患者的优选的递送方式，例如口服施用或注射来配制EphA4抑制剂。此外，由于诸如补骨脂异黄酮和石斛碱之类的EphA4抑制剂存在于某些药用植物中，因此可以直接使用这些含有包括一种或多种EphA4抑制剂在内的活性成分的植物的提取物以实现如本文所述的治疗目的。
[0017] 在一些实施方案中，所述组合物包含EphA4抑制剂，所述EphA4抑制剂是Rhy的新型化学衍生物，例如本申请的权利要求书中所述的化学衍生物或表1-3中所提供的化学衍生物。本文所述的EphA4抑制剂因此可以用于制造意图用于治疗涉及过度活跃的EphA4信号转导的疾病和病况的药物，所述疾病和病况包括但不限于阿尔茨海默氏病、ALS、帕金森氏病、创伤性脑损伤、中风、癌症以及脊髓损伤。
[0018] 在第三个方面，本发明提供了一种经由鉴定新的先前未知的EphA4信号转导抑制剂来鉴定可以用作用于治疗神经变性疾病(特别是淀粉样蛋白β相关的神经变性病症，如阿尔茨海默氏病)的治疗剂的化合物的方法。在一些情况下，测试候选化合物干扰，并且因此减少EphA4与它的配体(例如肝配蛋白)之间的结合的能力。潜在地，抑制剂可以是具有任何化学性质的分子，包括小分子、大分子(如多肽和多核苷酸)等。通常，首先将针对干扰EphA4-配体结合的能力加以测试的候选化合物放置在其中存在EphA4和它的配体这两者的环境中以及允许EphA4与它的配体之间进行特异性结合的条件下。然后测定在所述候选化合物存在下EphA4与配体之间的结合水平，并且与在除了不存在候选化合物以外相同的条件下EphA4与它的配体之间的结合水平(换句话说，EphA4与配体的“对照结合水平”)相比较。如果EphA4-配体结合水平比对照结合水平低例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至更高，那么EphA4与它的配体之间的结合被认为“受到抑制”并且所述候选化合物至少初步被认为是EphA4信号转导抑制剂。任选地，进行进一步测试的另外的步骤以验证化合物通过抑制EphA4信号转导提供神经保护的功能。
举例来说，可以使用动物模型，如本申请中所述的AD小鼠模型APP/PS1来验证能够干扰EphA4-配体结合的化合物是否有改善由淀粉样蛋白斑块所抑制的海马体突触可塑性、以及改善AD病理学的某些特征，例如减少皮层和海马体中的淀粉样蛋白斑块的作用。
举例来说，可以使用动物模型，如本申请中所述的AD小鼠模型APP/PS1来验证能够干扰EphA4-配体结合的化合物是否有改善由淀粉样蛋白斑块所抑制的海马体突触可塑性、以及改善AD病理学的某些特征，例如减少皮层和海马体中的淀粉样蛋白斑块的作用。
[0019] 如本公开中所述，为了筛选小分子EphA4抑制剂，常常首先使用小分子文库进行分子对接分析。选择被预测会与EphA4结合的小分子。在替代方案中，可以首先针对在基于细胞的或无细胞的结合测定形式中，常常在相对于EphA4的天然配体(如肝配蛋白)的竞争中特异性结合EphA4的能力对小分子进行筛选和选择。然后在细胞模型和动物模型中测试这些所选择的小分子抑制EphA4的能力。使用培养的海马体神经元测试候选小分子(通常以1μM至10μM)抑制EphA4依赖性生长锥塌陷的能力。当小分子在EphA4依赖性生长锥塌陷测定时以剂量依赖性方式显示出抑制作用时，使用蛋白质印迹分析研究这些小分子在培养的皮层神经元中阻断EphA4的肝配蛋白-A依赖性自体磷酸化(它反映了受体的激活状态)的能力。在细胞测定中证实这些小分子是EphA4抑制剂之后，然后进行进一步测试以确定这些小分子是否能够逆转急性器官型海马体切片中淀粉样蛋白β诱导的长时程增强(LTP；突触可塑性的形式)减少。当结果是阳性时，向AD小鼠模型(例如APP/PS1和APP突变小鼠模型)经口施用这些小分子。评估所述小分子在这些AD小鼠模型中是否可以逆转对LTP的抑制并且减少病理特征(淀粉样蛋白β沉积、星形胶质细胞增生以及小胶质细胞增生)。此外，进行生物化学分析以证实小分子直接与EphA4的细胞外域结合，但不与Eph家族的其它成员结合。可以遵循相同的或类似的筛选方法以鉴定具有任何化学性质的EhpA4抑制剂。
[0020] 另一种类型的EphA4信号转导抑制剂通过抑制EphA4或它的配体的表达而起作用，并且这种抑制可以是在RNA水平和/或蛋白质水平上。许多分子可以落入这一类别中，例如特异性靶向EphA4转录物(或EphA4配体的转录物)以促进降解的反义寡核苷酸、微小RNA、或抗体可以是有效的EphA4信号转导抑制剂。可以通过暴露于表达EphA4(或它的配体)的细胞针对EphA4(或它的配体)的任何减少对所提出的具有这种性质的抑制剂进行测试。此外，这样的减少是在与在相同的条件下，但是在不存在所提出的抑制剂的情况下EphA4(或它的配体)的表达水平相比时减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至更高。在检测到EphA4(或它的配体)表达减少之后，可以上文所述的相同方式进一步测试所提出的抑制剂以验证它的神经保护活性。
[0021] 在第四个方面，本发明提供了一种用于治疗由EphA4信号转导，例如淀粉样蛋白β诱导的神经毒性所引起或加重的疾病或病症(如阿尔茨海默氏病)的试剂盒。所述试剂盒含有一种或多种EphA4信号转导抑制剂，如经由破坏EphA4-配体结合或经由抑制EphA4或配体表达(例如在RNA水平或蛋白质水平上)。所述试剂盒常常包括多个容器，它们中的每一个容纳每日施用剂量的EphA4信号转导抑制剂，以使得所述试剂盒可以提供由患者在一定的时间段期间每天使用的抑制剂。在一些情况下，所述抑制剂被配制成适合于口服施用、或注射，如静脉内注射、皮下注射或肌内注射的药物组合物。任选地，在试剂盒中还提供了在抑制剂的施用方面指导使用者的说明手册。
附图说明
[0022] 图1：Aβ刺激EphA4信号转导的激活。(a和b)在3个月和6个月时野生型小鼠和APP/PS1小鼠的海马体突触体部分中Tyr602EphA4磷酸化(P-Tyr602EphA4)和总EphA4水平的蛋白质印迹。野生型小鼠和APP/PS1小鼠中相对于EphA4蛋白归一化的P-Tyr602EphA4的定量(*p<0.01，单因素方差分析(one-way ANOVA)，斯图登氏纽曼检验(Student's Newman test)；所有条件的n＝4，除了3个月大的野生型小鼠的n＝3)。(c-f)Aβ增加了EphA4酪氨酸磷酸化。(c、d)将急性大鼠海马体切片用20nM、100nM或500nM的Aβ处理2小时或用500nM的Aβ处理如所示的不同时间段(e、f)。使EphA4从总裂解物中免疫沉淀，然后针对P-TyrEphA4进行蛋白质印迹。(d、f)相对于EphA4归一化的在Aβ处理后P-TyrEphA4的定量，(d)与0nM相比，*p<0.05，单因素方差分析，斯图登氏纽曼检验；0nM的n＝6，20nM和100nM的n＝5，500nM的n＝7。(f)与0小时相比，**p<0.05，单因素方差分析，斯图登氏纽曼检验；n＝3。(g、h)Aβ增加了EphA4聚簇体的数目。将培养的海马体神经元(25-28DIV)用Aβ处理4小时。Aβ增加了EphA4聚簇(将突触后区域用PSD-95抗体染色)。代表性图像(g)。比例尺＝10μm。EphA4或PSD-95聚簇体的定量分析(h)(***p<0.001，斯图登氏t检验)。(i、j)阻断EphA4-配体相互作用消除了Aβ刺激的EphA4激活。将急性大鼠海马体切片用KYL肽预处理0.5小时，继而用Aβ处理2小时。(i)使EphA4进行免疫沉淀并且针对P-TyrEphA4进行蛋白质印迹分析。(j)示出了*EphA4激活的变化倍数(P-TyrEphA4/EphA4；右图)。p<0.01；单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验(Student-Newman-Keuls test)(n＝3)。
[0023] 图2：阻断EphA4-配体相互作用预防了Aβ介导的神经传递损伤。(a、b)EphA4抑制剂KYL肽削弱了海马体神经元(24-26DIV)中由Aβ触发的树突棘减少。代表性图像(a)。比例尺＝10μm。树突棘密度的定量分析(b)，***p<0.001；两因素方差分析，继而是邦费罗尼事后检验(Bonferroni post-test)(n＝15-20个神经元)。(c-e)阻断了内源性EphA4与它的配体肝配蛋白之间的相互作用的未聚簇的EphA4-Fc解除了Aβ触发的mEPSC事件间期延长。(c)在未聚簇的EphA4-Fc或Fc对照存在下来自Aβ刺激的神经元的代表性mEPSC迹线。(d)mEPSC事件间期的累积概率分布。(e)来自(d)的数据的平均值±SEM(mEPSC事件间期：Fc＝445.5±8.8ms，Fc+Aβ＝619.4±14.3ms，EphA4＝500.4±9.8ms，EphA4+Aβ＝478.5±9.8ms；在每一***
种条件下由至少3次实验对≥39个神经元进行记录)。Aβ相比于对照， p<0.001；与单独的Aβ相比，###p<0.001，单因素方差分析和克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)。(f-h)EphA4(Cpd1)和Cdk5(Ros)的小分子抑制剂阻止了Aβ诱导的事件间期延长。(f)在存在或不存在Cpd1(500μM)或Ros(10μM)的情况下来自Aβ刺激的神经元的代表性mEPSC。(g)mEPSC事件间期的累积概率分布。(h)来自(g)的数据的平均值±SEM(mEPSC事件间期：对照＝
454.1±12.5ms，Aβ＝818.1±28.2ms，Cpd1＝559.5±16.6ms，Cpd1+Aβ＝542.6±15.4ms，Ros＝451.0+11.2ms，Ros+Aβ＝494.1±11.7ms；来自至少3次实验的≥22个神经元)。Aβ相比于对照，***p<0.001；与单独的Aβ相比，###p<0.001，单因素方差分析和克鲁斯凯-沃利斯检验。
种条件下由至少3次实验对≥39个神经元进行记录)。Aβ相比于对照， p<0.001；与单独的Aβ相比，###p<0.001，单因素方差分析和克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)。(f-h)EphA4(Cpd1)和Cdk5(Ros)的小分子抑制剂阻止了Aβ诱导的事件间期延长。(f)在存在或不存在Cpd1(500μM)或Ros(10μM)的情况下来自Aβ刺激的神经元的代表性mEPSC。(g)mEPSC事件间期的累积概率分布。(h)来自(g)的数据的平均值±SEM(mEPSC事件间期：对照＝
454.1±12.5ms，Aβ＝818.1±28.2ms，Cpd1＝559.5±16.6ms，Cpd1+Aβ＝542.6±15.4ms，Ros＝451.0+11.2ms，Ros+Aβ＝494.1±11.7ms；来自至少3次实验的≥22个神经元)。Aβ相比于对照，***p<0.001；与单独的Aβ相比，###p<0.001，单因素方差分析和克鲁斯凯-沃利斯检验。
[0024] 图3：阻断EphA4信号转导解除了Aβ诱导的海马体LTP损伤。(a-d)阻断EphA4-配体相互作用解除了Aβ诱导的LTP减少。将急性海马体切片在EphA4抑制剂，即未聚簇的EphA4-Fc[10μg/mL；(a、b)]或KYL肽[100μM；(c，d)]存在下，用Aβ处理2小时。随后通过HFS诱导谢弗侧支通路(Schaffer-collateral pathway)的CA1中的LTP。(a、c)点表示相对于基线值归一化的fEPSP的平均斜率(平均值±SEM)。示出了在LTP诱导(箭头)之前5分钟(1)和在LTP诱导之后50分钟(2)时的迹线记录。插图中的迹线是在HFS之前(灰色)和之后(黑色)所记录的示例性fEPSP。水平条：5ms；垂直条：0.5mV。(b、d)在LTP诱导之后记录的最后10分钟内求平均的平均fEPSP斜率的定量(平均值±SEM)。对于EphA4-Fc共处理：对照＝169.2％±9.6％，n＝5个脑，10个切片；Aβ＝122.0％±6.1％，n＝5个脑，9个切片；EphA4-Fc＝155.7％±5.4％，n＝6个脑，10个切片；EphA4-Fc+Aβ＝155.0％±6.2％，n＝5个脑，10个切片。对于KYL共处理：对照＝169％±6.72％，n＝6个脑，10个切片；Aβ＝132％±6.06％，n＝6个脑，11个切片；KYL＝164.6％±5.7％，n＝6个脑，11个切片；KYL+Aβ＝174.9％±9.0％，n＝6个脑，11个切片。Aβ相比于对照，**p<0.01，***p<0.001，两因素方差分析，继而是邦费罗尼事后检验；
与单独的Aβ相比，##p<0.01，###p<0.001，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。
(e-h)阻断EphA4信号转导解除了APP/PS1突变小鼠的LTP损伤。(e、f)使用渗透泵向野生型小鼠和APP/PS1突变小鼠输注KYL，并且随后通过HFS诱导海马体的谢弗侧支通路的CA1中的LTP。(g、h)向野生型小鼠和APP/PS1突变小鼠的海马体注射EphA4-shRNA(shEphA4)或GFP病毒(GFP)，并且随后在注射后的3周-4周时通过HFS诱导CA3-CA1的LTP。(e、g)相对于基线归一化的fEPSP的平均斜率(平均值±SEM)。示出了在LTP诱导(箭头)之前5分钟(1)和在LTP诱导之后50分钟(2)时的迹线记录。插图中的迹线是在HFS之前(灰色)和之后(黑色)所记录的示例性fEPSP。水平条：5ms；垂直条：0.5mV。(f、h)在LTP诱导后记录的最后10分钟的平均fEPSP斜率的定量(平均值±SEM)(f)WT，Con＝191.8％±9.5％，n＝6个脑，9个切片；WT，KYL＝190.1％±6.9％，n＝6个脑，16个切片；Tg，Con＝154.0％±8.2％，n＝6个脑，11个切片；
Tg，KYL＝181.9％±8.6％，n＝6个脑，9个切片。在Con条件下Tg相比于WT，*p<0.05；Tg小鼠的KYL相比于Con，#p<0.05，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。(h)WT，GFP＝198.0％±17.94％，n＝6个脑，12个切片；WT，shEphA4＝186％±31.85％，n＝6个脑，11个切片；Tg，GFP＝146.3％±17.14％，n＝11个脑，27个切片；Tg，shEphA4＝164.7％±
23.62％，n＝7个脑，14个切片；在GFP条件下Tg相比于WT，***p<0.001；Tg小鼠的shEphA4相比于GFP，#p<0.05，两因素方差分析和邦费罗尼事后检验。
与单独的Aβ相比，##p<0.01，###p<0.001，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。
(e-h)阻断EphA4信号转导解除了APP/PS1突变小鼠的LTP损伤。(e、f)使用渗透泵向野生型小鼠和APP/PS1突变小鼠输注KYL，并且随后通过HFS诱导海马体的谢弗侧支通路的CA1中的LTP。(g、h)向野生型小鼠和APP/PS1突变小鼠的海马体注射EphA4-shRNA(shEphA4)或GFP病毒(GFP)，并且随后在注射后的3周-4周时通过HFS诱导CA3-CA1的LTP。(e、g)相对于基线归一化的fEPSP的平均斜率(平均值±SEM)。示出了在LTP诱导(箭头)之前5分钟(1)和在LTP诱导之后50分钟(2)时的迹线记录。插图中的迹线是在HFS之前(灰色)和之后(黑色)所记录的示例性fEPSP。水平条：5ms；垂直条：0.5mV。(f、h)在LTP诱导后记录的最后10分钟的平均fEPSP斜率的定量(平均值±SEM)(f)WT，Con＝191.8％±9.5％，n＝6个脑，9个切片；WT，KYL＝190.1％±6.9％，n＝6个脑，16个切片；Tg，Con＝154.0％±8.2％，n＝6个脑，11个切片；
Tg，KYL＝181.9％±8.6％，n＝6个脑，9个切片。在Con条件下Tg相比于WT，*p<0.05；Tg小鼠的KYL相比于Con，#p<0.05，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。(h)WT，GFP＝198.0％±17.94％，n＝6个脑，12个切片；WT，shEphA4＝186％±31.85％，n＝6个脑，11个切片；Tg，GFP＝146.3％±17.14％，n＝11个脑，27个切片；Tg，shEphA4＝164.7％±
23.62％，n＝7个脑，14个切片；在GFP条件下Tg相比于WT，***p<0.001；Tg小鼠的shEphA4相比于GFP，#p<0.05，两因素方差分析和邦费罗尼事后检验。
[0025] 图4：小分子Rhy是一种新型的EphA4抑制剂。(a)在与EphA4的复合体中Rhy的对接构象。EphA4的配体结合域(绿色)以表面表示示出，而Rhy被示为棒状物(青蓝色)。Rhy的氧原子、氮原子以及胺氢原子的颜色分别是红色、蓝色以及白色。EphA4上与Rhy形成显著的疏水性相互作用的四个残基是：D-E环中的Ile59(橙色)、I-J环中的Phe154(红色)、K中的Leu166以及Mβ-链中的Val195(黄色)。此外，Rhy的醚键处的羰基和甲氧基氧原子与EphA4在Jβ-链和J-K环内的Asp158(约 )和Arg162(约 )处形成两个强氢键(紫色)。(b)Rhy特异性结合EphA4。Rhy结合EphA4的细胞外域，但不结合EphB2的细胞外域。用生物素化的Rhy联同链霉亲和素珠粒对重组EphA4-Fc或EphB2-Fc蛋白进行的体外沉降测定(将实验重复三次)。(c、d)Rhy抑制Eph-肝配蛋白-A相互作用和EphA4酪氨酸磷酸化。(c)Rhy减少了肝配蛋白-A1与HT22细胞表面的结合。将HT-22细胞与Rhy或KYL一起预孵育10分钟，之后用生物素化的肝配蛋白-A1(A1；0.5μg/mL)处理。在HT-22细胞表面上生物素化的肝配蛋白-A1聚簇体的定量分析。**p<0.01，***p<0.001，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。(d)将皮层神经元(6DIV)与Rhy一起预孵育30分钟，之后用肝配蛋白-A1处理30分钟。收集裂解物并且使用EphA4抗体进行免疫沉淀。针对P-Tyr进行的蛋白质印迹分析。(e)以平均值±SEM的形式呈现定量分析数据(**p<0.01，斯图登氏t检验，n＝5)。(f、g)Rhy抑制了EphA4依赖性信号***
转导和细胞功能。(f)Rhy的存在消除了肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇(A1)。与Fc相比， p<
0.005；与A1相比，##p<0.01，###p<0.001，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。
(g)Rhy抑制了肝配蛋白-A1刺激的生长锥塌陷(平均值±SEM，来自至少3次实验的>150个神经元)。在不同的条件下A1相比于Fc，*p<0.05，***p<0.001，两因素方差分析，继而是邦费罗# ## ###
尼事后检验；与对照条件下的A1相比，p<0.05，p<0.01， p<0.001，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。类似于Rhy，Cpd1也抑制了肝配蛋白-A1刺激的生长锥塌陷，但是在超过10μM的浓度下抑制的(数据未示)。
转导和细胞功能。(f)Rhy的存在消除了肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇(A1)。与Fc相比， p<
0.005；与A1相比，##p<0.01，###p<0.001，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。
(g)Rhy抑制了肝配蛋白-A1刺激的生长锥塌陷(平均值±SEM，来自至少3次实验的>150个神经元)。在不同的条件下A1相比于Fc，*p<0.05，***p<0.001，两因素方差分析，继而是邦费罗# ## ###
尼事后检验；与对照条件下的A1相比，p<0.05，p<0.01， p<0.001，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。类似于Rhy，Cpd1也抑制了肝配蛋白-A1刺激的生长锥塌陷，但是在超过10μM的浓度下抑制的(数据未示)。
[0026] 图5：Rhy解除了AD小鼠中由Aβ诱导的神经传递缺失和LTP抑制。(a-c)用Rhy(10μM)进行的预处理消除了Aβ诱导的神经传递减少。在10μM Rhy存在下将海马体神经元用Aβ处理。(a)代表性mEPSC迹线。(b)累积mEPSC事件间期分布。(c)来自(b)的数据的平均值±SEM(mEPSC事件间期：对照＝312.9±7.8ms，Aβ＝897.4±43.4ms，Rhy＝512.2±13.6ms，Rhy+Aβ＝420.6±9.6ms；在每一种条件下由至少3次实验所记录的≥17个神经元)。Aβ相比于对照，***p<0.001；与单独的Aβ相比，###p<0.001，单因素方差分析，继而是克鲁斯凯-沃利斯检验。(d、e)Rhy阻止了Aβ诱导的对LTP的抑制。在Rhy(30μM)存在下将急性海马体切片用Aβ处理，并且通过HFS诱导谢弗侧支通路的CA1中的LTP。(d)相对于基线归一化的fEPSP的平均斜率(平均值±SEM)。示出了在LTP诱导(箭头)之前5分钟(1)和在LTP诱导之后50分钟(2)时的迹线记录。(e)在LTP诱导后记录的最后10分钟期间平均fEPSP斜率的定量(平均值±SEM)；对照＝172.7％±7.5％，n＝6个脑，10个切片；Aβ＝131.1％±3.9％，n＝6个脑，11个切片；
Rhy＝168.1％±6.0％，n＝6个脑，12个切片；Rhy+Aβ＝174.1％±9.8％，n＝6个脑，10个切片。Aβ相比于对照，***p<0.001，两因素方差分析，继而是邦费罗尼事后检验；与单独的Aβ相比，###p<0.001；单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。(f、g)Rhy解除了APP/PS1突变小鼠的LTP损伤。向野生型小鼠和APP/PS1突变小鼠经口施用Rhy(50毫克·公斤-1·天-1)，持续3周，并且通过HFS诱导海马体的谢弗侧支通路的CA1中的LTP。(f)相对于基线归一化的fEPSP的平均斜率(平均值±SEM)。示出了在LTP诱导(箭头)之前5分钟(1)和在LTP诱导之后50分钟(2)时的迹线记录。(g)在LTP诱导后记录的最后10分钟期间平均fEPSP斜率的定量(平均值±SEM)；WT，对照＝194.0％±7.0％，n＝7个脑，11个切片；WT，Rhy＝180.5％±
7.7％，n＝7个脑，12个切片；Tg，对照＝147.6％±3.5％，n＝7个脑，8个切片；Tg，Rhy＝
198.1％±8.9％，n＝6个脑，11个切片。WT相比于Tg，***p<0.001；对照相比于Rhy，###p<
0.001，两因素方差分析，继而是邦费罗尼事后检验。(d、g)插图中的迹线是在HFS之前(灰色)和之后(黑色)记录的示例性场兴奋性突触后电位(fEPSP)。水平条：5ms；垂直条：0.5mV。
Rhy＝168.1％±6.0％，n＝6个脑，12个切片；Rhy+Aβ＝174.1％±9.8％，n＝6个脑，10个切片。Aβ相比于对照，***p<0.001，两因素方差分析，继而是邦费罗尼事后检验；与单独的Aβ相比，###p<0.001；单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。(f、g)Rhy解除了APP/PS1突变小鼠的LTP损伤。向野生型小鼠和APP/PS1突变小鼠经口施用Rhy(50毫克·公斤-1·天-1)，持续3周，并且通过HFS诱导海马体的谢弗侧支通路的CA1中的LTP。(f)相对于基线归一化的fEPSP的平均斜率(平均值±SEM)。示出了在LTP诱导(箭头)之前5分钟(1)和在LTP诱导之后50分钟(2)时的迹线记录。(g)在LTP诱导后记录的最后10分钟期间平均fEPSP斜率的定量(平均值±SEM)；WT，对照＝194.0％±7.0％，n＝7个脑，11个切片；WT，Rhy＝180.5％±
7.7％，n＝7个脑，12个切片；Tg，对照＝147.6％±3.5％，n＝7个脑，8个切片；Tg，Rhy＝
198.1％±8.9％，n＝6个脑，11个切片。WT相比于Tg，***p<0.001；对照相比于Rhy，###p<
0.001，两因素方差分析，继而是邦费罗尼事后检验。(d、g)插图中的迹线是在HFS之前(灰色)和之后(黑色)记录的示例性场兴奋性突触后电位(fEPSP)。水平条：5ms；垂直条：0.5mV。
[0027] 图6：Rhy施用使得淀粉样蛋白斑块沉积和小神经胶质激活减少。(a-c)在接受Rhy施用约10周之后(在7.5-8个月大时)APP/PS1小鼠的淀粉样蛋白斑块沉积的DAB染色。(a)代表性图像。比例尺＝1mm。(b和c)在皮层和海马体中由Aβ染色(淀粉样蛋白斑块沉积)所覆盖的总面积的数量和百分比的定量(每一个脑>4个切片，n＝4个脑)。以平均值±SEM的形式呈现数据，***p<0.001，**p<0.01，斯图登氏t检验。(d-h)将接受Rhy施用的APP/PS1小鼠的小鼠脑切片用针对β-淀粉样蛋白(红色；针对淀粉样蛋白斑块沉积)和Iba-1(绿色；针对小神经胶质激活)的抗体共免疫染色。(d)相应皮层区域的代表性图像。比例尺＝100μm。(e-g)定量分析。由Iba1染色所覆盖的面积的百分比(e)、斑块相关的Iba1染色的面积(f)以及强度(g)(每一个脑>2个切片，n＝3个脑)。以平均值±SEM的形式呈现数据，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，斯图登氏t检验。
[0028] 图7：在小鼠脑中EphA4酪氨酸磷酸化的发育表达。(a和b)在小鼠脑发育的不同阶段，Tyr602EphA4磷酸化(P-Tyr602EphA4)和总EphA4水平的蛋白质印迹。(b)相对于EphA4蛋白归一化的P-Tyr602的定量(与3个月大的脑相比)，n＝3；*p<0.05，单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。
[0029] 图8：Aβ对Cdk5激酶活性的影响。将培养的皮层神经元(16DIV)用Aβ处理如所示的各个持续时间。使Cdk5蛋白质从皮层裂解物中进行免疫沉淀并且使用组蛋白H1蛋白作为底物进行激酶测定。底图：激酶活性的变化倍数。与0小时相比，**p<0.01；斯图登氏t检验(n＝3)。
[0030] 图9：Aβ刺激在EphA4-/-海马体神经元中mEPSC频率的减少方面的影响。在培养的来自EphA4-/-小鼠和同窝对照(EphA4+/+)的海马体神经元(24-27DIV)中，在Aβ存在下记录mEPSC，持续24小时。以Aβ处理组与未处理组(Con)的mEPSC频率的比率的形式呈现数据。平均值±SEM；WT＝0.571±0.117，KO＝0.931±0.188，n≥50个神经元，来自6个脑。**p<0.01，斯图登氏t检验。
[0031] 图10：Rhy抑制肝配蛋白-A1的细胞结合。将HT-22细胞与Rhy(300μM)或KYL(100μM)一起预孵育10分钟，之后在冰上用0.5μg/mL的生物素化的肝配蛋白-A1(A1)处理45分钟。比例尺＝10μm。
[0032] 图11：Rhy消除了肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇。将培养的海马体神经元(3DIV)用聚簇的肝配蛋白-A1(A1)和如所示的不同浓度的Rhy或KYL(100μM)共处理，继而针对EphA4和τ-1染色。示出了代表性图像。比例尺＝10μm。
[0033] 图12：Rhy解除了Tg2576突变小鼠的LTP损伤。向野生型小鼠和Tg2576突变小鼠经口施用Rhy(20或50毫克·公斤-1·天-1)，持续3周，并且随后通过HFS诱导海马体的谢弗侧支通路的CA1中的LTP。(a)相对于基线归一化的fEPSP的平均斜率(平均值±SEM)。示出了在LTP诱导之前5分钟(1)和在LTP诱导之后50分钟(2)时的迹线记录。插图中的迹线是在HFS之前(灰色)和之后(黑色)记录的示例性场兴奋性突触后电位(fEPSP)。水平条：5ms；垂直条：0.5mV。(b)在LTP诱导之后记录的最后10分钟的平均fEPSP斜率的定量(平均值±SEM)；WT，Con＝170.1％±9.7％，n＝3个脑，6个切片；WT，20Rhy＝167.3％±5.2％，n＝2个脑，4个切片；WT，50Rhy＝156.2％±8.5％，n＝3个脑，5个切片；Tg，Con＝119.0％±3.7％，n＝3个脑，
6个切片；Tg，20Rhy＝161.9％±2.9％，n＝2个脑，3个切片；Tg，50Rhy＝159.7％±17.9％，n*
＝3个脑，4个切片。p<0.05；单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。
6个切片；Tg，20Rhy＝161.9％±2.9％，n＝2个脑，3个切片；Tg，50Rhy＝159.7％±17.9％，n*
＝3个脑，4个切片。p<0.05；单因素方差分析，继而是斯图登-纽曼-柯尔斯检验。
[0034] 图13：补骨脂异黄酮和石斛碱表现出EphA4抑制活性。小分子抑制作用是通过它们抑制肝配蛋白-A1刺激的生长锥塌陷的能力来表明的。
[0035] 图14：Cpd1(2-羟基-4-(2,5-二甲基-1-吡咯基)苯甲酸)化学衍生物：化合物6、14以及21。
[0036] 图15：cpd1的衍生物：化合物6、14、以及21对EphA4信号转导表现出抑制作用。通过化合物抑制EphA4在暴露于肝配蛋白A1后的酪氨酸磷酸化的能力来表明抑制作用。
[0037] 图16：通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，钩藤碱(Rhy)和补骨脂异黄酮(Cory)抑制肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体。
[0038] 图17：新型化合物RHY-26和RHY-37在EphA4抑制方面表现出更强效的作用。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，新型化合物RHY-26和RHY-37的效能是Rhy的5倍和12倍。
[0039] 图18：新型化合物RHY-26表现出强效的EphA4抑制作用。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，新型化合物RHY-26将EphA4聚簇体显著减少了约80％。
[0040] 图19：新型化合物RHY-39、RHY-43、RHY-37以及RHY-56在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，被在Rhy的N1处由亚甲基(n个)连接的3,4-二甲氧基-苯氧基修饰的新型化合物在与Rhy相比时显著地减少了EphA4聚簇体。
[0041] 图20：新型化合物RHY-38、RHY-36、RHY-57在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，被在Rhy的N1处由亚甲基(n个)连接的二甲氧基苯甲酸酯修饰的新型化合物在与Rhy相比时显著地减少了EphA4聚簇体。
[0042] 图21：新型化合物RHY-54和RHY-60在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，被在Rhy的N1处由亚甲基(n个)连接的羟基-苯氧基修饰的新型化合物在与Rhy相比时显著地减少了EphA4聚簇体。
[0043] 图22：新型化合物RHY-40、RHY-45、RHY-50以及RHY-59在EphA4抑制方面比Rhy表现出更高的效能。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，被由亚甲基(n个)与Rhy的N1位点连接的甲氧基-硝基苯甲酸酯或甲氧基-苯基丙烯酸修饰的新型化合物在与Rhy相比时显著地减少了EphA4聚簇体。
[0044] 图23：新型化合物RHY-42、RHY-44、RHY-49以及RHY-55在EphA4抑制方面表现出更高的效能。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，被在Rhy的N1处由亚甲基连接的苯甲氧基-苯氧基修饰的新型化合物在与Rhy相比时显著地减少了EphA4聚簇体。
[0045] 图24：新型化合物RHY-23、27、RHY-35、RHY-34、RHY-31在EphA4抑制方面表现出更高的效能。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，被在Rhy的N1处由亚甲基(n个)连接的溴基修饰的新型化合物在与Rhy相比时减少了EphA4聚簇体。
[0046] 图25：新型化合物RHY-41、46以及47在EphA4抑制方面表现出更高的效能。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，被在Rhy的N1处由亚甲基连接的吡咯烷-1-基-乙氨基或咪唑-1-基-丙氨基修饰的新型化合物在与Rhy相比时显著地减少了EphA4聚簇体。
[0047] 图26：新型化合物RHY-32在EphA4抑制方面表现出更高的效能。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，被在Rhy的N1处由亚甲基连接的氨基-己基氨基修饰的新型化合物在与Rhy相比时显著地减少了EphA4聚簇体。
[0048] 图27：新型化合物RHY-51在EphA4抑制方面比Rhy表现出更高的效能。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，具有在Rhy的N1处由亚甲基连接的碘-苯甲酸酯或碘-溴-苯甲酸酯的新型化合物在与Rhy相比时显著地减少了EphA4聚簇体。
[0049] 图28：所有化合物均对EphA4聚簇体的形成显示出抑制作用。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，新型化合物RHY-10、RHY-28、RHY-9、RHY-19、RHY-5、RHY-17与Rhy相比显著地减少了EphA4聚簇体。
[0050] 图29：所有化合物均对EphA4聚簇体的形成显示出抑制作用。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例，新型化合物RHY-13、RHY-6、RHY-1以及RHY-7与Rhy相比显著地减少了EphA4聚簇体。
[0051] 图30A：Rhy在小鼠血清中在将血清孵育6小时之后保持相对稳定。通过UPLC-MS/MS分析检测Rhy。数据被表示为在各个时间点所检测到的Rhy与在t0时的值相比的百分比(平均值±SEM；n＝4只小鼠)。图30B：在经口施用后在小鼠血浆和脑中Rhy的药物代谢动力学。数据被表示为在施用后在血浆(ng/mL)或每个脑中Rhy的量(平均值±SEM)。在单次施用后在不同的时间点采集血液和灌注的全脑，每个时间点n＝6只动物(11个时间点)。图30C：Rhy在小鼠脑和血浆中的药物代谢动力学参数。
[0052] 图31：补骨脂异黄酮解除了APP/PS1突变小鼠的LTP损伤。向野生型小鼠和APP/PS1突变(Tg)小鼠经口施用补骨脂异黄酮(50-100毫克·公斤-1·天-1)或水(对照)，持续3周，并且测量海马体的SC通路的CA1区中由HFS诱导的LTP。图表示出了相对于基线归一化的fEPSP的平均斜率(平均值±SEM)。
[0053] 图32：Rhy施用提高了APP/PS1小鼠的海马体中的成年神经发生。向APP/PS1小鼠经口施用Rhy(50mg/kg)，持续超过三个月。Rhy(R1)施用增加了APP/PS1小鼠的海马体的齿状回中Ki-67+神经祖细胞的数目。
具体实施方式
[0054] 本申请的实施例仅是以说明的方式而不是以限制的方式提供的。本领域技术人员将容易识别出多种非关键参数，这些参数可以被改变或改动以得到基本上相同或类似的结果。
[0055] A.引言
[0056] 阿尔茨海默氏病(AD)是最常见形式的痴呆并且涉及淀粉样蛋白斑块和神经原纤维缠结在脑中的积聚。认知障碍被认为是AD的早期表现，被认为可归因于突触功能的破坏。突触丧失和改变的程度与AD中的记忆缺失的严重程度相关1。由淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的蛋白水解切割所产生的可溶性淀粉样蛋白-β肽低聚物(Aβ)被认为是在AD进展期间突触
2,3
损伤的主要致病因子 。因此，逆转Aβ诱导的突触缺失被认为是治疗AD中的认知障碍的一种有前途的治疗方法4。
2,3
损伤的主要致病因子 。因此，逆转Aβ诱导的突触缺失被认为是治疗AD中的认知障碍的一种有前途的治疗方法4。
[0057] Aβ与突触部位结合5，从而导致突触丧失以及谷氨酸能突触传递减少6-8。Aβ还快速地损伤海马体中的突触可塑性，包括抑制长时程增强(LTP)2或促进长时程抑制(LTD)9，这是与学习和记忆相关的主要细胞机制。由Aβ触发的突触缺陷是由N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型和2-氨基-3-(3-羟基-5-甲基-异 唑-4-基)丙酸(AMPA)型谷氨酸受体这两者的内化和下调10-12以及兴奋性突触所位于的树突棘的减少8所介导的。鉴定出介导Aβ在AD中的突触抑制中的作用的分子靶标以及了解其细胞机制因此对于研发用于AD的治疗干预来说是关键的。有趣的是，各种细胞表面受体，如α7-烟碱型乙酰胆碱受体12、代谢型谷氨酸受体13、胰岛素受体14、以及受体酪氨酸激酶EphB215已经被报道介导Aβ在突触处的作用。
[0058] 受体酪氨酸激酶的促红细胞生成素产生肝细胞(Eph)家族对于调节突触发育和突触可塑性是重要的16-18。尽管EphB经由它与NMDA受体的相互作用促进突触发育19,20，但是主要表达于成人海马体中的EphA4充当神经传递和海马体突触可塑性的负调节因子21。EphA4由它的配体肝配蛋白激活会经由诱导受体聚簇和自体磷酸化而触发正向信号转导22。这会经由细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)依赖性RhoA激活和细胞粘附的减少而导致树突棘的回缩23-25。EphA4还引起在稳态可塑性期间突触和表面AMPA受体的去除，所述稳态可塑性是确保神经元输出在最佳范围内，从而为神经元网络提供稳定性的一种形式的可塑性26,27。有趣的是，仅有轻度认知缺陷的AD患者表现出失调的EphB和EphA4表达28。鉴于EphA4激活会引起树突棘丧失和AMPA受体丰度的减少21,27,29，这代表了构成AD中的突触功能障碍的基础的两种潜在的机制8,10，本申请的发明人已经研究了EphA4信号转导与Aβ诱导的突触衰竭之间的可能联系。
[0059] 本申请的发明人证实了EphA4介导由Aβ诱导的突触可塑性的损伤。突触后EphA4的耗竭或破坏EphA4与它的配体之间的相互作用会逆转在Aβ处理后以及在AD小鼠模型中的突触缺失。重要的是，分子对接分析从传统中药文库中将小分子钩藤碱(Rhy)鉴定为候选EphA4抑制剂。Rhy解除了AD小鼠模型中由Aβ诱导的受损的神经传递和LTP缺陷。因此，本申请的发明人的发现不仅揭示了EphA4在AD的发病中的重要作用，而且还鉴定出可以用作用于治疗AD或涉及EphA4信号转导，例如由过度的EphA4激活和信号转导所引起或加重的其它疾病/病况的治疗剂的小分子EphA4抑制剂。
[0060] B.EphA4抑制剂
[0061] 除了首次在本申请中被鉴定为EphA4抑制剂的先前已知的化合物之外，本申请的发明人还提供了新型EphA4抑制剂，例如Rhy的新型化学衍生物。这些衍生物的示例性列表呈现于表1-3中。
[0062] 首先使用Rhy作为起始物质对这些新型衍生物进行化学合成。举例来说，衍生物一般是式I的化合物：
[0063]
[0064] 或其药学上可接受的盐；其中
[0065] 每一个R1是独立地选自由氢和烷基组成的组的成员；
[0066] 每一个R2是独立地选自由氢和酰基组成的组的成员；
[0067] 每一个Rq是独立地选自由电子对、低级烷基、烯丙基以及芳基甲基组成的组的成员。
[0068] L是选自由化学键、亚烷基、以及芳基亚烷基组成的组的连接基团；
[0069] X选自由化学键、-O-、-S-以及-N(R4)-组成的组；其中当L是化学键时，X也是化学键；
[0070] R3选自由以下各项组成的组：氢、卤代、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、酰基、酰基烷基、(R4)2N-亚烷基、以及
[0071]
[0072] 其中当L是化学键时，R3选自由以下各项组成的组：氢、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、酰基以及酰基烷基；
[0073] 其中当X是-O-、-S-或-N(R4)-时，R3选自由以下各项组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳酰基甲基、酰基、酰基烷基、以及(R4)2N-亚烷基；以及[0074] 每一个R4独立地选自由以下各项组成的组：氢、烷基、烯基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、酰基以及酰基甲基。根据“衍生物”的定义，衍生物通常不是钩藤碱或其盐。
[0075] 这些衍生物的化学合成一般是通过使所选择的取代基与Rhy的主结构在N1位点处经由合适的连接基团连接而进行的。示例性合成方案提供于本公开的实施例中。由于应当了解的是，适当的连接基团长度与所得的Rhy衍生物作为EphA4抑制剂的功能有关，因此除了表1-3中所标示的示例性Rhy衍生物中所用的具体连接基团之外，在合成具有与Rhy相当的或优于Rhy的水平的针对EphA4信号转导的抑制活性的Rhy衍生物的方法中还可以使用替代性连接基团。举例来说，3-12个、5-10个、5-9个、或6-8个(例如6个或7个)碳的饱和链的连接基团在被用于将表1-3中所示的取代基连接于Rhy的N1位点处时通常有效地产生功能性Rhy衍生物。在取代基与Rhy的主结构之间提供相当的间距的替代性连接基团，例如具有至 优选地 至 更优选地 至 的长度的连接基团适用于本发明中以产生作为EphA4抑制剂的功能性Rhy衍生物。一般来说，具有不同的化学特征和结构特征的任何连接基团均可以用于合成Rhy衍生物，只要所得的衍生物是活性的EphA4抑制剂即可，这可以在相关研究领域已知的和/或本文所述的功能测定中加以验证。
[0076] 在获得Rhy的化学衍生物之后，然后在研究领域已知的或所述的一种或多种测定(例如肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定、EphA4依赖性生长锥塌陷测定)中对它针对EphA4信号转导的潜在抑制活性进行测试以进行验证。在大多数情况下，当在与在不存在候选化合物的情况下信号转导的水平相比时，在候选化合物存在下检测到EphA4介导的信号转导水平被负面影响了至少10％，优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至更高的百分比时，所述化合物被认为是抑制剂。常常进行包括Rhy作为阳性对照的功能测定。如果衍生物的抑制作用在Rhy的抑制作用的+/-10％以内，那么所述衍生物被认为与Rhy具有相当的作为EphA4抑制剂的活性。另一方面，当衍生物的抑制作用比Rhy大至少20％，例如比Rhy大至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多时，所述衍生物被认为具有与Rhy相比增强的作为EphA4抑制剂的活性。
[0077] 如本文所用的术语“一个(种)(a/an)”或“所述”不仅包括具有一个成员的方面，而且还包括具有多于一个成员的方面。举例来说，包括使用技术方案1中所阐述的化合物的治疗方法的一个实施方案将包括其中所述方法包括使用技术方案1中所阐述的两种或更多种化合物的方面。
[0078] 如本文用于修饰数值的术语“约”表示围绕该值的限定范围。如果“X”是该值，那么“约X”将表示0.9X至1.1X的值，并且更优选地，0.95X至1.05X的值。任何对“约X”的提及具体地表示至少值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、以及1.05X。因此，“约X”意图教导和提供了对例如“0.98X”的权利要求限制的书面说明支持。
[0079] 当量“X”仅允许整数值(例如“X个碳”)并且X是最多15时，“约X”表示(X-1)至(X+1)。在这种情况下，如本文所用的“约X”具体地表示至少值X、X-1以及X+1。如果X是至少16，那么0.90X和1.10X的值被四舍五入成最接近的整数值以限定范围的边界。
[0080] 当应用修饰语“约”来描述数值范围的开端时，它适用于该范围的两端。因此，“约50mg至250mg”等同于“约50mg至约250mg”。当应用“约”来描述一组值中的第一个值时，它适用于该组中的所有值。因此，“约100mg、150mg、或200mg”等同于“约100mg、约150mg、或约
200mg”。然而，当应用修饰语“约”仅描述范围的端点或仅描述该组值中后面的值时，它仅适用于该值或该范围的所述端点。因此，范围“约5至9”与“约5至约9”相同，但是范围“5至约9”则不是这样。
200mg”。然而，当应用修饰语“约”仅描述范围的端点或仅描述该组值中后面的值时，它仅适用于该值或该范围的所述端点。因此，范围“约5至9”与“约5至约9”相同，但是范围“5至约9”则不是这样。
[0081] 如本文所用的“酰基”包括如本文所定义的烷酰基、烯酰基、芳酰基、杂环酰基、杂芳酰基、或生物素基。代表性的酰基包括乙酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、烟酰基、肉桂酰基、生物素基等。
[0082] 如本文所用的“酰基烷基”包括具有酰基取代基的烷基(优选地，甲基)。代表性的酰基烷基包括苯甲酰基甲基、3-苯基丙烯酰基)甲基、(4-甲氧基苯甲酰基)甲基等。
[0083] 如本文所用的“烷酰基”包括烷基-C(O)-基团，其中该烷基如本文所定义。代表性的烷酰基包括乙酰基、乙烷酰基等。
[0084] 如本文所用的“烯酰基”包括烯基-C(O)-基团，其中该烯基如本文所定义。代表性的烯酰基包括肉桂酰基、丙烯酰基、甲基丙烯酰基、3-苯基丙烯酰基、3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰基等。
[0085] 如本文所用的“烯基”包括含有至少一个碳-碳双键的具有2个至约15个碳原子的直链或支链脂族烃基，它可以是顺式立体异构体或反式立体异构体。优选的烯基具有2个至约12个碳原子并且可以包括与烯烃共轭的芳基取代基(例如反式-2-苯基乙烯基；顺式-3-苯基丙-2-烯基；顺式-2-苯基乙烯基；反式-2-(4-甲氧基苯基)乙烯基；肉桂基)。如本文所用的“低级烯基”包括具有2个至约6个碳原子的烯基。代表性的烯基包括乙烯基、烯丙基、正丁烯基、2-丁烯基、3-甲基丁烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、癸烯基等。
[0086] 如本文所用的“亚烯基”包括含有至少一个碳-碳双键或三键的直链或支链二价碳链。优选的亚烯基在链中包括4个至约12个碳，并且更优选的亚烯基在链中包括5个至约9个、或6个、7个或8个碳。在一个方面，含有碳-碳双键的烃基是优选的。在第二个方面，含有碳-碳三键的烃基是优选的。代表性的亚烯基包括-CH＝CH-、-CH2-CH＝CH-、-C(CH3)＝CH-、-CH2CH＝CHCH2-、亚乙炔基、亚丙炔基、正亚己-2-炔基、反式-亚辛-4-烯基等。
[0087] 如本文所用的“烷氧基”包括烷基-O-基团，其中该烷基如本文所定义。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、庚氧基等。
[0088] 如本文所用的“烷氧羰基”包括酯基；即烷基-O-CO-基团，其中烷基如本文所定义。代表性的烷氧羰基包括甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基等。
[0089] 如本文所用的“烷基”包括脂族烃基，它可以是直链或支链的，在链中具有约1个至约20个碳原子。优选的烷基在链中具有1个至约12个碳原子。更优选的烷基在链中具有1个至10个或1个至6个碳原子。如本文所用的“支链”包括一个或多个低级烷基(如甲基、乙基或丙基)与直链烷基链连接。如本文所用的“低级烷基”在链中包括1个至约6个碳原子，优选地5个或6个碳原子，该链可以是直链或支链的。代表性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、以及3-戊基。
[0090] 如本文所用的“亚烷基”包括直链或支链二价碳链，该碳链在该二价链本身中具有2个至约12个碳原子。优选的亚烷基是中等范围亚烷基，所述中等范围亚烷基在二价氢链本身中具有3个至10个、3个至9个、5个至9个、或6个至8个碳原子(即3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碳中的任一种，如-CH2-基团)。在一些实施方案中，二价链中的碳原子被杂原子置换，如聚亚烷基二醇连接基团(例如-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n是1至4)中。优选地，亚烷基是直链烃。代表性的亚烷基包括1,6-亚己基、1,7-庚搭烯、1,8-辛搭烯等。
[0091] 如本文所用的“炔基”包括含有至少一个碳-碳三键的具有2个至约15个碳原子的直链或支链脂族烃基。优选的炔基具有2个至约12个碳原子。更优选的炔基含有2个至约6个碳原子。如本文所用的“低级炔基”包括具有2个至约6个碳原子的炔基。代表性的炔基包括丙炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基等。
[0092] 如本文所用的“氨基”包括式Y1Y2N-的基团，其中Y1和Y2独立地是氢、酰基、芳基或烷基；或Y1和Y2连同Y1和Y2所连接的氮一起连接形成4元至7元氮杂环基(例如哌啶基)。在一些实施方案中，当Y1和Y2独立地是氢或烷基时，可以向氮增添另外的取代基，从而产生季铵离子。代表性的氨基包括伯氨基(H2N-)、甲氨基、二甲基氨基、二乙氨基、三苯甲基氨基、吡咯烷基等。优选地，“氨基”是-NRR'基团，其中R和R'是独立地选自由H和烷基组成的组的成员。优选地，R和R'中的至少一个是H。或者，“氨基”优选地是氮杂环基(例如吡咯烷基)。
[0093] 如本文所用的“芳环”包括可以包括零个至四个选自由氧、硫、硒以及氮组成的组的杂原子的5元-12元芳族单环或稠合多环部分。示例性芳环包括苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、 唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶、萘、苯并噻唑啉、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、苯并吲哚、喹啉等。
[0094] 如本文所用的“芳酰基”包括芳基-CO-基团，其中芳基如本文所定义。代表性的芳酰基包括苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、5-甲氧基-2-硝基苯甲酰基、2-碘苯甲酰基、3,4-二甲氧基苯甲酰基、4-羟基苯甲酰基、4-(苯甲氧基)苯甲酰基、2-碘-4-溴苯甲酰基等。
[0095] 如本文所用的“芳基”包括具有6个至约14个碳原子，优选地具有6个至约10个碳原子的芳族单环或多环环系。在一个优选的实施方案中，芳基未被取代(例如苯基)或被选自下组的1个至3个取代基取代，该组包括卤代、烷基、烷氧基、芳基烷氧基、羟基、苯甲酰基、硝基等。代表性的芳基包括苯基、萘基、3,4-二甲氧基苯基、4-羟苯基、4-苯甲氧基苯基、5-甲氧基-2-硝基苯基、2-碘苯基、以及2-碘-4-溴苯基。
[0096] 如本文所用的“芳基烷基”包括具有芳基取代基的烷基。优选地，芳基烷基是芳基甲基，如苯甲基。代表性的芳基烷基包括苯甲基、2-苯基苯甲基、3-氯苯甲基、3-甲氧基苯甲基、4-叔丁基苯甲基、4-甲基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基、3-苯甲酰基苯甲基、4-溴苯甲基、4-苯甲酰基苯甲基、2,6-二氯苯甲基等。
[0097] 如本文所用的“芳基亚烷基”包括包含芳基的亚烷基链。代表性的亚芳基包括-CH2(1,4-C6H4)CH2-等。
[0098] 如本文所用的“生物素基”包括以下结构的取代基：
[0099]
[0100] 优选地，生物素基取代基与天然的生物素具有相同的立体化学。
[0101] 如本文所用的“偕位”取代基包括直接与同一个原子连接的两个或更多个取代基。实例是环己基或螺环己基环上的3,3-二甲基取代。
[0102] 如本文所用的“卤代”或“卤素”包括氟、氯、溴或碘。
[0103] 如本文所用的“杂原子”包括除碳或氢以外的原子。代表性的杂原子包括O、S以及N；优选地，O和N。杂原子的氮或硫原子任选地被氧化成相应的N-氧化物、S-氧化物(亚砜)、或S,S-二氧化物(砜)。在一个优选的方面，杂原子具有与亚烷基碳原子连接的至少两个键(例如-C1-C9亚烷基-O-C1-C9亚烷基-)。在一些实施方案中，杂原子被酰基、烷基、芳基、环烷基、杂环基、或杂芳基(例如-N(Me)-；-N(Ac)-)进一步取代。
[0104] 如本文所用的“杂芳酰基”包括杂芳基-C(O)-基团，其中杂芳基如本文所定义。代表性的杂芳酰基包括噻吩酰基、烟酰基、吡咯-2-基羰基、吡啶酰基等。
[0105] 如本文所用的“杂环酰基”包括杂环基-C(O)-基团，其中杂环基如本文所定义。代表性的杂环酰基包括N-甲基脯氨酰基、四氢呋喃酰基等。
[0106] 如本文所用的“杂环基”包括具有约3个至约10个环原子，优选地约5个至约10个环原子的非芳族饱和单环或多环环系，其中该环系中的一个或多个原子是除碳以外的一种或多种元素，例如氮、氧或硫。优选的杂环基含有约5个至约6个环原子。杂环基任选地包含至少一个sp2杂化原子(例如包含羰基、环内烯烃、或环外烯烃的环)。在杂环基之前的前缀“氮杂”、“氧杂”或“硫杂”分别意指存在至少一个氮原子、氧原子或硫原子作为环原子。杂环基的氮或硫原子任选地被氧化成相应的N-氧化物、S-氧化物、或S,S-二氧化物。代表性的单环杂环基环包括哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、噻唑烷基、1,3-二氧杂环戊基、1,4-二 烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢硫代吡喃基等。
[0107] 如本文所用的“杂芳基”包括具有约5个至约14个环原子，优选地约5个至约10个环原子的芳族单环或多环环系，其中该环系中的原子中的至少一个是除碳以外的元素，即氮、氧或硫。优选的杂芳基含有约5个至约6个环原子。在杂芳基之前的前缀“氮杂”、“氧杂”或“硫杂”分别意指存在至少一个氮原子、氧原子或硫原子作为环原子。杂芳基的氮原子任选地被氧化成相应的N-氧化物。代表性的杂芳基包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、3-喹喔啉-2(1H)-酮基、吡嗪基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、异 唑基、异噻唑基、 唑基、噻唑基、吡唑基、呋呫基、吡咯基、吡唑基、三唑基、1,2,4-噻二唑基、吡嗪基、哒嗪基、喹喔啉基、酞嗪基、咪唑并[1,2-a]吡啶、咪唑并[2,1-b]噻唑基、苯并呋呫基、吲哚基、吖吲哚基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、喹啉基、咪唑基、噻吩并吡啶基、喹唑啉基、噻吩并嘧啶基、吡咯并吡啶基、咪唑并吡啶基、异喹啉基、苯并吖吲哚基、1,2,4-三嗪基、苯并噻唑基等。
[0108] 如本文所用的“杂芳基烷基”包括具有杂芳基取代基的烷基。优选地，杂芳基烷基是杂芳基甲基，如2-吡啶基甲基。代表性的杂芳基烷基包括2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基、以及(3-喹喔啉-2(1H)-酮基)甲基。
[0109] 当任何两个取代基或相同取代基的任何两种情况是“独立地选自”替代物的清单时，它们可以是相同的或不同的。举例来说，如果Ra和Rb独立地选自由甲基、乙基、苯甲基以及丙基组成的组，则具有两个Ra基团和两个Rb基团的分子可以具有均是甲基的所有基团。或者，第一个Ra可以是甲基，第二个Ra可以是乙基，第一个Rb可以是丙基，并且第二个Rb可以是苯甲基(或取自该组的任何其它取代基)。或者，两个Ra和第一个Rb可以是乙基，而第二个Rb可以是苯甲基(即一些对的取代基可以是相同的，而其它对可以是不同的)。
[0110] 如本文所用的“氧代”包括式>C＝O的基团(即羰基-C(O)-)。
[0111] 如本文所用的“螺环烷基”包括其中碳原子上的偕位取代基被置换以形成1,1-取代的环的环烷基；螺环炔基是其中碳原子上的偕位取代基被置换以形成1,1-取代的环的环炔基。
[0112] 一般来说，如本文所用的单位前缀“u”等同于“μ”或“微”。举例来说，“ul”等同于“μl”或“微升”。
[0113] C.EphA4抑制剂的用途
[0114] 本申请中所述的EphA4抑制剂可用于治疗多种疾病和病况，包括涉及过度激活的EphA4信号转导的神经变性病症，例如淀粉样蛋白β诱导的神经病症，如阿尔茨海默氏病、脊髓损伤、帕金森氏病、头部损伤(例如创伤性脑损伤)、外周神经再生、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、中风、听觉障碍、多发性硬化、情绪障碍、以及癌症。具体来说，它们在以有效量被施用于有需要的患者时可用于治疗中风、ALS、脊髓损伤以及癌症。如本文所用的术语“有效量”指的是产生施用物质所要达到的治疗作用的量。所述作用包括在任何可检测的程度上预防、矫正或抑制疾病/病况和相关并发症的症状进展。确切的量将取决于治疗剂的性质、施用方式、以及治疗目的，并且将可由本领域技术人员使用已知的技术确定(参见例如Lieberman《, 药物剂型》(PharmaceuticalDosage Forms)(第1-3卷,1992)；Lloyd《,药物配混的领域、科学和技术》(The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)(1999)；以及Pickar《, 剂量计算》(Dosage Calculations)(1999))。
[0115] EphA4受体被指示为多种病痛的治疗靶标。举例来说，EphA4信号通路与由缺血引起的凋亡性细胞死亡相关。在短暂前脑缺血后，在海马体中肝配蛋白A3和EphA4的表达显著增加。然而，抑制EphA4减少了凋亡性神经元细胞死亡，从而表明EphA4信号转导涉及缺血后的细胞凋亡(Li等,NeurosciLett.518(2):92-5,2012)。此外，最新的研究证实药理学抑制EphA4信号转导级联在缺血性中风后影响了功能恢复，并且更确切地说，改善了运动功能(Lemmens等,HumMol Genet.22(11):2214-20,2013)。
[0116] 抑制EphA4还解除了肌萎缩性侧索硬化(ALS)中的神经变性，所述肌萎缩性侧索硬化是一种致命的神经变性疾病，特征在于运动神经元的进行性变性。已经证实最易受ALS中的变性影响的运动神经元表达更高水平的EphA4。此外，已经在ALS患者中观测到EPHA4表达与疾病发作和存活率之间的负相关。此外，EphA4基因敲低解除了由突变型TAR DNA结合蛋白43的表达所诱导的轴突病变，所述蛋白是引起家族性ALS的另一种蛋白质。这些发现表明EphA4在ALS中调节运动神经元变性和疾病进展，并且强调了抑制EphA4作为ALS的一种治疗策略的用途(Faruqi,Nat Rev Drug Discov.11(10):747,2012；Van Hoecke等,Nat Med.18(9):1418-22,2012)。
[0117] 抑制EphA4还在脊髓损伤(SCI)中显示出有前途的治疗潜能。患有SCI的个体常常瘫痪而有很小的恢复功能丧失的可能性，这是因为轴突生长和再生的能力有限。然而，EphA4最近已经被牵涉到轴突抑制和星形胶质细胞增生。缺少EphA4基因的小鼠在脊髓半切后表现出更少的胶质细胞增生以及它们的病变的脊髓中显著减少的神经胶质瘢痕，并且此外，EphA4-/-小鼠中的神经病学结果与野生型对照相比得到显著改善(Goldshmit等,J Neurosci.24(45):10064-73,2004)。此外，EphA4抑制剂的施用已经在SCI动物模型中表现出SCI后运动功能的显著恢复(Spanevello等,J Neurotrauma.30(12):1023-34,2013)。
[0118] EphA4还牵涉到癌症。所述受体在各种人类癌症中上调，如胃癌(Oki等,World J Gastroenterol.14:5650-5656,2008；Miyazaki等,BMC Clin Pathol.13:19,2013)、结肠直肠癌(Oshima等,IntJOncol.33:573-577,2008)、以及胰腺癌(Liu等,OncolLett.7(6):2165-2169,2014)。EphA4的高表达与肿瘤进展有关，包括侵袭、病理阶段以及远处转移(Miyazaki等,BMC ClinPathol.13:19,2013)。举例来说，脑肿瘤中的EphA4表达已经被证实是正常脑组织中的4倍。此外，EphA4还通过促进神经胶质瘤细胞增殖和迁移而在成胶质细胞瘤的恶性表型中起重要作用(Fukai等,Mol Cancer Ther.7(9):2768-78,2008)。因此，EphA4抑制剂是抗癌治疗策略中重要的治疗剂。
[0119] 此外，EphA4在成年神经发生中起作用，所述成年神经发生是在成人脑中由被称作神经祖细胞的增殖细胞产生功能性神经元的过程。体内研究和体外研究这两者均表明这一过程可以通过各种环境因素来调节。举例来说，丰富的环境、运动以及学习可以刺激成年神经发生，而慢性应激或衰老以相反的方式影响。越来越多的证据进一步表明抑郁症的病因与海马体中有缺陷的成年神经发生高度相关(Masi和Brovedani,2011CNSDrugs 25,913-31；Lee等,2013Curr Top BehavNeurosci 14,153-79)。慢性应激导致对成年神经发生的抑制，这可能是因为糖皮质激素释放水平升高。此外，抗抑郁治疗(例如丙咪嗪(imipramine)和氟西汀(fluoxetine))被证实上调了成人脑中的神经发生，这进一步支持了以下观念，即成年神经发生是抑郁症的病理学中的核心因素(Lee等,2013Curr Top Behav Neurosci
14,153-79；Fang等,2013Neuron 79,665-79；David等,2009Neuron 62,479-93)。可以刺激成年神经发生的药剂提供了治疗抑郁症的一种新的治疗策略。在它们的研究中，本申请的发明人发现经口施用Rhy提高了小鼠海马体中的成年神经发生并且因此可以用于抑郁症或精神病症治疗。本文所述的具有EphA4抑制剂活性的Rhy的新型化学衍生物因此还可用于治疗神经/精神病症，如焦虑和抑郁症。
14,153-79；Fang等,2013Neuron 79,665-79；David等,2009Neuron 62,479-93)。可以刺激成年神经发生的药剂提供了治疗抑郁症的一种新的治疗策略。在它们的研究中，本申请的发明人发现经口施用Rhy提高了小鼠海马体中的成年神经发生并且因此可以用于抑郁症或精神病症治疗。本文所述的具有EphA4抑制剂活性的Rhy的新型化学衍生物因此还可用于治疗神经/精神病症，如焦虑和抑郁症。
[0120] 多发性硬化(MS)是可以由本文所述的EphA4抑制剂治疗的另一种疾病。MS是年轻成人的最常见的致残神经病(Hauser和Oksenberg 2006Neuron 52(1):61-76)。它是中枢神经系统的自身免疫性疾病，具有原发性脱髓鞘的广泛局灶性病变，从而导致可变的轴突、神经元以及星形神经胶质损伤(Lassmann 2013Exp Neurol.S0014-4886(13)00361-0)。脱髓鞘是MS的标志，破坏了神经元传递，从而引起广泛的症状(Hernández-Pedro等,2013Clin Dev Immunol.413-465)。最初的炎症级联被认为源自于CNS中驻留的细胞的激活，从而导致组织破坏、脱髓鞘、以及进行性神经功能障碍(Hernández-Pedro等,2013Clin Dev Immunol.413-465)。肝配蛋白和Eph不仅起重要的作用，如突触可塑性和神经干细胞功能，而且它们还涉及免疫功能，如胸腺发育和T细胞/B细胞信号转导(Sobel 2005 Brain Pathol.15(1):35-45； 等,2002J Immunol.169(1):177-845)。阻断EphA4在划痕损伤模型中抑制了损伤闭合并且减少了反应性星形细胞的积聚(Parmentier-Batteur等,2011J Neurochem.118(6):1016-31)。异常的肝配蛋白/Eph表达涉及多发性硬化(MS)中病变的免疫病理和神经元损伤(Sobel 2005Brain Pathol.15(1):35-45)。在人类MS患者中进行的另一研究中，发现活动性MS病变中的EphA4蛋白质相对于慢性MS病变中的EphA4蛋白质有所增加(Parmentier-Batteur等,2011JNeurochem.118(6):1016-31)。综上所述，这些研究支持了EphA4的激活在急性CNS损伤后包括MS在内的损伤的产生中的作用，以及抑制EphA4(例如经由EphA4抑制剂，如本文所述的Rhy化学衍生物的作用)是在MS和其它神经变性疾病中促进CNS功能恢复的一种治疗策略。
[0121] 被制备用于治疗涉及过度活跃的EphA4信号转导的疾病或病况的药物组合物通常包含作为活性成分的一种EphA4抑制剂(例如本文所鉴定的抑制剂中的任一种)以及药学上/生理学上可接受的赋形剂或载体。这样的组合物可以被特定配制用于以预期施用途径向患者施用，例如经由口服施用或注射。EphA4抑制剂还可用于实现制造用于治疗如本申请中所述的相关疾病的药物的目的。
[0122] D.药物组合物和施用
[0123] 本发明还提供了药物组合物或生理性组合物，所述组合物包含有效量的抑制EphA4介导的信号转导的化合物并且因此在预防性应用和治疗性应用这两者中提供了预期益处。这样的药物组合物或生理性组合物还包括一种或多种药学上或生理学上可接受的赋形剂或载体。本发明的药物组合物适用于多种药物递送系统中。用于本发明中的合适的制剂参见《雷明顿药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences),MackPublishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)。关于用于药物递送的方法的简要综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。
[0124] 本发明的药物组合物可以通过各种途径施用，例如口服、皮下、透皮、肌内、静脉内或腹膜内。施用药物组合物的优选途径是向患有由EphA4介导的信号转导加重的病况的器官或组织局部递送，对于70公斤的成年人来说，以每天约0.01mg-2500mg，优选地2.5mg-500mg的EphA4抑制剂的日剂量递送。所述适当的剂量可以单次日剂量或以适当的时间间隔提供的分次剂量施用，例如分为每天两次、三次、四次或更多次亚剂量。
[0125] 对于制备含有EphA4抑制剂(如表1-3中所示的那些)的药物组合物，使用惰性的并且药学上可接受的载体。药物载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括例如粉剂、片剂、可分散的颗粒剂、胶囊、扁囊剂、以及栓剂。固体载体可以是还可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、或片剂崩解剂的一种或多种物质；它还可以是封装材料。
[0126] 在粉剂中，载体一般是处于与微细的活性组分的混合物中的微细固体，所述活性组分例如表1-3中的EphA4抑制剂。在片剂中，活性成分(EphA4信号转导抑制剂)以合适的比例与具有所需的粘合特性的载体混合并且被压制成所需的形状和尺寸。
[0127] 对于制备呈栓剂形式的药物组合物，首先使诸如脂肪酸甘油酯和可可油的混合物的低熔点蜡熔融并且通过例如搅拌将活性成分分散在其中。然后将熔融的均匀混合物倒入具有适当尺寸的模具中并且使之冷却和凝固。
[0128] 粉剂和片剂优选地含有约5重量％至约70重量％的EphA4介导的信号转导抑制剂的活性成分。合适的载体包括例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、乳糖、糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。
[0129] 药物组合物可以包括EphA4抑制剂的活性化合物的制剂，所述制剂具有封装材料作为载体，从而提供胶囊，其中所述抑制剂(在存在或不存在其它载体的情况下)由所述载体围绕，从而使得所述载体因此与化合物缔合。以类似方式，还可以包括扁囊剂。片剂、粉剂、扁囊剂以及胶囊可以用作适合于口服施用的固体剂型。
[0130] 液体药物组合物包括例如适合于口服或肠胃外施用的溶液、适合于口服施用的悬浮液、以及乳液。活性组分(例如EphA4抑制剂，如表1-3中所见的EphA4抑制剂)的无菌水溶液或活性组分于包括水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适合于肠胃外施用的液体组合物的实例。所述组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH值调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、洗涤剂等。
[0131] 可以通过将活性组分(例如EphA4信号转导抑制剂)溶解在所需的溶剂系统中，然后使所得溶液通过膜式过滤器以将它灭菌，或作为另外一种选择，通过在无菌条件下将无菌化合物溶解在先前灭菌的溶剂中来制备无菌溶液。可以将所得的水溶液原样包装或冻干，在施用之前将冻干制剂与无菌水性载体组合。所述制剂的pH值通常将是3至11，更优选地5至9，并且最优选地7至8。
[0132] 含有EphA4抑制剂的药物组合物可以被施用以用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，以足够的量向已经患有可能由EphA4介导的细胞信号转导加重的病况的患者施用组合物，所述量足以预防、治愈、逆转或至少部分减缓或阻止所述病况和它的并发症的症状，如某些类型的癌症的发作、进展、以及转移。足以实现这一目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对于这一用途有效的量将取决于疾病或病况的严重程度以及患者的体重和一般状态，但是对于70公斤的患者来说，一般在每天约0.1mg至约2,500mg的抑制剂的范围，对于70公斤的患者来说，更常使用每天约2.5mg至约500mg的抑制剂的剂量。
[0133] 在预防性应用中，以足够的量向易患其中过度的EphA4介导的信号转导是不希望有的疾病或病况或另外有患该疾病或病况风险的患者施用含有EphA4抑制剂的药物组合物，该量足以延缓或预防症状的发作。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在这一用途中，抑制剂的精确量再次取决于患者的健康状态和体重，但是对于70公斤的患者来说，一般在每天约0.1mg至约2,500mg的抑制剂的范围，更通常对于70公斤的患者来说，每天约2.5mg至约500mg。
[0134] 可以由治疗医师选择的剂量水平和模式进行所述组合物的单次或多次施用。在任何情况下，所述药物制剂应当提供足以有效地治疗性或预防性抑制患者的由EphA4介导的细胞信号转导的量的EphA4抑制剂。
[0135] E.试剂盒
[0136] 本发明还提供了根据本发明的方法抑制EphA4信号转导并且因此治疗癌症的试剂盒。所述试剂盒通常包括容器，所述容器容纳(1)具有有效量的EphA4介导的信号转导的抑制剂(例如表1-3中所鉴定的化合物)的药物组合物；以及(2)含有有关如何分配药物组合物的说明的信息材料，包括有关可以治疗的患者的类型(例如患有具有过度的EphA4信号转导的阿尔茨海默氏病、ALS、中风、或各种类型的癌症的患者)、施用方案(例如剂量和频率)和施用途径等的说明。
[0137] F.实施例
[0138] 实施例1：阻断EphA4介导的信号转导缓解了Aβ诱导的损伤
[0139] 结果
[0140] Aβ刺激神经元中的EphA4激活
[0141] 作为研究EphA4是否涉及AD进展时的突触功能障碍的第一步骤，本申请的发明人在AD小鼠模型的海马体中研究了对EphA4蛋白质和它的活性的调节。在小鼠海马体突触体部分中显著地检测到EphA4，并且在发育和衰老后它的表达保持相对不变(图1a、图7)；这与先前的报道是一致的，即EphA4高表达于啮齿类动物的海马体中27,29。EphA4在602处的酪氨酸磷酸化(P-Tyr602EphA4)反映了所述受体的自体磷酸化状态，在6个月-11个月时，在小鼠海马体的突触体部分中上调(图7)。有趣的是，在早在3个月时，在表达突变型人类早老蛋白1和人源化APP(APPswePS1de9，在下文被指定为APP/PS1)的AD转基因小鼠模型的海马体突触体部分中，P-Tyr602EphA4的水平升高(是野生型[WT]的约1.5倍)(图1a和1b)。最初在AD小鼠模型中在约6个月时观测到突触可塑性的缺陷30,31，这在淀粉样蛋白斑块沉积之前。在3个月大的APP/PS1小鼠的海马体中EphA4活性的增加因此与以下观念是一致的，即EphA4是导致AD中的突触功能障碍的潜在靶标。然后研究神经元中的EphA4信号转导是否由Aβ激活，所述Aβ被认为是引起AD中的突触功能障碍的主要因子。EphA4的酪氨酸磷酸化和聚簇这两者是为所述受体的最大激活所需的16,26。已发现Aβ以剂量依赖性方式增加了急性大鼠海马体切片中EphA4的酪氨酸磷酸化(图1c-f)；所述增加早在1小时之时被观测到并且在2小时之时达到峰值(图1e和1f)。Aβ还增强了培养的海马体神经元中的EphA4聚簇(图1g和1h)。另一方面，在用Aβ短期处理后，突触后蛋白质PSD-95的斑点数目略微减少(图1g和1h)5。Aβ刺激还增强了细胞周期蛋白依赖性激酶5的激活，所述激酶是EphA4的下游靶标(图8)。总之，这些结果表明了Aβ快速诱导了海马体神经元中的EphA4激活和EphA4的下游信号转导。
[0142] EphA4是具有N末端胞外域的I型跨膜蛋白，所述N末端胞外域包含肝配蛋白结合域、富含半胱氨酸的区域、以及III型纤维连接蛋白重复结构域32。最近证实的是，Aβ直接经由纤维连接蛋白重复结构域与另一个Eph家族成员EphB2相互作用，从而引起受体降解和它的信号转导下调15。有趣的是，用肽抑制剂(KYL肽)33阻断EphA4的配体结合域消除了Aβ刺激的EphA4的酪氨酸磷酸化(图1i和1j)。这些发现表明在海马体神经元中EphA4-配体相互作用对于Aβ触发的EphA4激活是关键的。
[0143] 阻断EphA4激活防止了由Aβ诱导的突触功能障碍
[0144] 鉴于EphA4在突触传递和可塑性中的负调节作用24,27,29，Aβ激活EphA4的能力可能导致在AD中所观测到的突触功能障碍。为了测试这一假设，本申请的发明人研究了KYL肽对Aβ诱导的树突棘丧失的作用。虽然在Aβ处理24小时之后在成熟海马体神经元中观测到脊椎密度减小(图2a和2b；Aβ组中的0.46±0.21/μm对比对照组中的0.66±0.1/μm)，但是用KYL肽进行的共处理消除了Aβ触发的树突棘减少(Aβ和KYL肽共处理组中的0.61±0.18/μm对比单独KYL肽组中的0.55±0.13/μm；图2a和2b)。除了减少树突棘数目34之外，Aβ还减少培养的海马体神经元中的神经传递8，如由AMPAR介导的微小兴奋性突触后电流(mEPSC)的频率降低所证实。用Aβ处理神经元显著地延长了事件间期，这与频率成反比，并且伴有培养的海马体神经元中mEPSC的幅值小幅减小8(图2c-e，数据未示)。为了验证EphA4激活是否为Aβ介导的神经传递所需，使用替代性方法以通过添加EphA4的未聚簇的细胞外域(即EphA4-Fc融合蛋白)来阻断EphA4信号转导，该EphA4-Fc融合蛋白与内源性肝配蛋白配体相互作用并且因此阻止EphA4的激活24。未聚簇的EphA4-Fc以类似方式解除了Aβ诱导的突触抑制并且阻止了Aβ诱导的mEPSC事件间期延长(图2c-e)。在EphA4-/-神经元中进一步确认了EphA4在Aβ刺激的突触功能障碍中的重要性。虽然在从野生型小鼠(EphA4+/+)中制备的神经元中Aβ使mEPSC频率减小了约40％，但是类似于Fc条件，在培养的来自EphA4-/-小鼠的海马体神经元中消除了所述减小(图2c-e、图9)。有趣的是，分别通过[2,5-二甲基吡咯基苯甲酸(Cpd1)]35或[罗可嘌呤(Ros)]24阻断EphA4信号转导或Cdk5信号转导还削弱了Aβ刺激的神经传递减少，如由Aβ诱导的mEPSC事件间期延长的减少所反映(图2f-h)。综上所述，这些观测结果表明阻断EphA4/Cdk5信号转导解除了Aβ诱导的对神经传递的抑制。
[0145] 阻断EphA4信号转导逆转了AD中海马体突触可塑性的损伤
[0146] 为了评价阻断EphA4信号转导在Aβ诱导的突触可塑性损伤中的作用，本申请的发明人测量了在海马体切片中在Aβ处理后在EphA4抑制剂(即未聚簇的EphA4-Fc蛋白或KYL肽)存在下海马体谢弗侧支(SC)通路中的LTP。高频刺激(HFS)触发了SC-CA1LTP的量值的显著增加，而在经过Aβ处理的切片中LTP受到抑制3,36(图3a-d)。用未聚簇的EphA4-Fc(10μg/mL)(图3a和3b)或KYL肽(30μM)(图3c和3d)将切片预处理30分钟阻止了Aβ诱导的对LTP的抑制。单独用EphA4-Fc或KYL肽处理没有显著影响HFS诱导的LTP(图3a-d)。综上所述，本发明的发现证实了阻断EphA4介导的信号转导缓解了Aβ诱导的兴奋性突触传递和突触可塑性损伤。
[0147] 随后，本申请的发明人研究了阻断EphA4信号转导是否可以解除AD小鼠模型的受损的突触可塑性。与同窝对照相比，在6-7个月大的APP/PS1小鼠中HFS触发的海马体SC-CA1LTP受损31(图3e和3f)。通过使用渗透泵脑内输注KYL肽将脑中的EphA4信号转导阻断约3周恢复了APP/PS1小鼠的LTP形成(图3e和3f)。在使用媒介物对照的情况下，APP/PS1小鼠(Tg)在与WT相比时表现出减小的场兴奋性突触后电位(fEPSP)斜率，而在接受KYL(17μg；0.23μg/μL)输注的APP/PS1小鼠中LTP的减少被恢复。类似地，在3周-4周内通过基于慢病毒的EphA4shRNA使APP/PS1小鼠的海马体的CA1区中的EphA4表达耗竭缓解了LTP损伤(图3g和
3h)。在与表达GFP的野生型小鼠相比时，感染了绿色荧光蛋白(GFP)表达病毒的APP/PS1小鼠的减少的LTP部分地由海马体的CA1区中的EphA4基因敲低而解除。这样的部分解除可以由仅一定比例的神经元在CA1区中感染了EphA4-shRNA表达病毒来说明(数据未示)。综上所述，这些发现证实抑制EphA4信号转导改善了AD小鼠模型的突触功能障碍，如由正常的突触传递的恢复以及LTP损伤的解除所证实。因此，受到很大的关注的是研究阻断EphA4-配体相互作用是否是一种用于AD的有前途的干预策略。
3h)。在与表达GFP的野生型小鼠相比时，感染了绿色荧光蛋白(GFP)表达病毒的APP/PS1小鼠的减少的LTP部分地由海马体的CA1区中的EphA4基因敲低而解除。这样的部分解除可以由仅一定比例的神经元在CA1区中感染了EphA4-shRNA表达病毒来说明(数据未示)。综上所述，这些发现证实抑制EphA4信号转导改善了AD小鼠模型的突触功能障碍，如由正常的突触传递的恢复以及LTP损伤的解除所证实。因此，受到很大的关注的是研究阻断EphA4-配体相互作用是否是一种用于AD的有前途的干预策略。
[0148] 通过虚拟筛选所鉴定的小分子EphA4抑制剂
[0149] 对EphA4-配体复合体的详细结构分析32,37,38提供了对调节EphA4-配体相互作用的小分子进行虚拟筛选的有前途的基础。具体来说，EphA4的胞外域中的配体结合口袋的独特性使得所述受体成为小分子筛选的理想靶标37,39。因此，本申请的发明人经由分子对接在内部的传统中药数据库中针对EphA4抑制剂进行虚拟筛选。在EphA4的细胞外域与含有225种化合物的内部传统中药数据库以及先前通过高通量筛选所鉴定的可商购获得的EphA4抑制剂Cpd135之间进行分子对接。小分子Rhy被鉴定为以最低的对接能与EphA4结合的前3种化合物之一。Rhy是钩藤(Uncaria rhynchophylla(Miq)Jack(UR))的主要生物碱成分，所述钩藤是常用于靶向中枢神经系统疾病的配方中的一种中草药40。尽管如此，Rhy在诸如AD的神经变性疾病中的临床应用尚未被研究。此外，虽然据报道，这种小分子表现出神经保护活性，但是它的潜在机制基本上是未知的40。在对接分析中，与先前鉴定的EphA4抑制剂Cpd1(-6.5kcal/mol)相比，Rhy给出了显著更低的对接能(-9.0kcal/mol)。这表明Rhy在与EphA4结合方面比Cpd1表现出更高的效能(约67倍的与EphA4的结合亲和力；图4a)39。Rhy的这种强结合亲和力可以归因于它与人类EphA4的配体结合域的大的相互作用界面(图4a)。值得注意的是，Rhy与EphA4的配体结合通道上的多个疏水性残基形成了广泛的接触(图4a)。沉降分析揭示了生物素化的Rhy(Bio-Rhy)与EphA4的细胞外域特异性结合，但不与EphB2的细胞外域特异性结合(图4b)。为了证实在细胞环境下Rhy是否与肝配蛋白-A竞争结合EphA4，研究用Rhy进行的预处理是否减少了外源性肝配蛋白-A1在HT-22细胞上的结合，所述细胞是表达EphA4的细胞系41。类似于用KYL肽进行的预处理，Rhy预处理减少了肝配蛋白-A1与HT-22细胞的结合(图4c；图10)，这表明Rhy与肝配蛋白-A1竞争细胞表面上的受体结合。Rhy作为EphA4抑制剂的有效性进一步通过它拮抗EphA4依赖性信号转导和功能的能力来确认。虽然在培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1刺激增加了EphA4酪氨酸磷酸化、EphA4聚簇体数目、以及EphA4依赖性生长锥塌陷，但是用Rhy进行的预处理以剂量依赖性方式减少了EphA4的特异性磷酸化(图4d和4e)和聚簇(图4f；图11)以及生长锥塌陷(图4g)。
[0150] 经口施用Rhy逆转了AD小鼠模型的对海马体突触可塑性的抑制
[0151] 鉴于阻断EphA4信号转导在AD进展期间增强了神经传递和突触可塑性，我们进一步研究Rhy对Aβ诱导的突触缺失的作用。重要的是，用Rhy对培养的海马体神经元进行的预处理解除了Aβ诱导的mEPSC和LTP损伤。虽然Aβ降低了mEPSC的频率(即事件间期延长)，但是Rhy解除了Aβ诱导的mEPSC频率降低(图5a-c)。此外，用Rhy对培养的海马体神经元进行的预处理阻止了Aβ抑制LTP，而单独用Rhy进行的处理对海马体的LTP没有影响(图5d和5e)。重要的是，向约5个月大的APP/PS1小鼠经口施用Rhy(50毫克·公斤-1·天-1)3周-4周缓解了突触可塑性的损伤(图5f和5g)。与野生型小鼠相比，APP/PS1小鼠(Tg)表现出响应于HFS的LTP减少。施用Rhy完全解除了APP/PS1小鼠的LTP减少。Rhy在另一种AD小鼠模型Tg2576小鼠中以剂量依赖性方式对LTP抑制表现出类似的解除作用，所述Tg2576小鼠表达高水平的瑞典突变形式(Swedishmutated form)的人类APP(图12)。
[0152] 除了解除了AD小鼠模型的突触改变之外，Rhy还改善了AD病理学的某些特征。本申请的发明人发现在将Rhy施用10周之后，在与用水进行的处理相比时，在APP/PS1小鼠的皮层和海马体中淀粉样蛋白斑块的数目和总面积显著减少(图6a-e)。围绕淀粉样蛋白斑块的小神经胶质的激活与淀粉样蛋白斑块的沉积有关42。虽然如由Iba1染色所揭示，在APP/PS1小鼠的皮层中存在广泛的斑块相关的小胶质细胞增生，但是在接受Rhy施用的APP/PS1小鼠中观测到斑块相关的反应性小神经胶质的显著减少(图6f-h)。因此，通过虚拟筛选被鉴定为小分子EphA4抑制剂的Rhy有效地解除了AD小鼠模型中突触可塑性的缺失并且减慢了AD的进展。
[0153] 讨论
[0154] 新出现的证据揭示伴随AD中的神经网络衰竭和认知功能衰退的突触丧失和功能障碍可以代表早期AD产生的主要病因。因此，改善突触功能障碍是用于治疗AD中的认知功能衰退的一种有前途的治疗方法。本发明的发现证实EphA4在介导AD中的突触功能障碍中起关键作用并且是一种新的AD治疗靶标。使用包括肽和小分子在内的多种方法阻断EphA4-配体相互作用可以解除在疾病进展后受损的突触可塑性。对靶向EphA4-配体相互作用的小分子抑制剂的研发可能被证明是一种用于AD的有效的疾病调修治疗。
[0155] EphA4是Aβ的细胞靶标
[0156] 尽管Eph涉及调节突触功能和可塑性，但是只是最近研究了Eph家族的成员是Aβ在突触处的细胞靶标的可能性15,26。尽管EphB2在AD中下调并且介导了Aβ依赖性突触功能障碍15，但是本研究揭示了EphA4在AD中被过度激活并且引起突触功能障碍。最近的全基因组关联研究(GWAS)鉴定了位于EPHA4近端的单核苷酸多态性43和EPHA1基因与晚发型AD有关44。值得进行旨在鉴定EPHA4的突变或多态性的进一步的研究来阐明EPHA4基因是否与AD有关。此外，重要的是研究Eph家族的不同成员是如何参与的并且这些信号转导通路在AD进展期间是否串扰。
[0157] Aβ是如何诱导EphA4激活的？鉴于Aβ与EphB2在III型纤维连接蛋白结构域处结合15并且EphA4也含有这一相同结构域，Aβ可能经由与所述受体直接结合来刺激EphA4激活。或者，Aβ可能调节肝配蛋白A3-EphA4相互作用来触发EphA4信号转导。这种可能性得到了以下事实的支持，即海马体中突触后树突EphA4的激活关键取决于它与星形细胞中存在的肝配蛋白-A3的相互作用，并且EphA4酪氨酸磷酸化在肝配蛋白-A3基因敲除小鼠的海马体中减少45并且在表达肝配蛋白-A3的小鼠中增加46。最终，Aβ可能经由调节神经元活性来增强EphA4激活47。本申请的发明人的先前有关EphA4响应于神经活性的慢性增加的激活的发现27
与这种可能性是一致的 。
与这种可能性是一致的 。
[0158] EphA4在AD中的病理生理作用
[0159] EphA4是成人海马体中突触结构和功能的关键调节因子24,27,29。EphA4与它的配体肝配蛋白-A3之间的相互作用产生双向的(即正向和反向)信号，这两者对于调节海马体功能来说均是关键的。突触后EphA4由星形细胞肝配蛋白A的激活使得能够激活成年啮齿类动物海马体中的EphA4正向信号转导并且引起脊椎丧失以及表面AMPA受体的去除27,29。EphA4可能经由以Cdk5-RhoA依赖性方式24、PLCγ1-丝切蛋白依赖性方式48、或通过调节粘附受体23使肌动蛋白细胞骨架重组而引起树突棘回缩。EphA4以蛋白酶体依赖性方式触发培养的海马体神经元中AMPA受体的降解并且最终使得它们从突触被去除27。树突棘的减少和AMPA受体的去除这两者是导致AD进展期间的突触丧失和功能障碍的关键因素10,34。EphA4的另一有趣的特征在于所述受体能够在星形细胞中经由肝配蛋白-A3触发反向信号转导并且通过降低胶质细胞中的谷氨酸转运蛋白来调节谷氨酸的摄取46。EphA4基因敲除或肝配蛋白-A3基因敲除小鼠表现出增加的神经胶质谷氨酸转运蛋白(例如GLAST和GLT1)的表达，而肝配蛋白-A3在星形细胞中的过表达降低了这些蛋白质的水平。因此，EphA4-肝配蛋白A3反向信49
号转导增强了突触间隙处谷氨酸的积聚。虽然AD小鼠表现出异常的谷氨酸摄取 ，但将关注的是，研究EphA4反向信号转导是否经由谷氨酸摄取的失调而涉及AD中的突触功能障碍。此外，EphA4最近被牵涉到调节脊髓损伤中炎症相关基因的表达50。EphA4是否调节导致AD病变(如炎症)的其它通路仍是未知的。
号转导增强了突触间隙处谷氨酸的积聚。虽然AD小鼠表现出异常的谷氨酸摄取 ，但将关注的是，研究EphA4反向信号转导是否经由谷氨酸摄取的失调而涉及AD中的突触功能障碍。此外，EphA4最近被牵涉到调节脊髓损伤中炎症相关基因的表达50。EphA4是否调节导致AD病变(如炎症)的其它通路仍是未知的。
[0160] 作为AD的治疗干预的靶标的EphA4
[0161] 逆转突触功能障碍是针对AD中的认知功能衰退的一种潜在的治疗策略。在本研究中将EphA4鉴定为AD的细胞靶标以及对EphA4-配体相互作用的详细结构表征32,37,38为研发用于治疗AD的EphA4抑制剂提供了很大的希望。实际上，已经研发了用于靶向EphA4和肝配蛋白的各种策略(例如与抗体的Fc区融合的EphA4的重组细胞外域、以及与EphA4结合的特异性肽和小分子)51。Rhy(在本研究中所鉴定的小分子)以及与EphA4在配体结合域处结合并且抑制肝配蛋白结合的肽KYL52有效地缓解了AD转基因小鼠模型中Aβ诱导的突触功能障碍和突触可塑性缺陷。虽然需要另外的研究来排除Aβ与EphA4在配体结合域处结合以及这些EphA4抑制剂直接阻断EphA4-Aβ相互作用的可能性，但是有趣的是，推测EphA4与肝配蛋白之间的内源性相互作用介导了Aβ触发的突触缺失和功能障碍。因此，研发靶向EphA4-配体相互作用的干预可能是用于AD的有前途的治疗策略。除了AD之外，EphA4抑制剂还可以用作用于治疗涉及EphA4的各种疾病的治疗剂，包括但不限于肌萎缩性侧索硬化53和脊髓损伤54。
[0162] 构成Rhy在AD中的有益作用的基础的机制仍有待阐明。有趣的是，先前已经表明Rhy是NMDA拮抗剂55和钙通道阻断剂56，它还可以缓解AD的突触功能障碍。然而，后续的研究揭示Rhy既不与NMDA受体结合，也不抑制谷氨酸诱导的Ca2+内流57；本申请的发明人也发现Rhy不能抑制海马体神经元中的NMDA电流(数据未示)。因此不太可能的是，Rhy在逆转AD中的突触功能障碍方面的有益作用是由于Rhy对NMDA受体的抑制作用。在此，本申请的发明人经由我们的努力以使用基于结构的硅片上筛选方法对靶向EphA4的配体结合域的小分子进行筛选而将Rhy鉴定为EphA4抑制剂。Rhy针对EphA4的抑制活性是通过它阻止配体结合、配体诱导的受体激活以及它下游的信号转导的能力来确认的(图4)。鉴于Rhy在缓解AD转基因小鼠中的突触可塑性缺陷中的有益作用(图5)，认为Rhy可以用作AD的治疗剂。对Rhy与EphA4以及其它Eph成员的结合界面的结构细节的进一步表征可以允许经由化学衍生来优化Rhy的结构，这可以最终使得鉴定出具有更高的亲和力、特异性以及效能的新EphA4抑制剂。
[0163] 总之，本发明的发现提供了证据表明EphA4对于介导AD病理学中的突触可塑性损伤来说是关键的。了解EphA4下游的分子和细胞机制可以使得鉴定出可用于AD疗法的新化合物。靶向EphA4可能有益于预防和治疗AD。重要的是，EphA4的小分子抑制剂Rhy缓解AD模型中的突触损伤的能力为这种干预策略提供了支持。
[0164] 材料和方法
[0165] 化学品、抗体以及病毒
[0166] 所用的抗体包括抗EphA4抗体和抗Cdk5抗体(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))；抗PSD-95抗体(生物亲和试剂公司(BioAffinity Reagents))；抗β-淀粉样蛋白抗体(针对Aβ8-17的6F/3D，丹科公司(Dako))；抗Iba-1抗体(和光纯药工业株式会社(Wako Pure Chemical Industries))；磷酸化酪氨酸抗体(4G10)、和抗τ-1抗体(密理博公司(Millipore))；抗肌动蛋白抗体(西格玛公司(Sigma))；磷酸化Tyr 602(p-Y602EphA4)(ECM生物科技公司(ECM Biosciences))；以及Fc和人类Fc山羊抗体(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))。组蛋白H1重组蛋白和罗可嘌呤购自密理博公司，[2,5-二甲基吡咯基苯甲酸(Cpd1)]购自Matrix Scientific公司，并且Rhy购自宝鸡市辰光生物科技有限公司(Baoji HerbestBio-Tech)。肝配蛋白-A1、EphA4-Fc、EphB2-Fc、生物素化的肝配蛋白-A1-Fc以及生物素化的EphA4-Fc重组蛋白购自R&D系统公司(R&D Systems)；KYL肽购自生物合成公司(Bio-synthesis)；并且Aβ单体购自rPeptide公司。如先前所述24,58构建表达EphA4shRNA的慢病毒。由爱荷华大学(University of Iowa)的基因转移载体中心(Gene Transfer Vector Core)包装所述病毒。
[0167] 生物素化的Rhy的合成以及β-淀粉样蛋白低聚物和肝配蛋白的制备
[0168] Bio-Rhy的合成利用了Rhy的N1与(6-溴己基)氨基甲酸叔丁酯之间的亲核取代反应。分离产物的叔丁氧羰基，以得到1-己胺取代的Rhy。然后通过使取代的Rhy与生物素在偶合试剂存在下反应来获得Bio-Rhy。
[0169] 如先前所述59,60制备低聚Aβ(Aβ)。简单地说，将0.5mg的单体Aβ1-42溶解在22.2μL的无水DMSO中，然后在冰冷的无酚红F-12培养基中稀释以得到100μM的最终Aβ浓度。将Aβ溶液在4℃孵育24小时，然后以14,000×g离心10分钟。将上清液冷冻在液氮中并且在-20℃储存最多1个月。除非加以说明，否则通常将培养的神经元或海马体切片用500nM的Aβ处理。
[0170] 将肝配蛋白-A1-Fc用山羊抗人类Fc抗体(1:4.5)24预聚簇并且在使用之前在室温下孵育60分钟。如先前所述61，在海马体神经元中用0.1μg/mL的肝配蛋白-A1进行生长锥塌陷测定。
[0171] 通过分子对接对内部传统中药数据库进行虚拟筛选
[0172] 使用AutoDock 4.0进行EphA4(PDB代码：2WO2)与我们的含有225种化合物的内部传统中药数据库之间的对接63,64。以下列参数使用拉马克遗传算法(Lamarckian genetic algorithm)：群体中的个体数：200；能量评价的最大数：5,000,000；最大代数：27,000；遗传算法运行数：20。
[0173] 细胞培养和急性海马体切片
[0174] 如先前所述24，由胚胎第18-19天大鼠胚胎制备原代皮层和海马体神经元。简单地说，将皮层神经元(每个板6×106个)接种到包被有聚D-赖氨酸(12.5μg/mL；西格玛公司)的100mm培养皿上。将大鼠海马体神经元以0.5×105个/18mm盖玻片(用于免疫细胞化学分析)、0.1×105个/18mm盖玻片(用于生长锥塌陷测定)、或1×105个或1.5×105个/18mm盖玻片(用于mEPSC记录)的密度接种到包被有聚D-赖氨酸(50μg/mL)的18mm盖玻片上。向神经元供给补充有2％B27(英杰公司(Invitrogen))的Neurobasal培养基(英杰公司)。由P15-P17斯泼累格-多雷大鼠(Sprague-Dawley rat)制备急性脑切片。简单地说，将大鼠快速断头，并且将它们的脑浸泡在冰冷的人工脑脊髓液(ACSF)中。将海马体解剖，并且使用振动切片机(徕卡公司(Lieca))制备300μm厚的切片。然后将切片转移到容纳用95％O2+5％CO2平衡的
65
循环ACSF的孵育室中并且在实验之前在室温下保持至少2小时以复苏 。
65
循环ACSF的孵育室中并且在实验之前在室温下保持至少2小时以复苏 。
[0175] AD小鼠模型、shRNA基因敲低、肽输注、以及药物施用
[0176] APP/PS1双重转基因小鼠是从杰克逊实验室公司(JacksonLaboratory)获得的(B6C3-Tg[APPswe,PSEN1dE9]85Dbo/J)66。这些小鼠是通过并入带有瑞典双重突变和外显子-9缺失型PSEN1突变(APPswe+PSEN1/dE9)的人类/鼠类APP构建体而产生的。还使用表达人类AβPP的双重突变体(Lys670→Asn670；Met671→Leu671)的APP转基因小鼠(Tg2576)31。使用两种性别进行实验，并且这一研究中所使用的所有小鼠均是由香港科技大学(Hong Kong University ofScience and Technology)的动物护理机构(Animal Care Facility)产生的。通过对尾部活检进行聚合酶链反应分析来确认基因型。将相同性别的四只至五只小鼠在12小时光/暗周期下圈养在不限量供应饲料和水的笼中。
[0177] 为了在AD小鼠中研究通过KYL肽阻断EphA4信号转导的作用，向4-5个月大的AD转基因小鼠植入Alzet微型渗透泵(型号1004)，所述渗透泵以0.11微升/小时泵送它的内容物，持续28天。将泵装载以于人工脑脊髓液(CSF)中的0.23μg/μL的KYL肽(17μg)或媒介物溶剂。在右半球中侧脑室内调整所述微型渗透泵。如先前所述，通过将具有pFUGW-shEphA4的水泡性口膜炎病毒糖蛋白G假型化的慢病毒粒子双侧注射到相应区域中将APP/PS1小鼠的CA1区中的EphA4基因敲低58。在LTP测量之前通过每日灌胃向AD小鼠经口施用20毫克·公斤-1·天-1或50毫克·公斤-1·天-1的Rhy(0.01g/mL水)，持续3-4周。
[0178] 突触体制备、免疫沉淀、以及蛋白质印迹分析
[0179] 如先前所述制备海马体突触体67。将来自P15-P17大鼠的急性海马体切片在具有各种蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(1％TritonX-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、150mM NaCl、10mM磷酸钠、2mM EDTA、以及0.2％钒酸钠)中裂解。对于Cdk5激酶测定，将培养的皮层神经元[在体外16天(DIV)]在具有各种蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液A(20mM Tris[pH 7.6]、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM NaF、以及0.5％的诺乃(Nonidet)P-40)中裂解。如先前所述24进行蛋白质印迹分析。
[0180] 对于免疫沉淀测定，在4℃用相应的抗体使裂解物进行免疫沉淀，持续2小时，继而24
在4℃与蛋白G琼脂糖凝胶(Sepharose)一起孵育1小时 。将样品用RIPA缓冲液或缓冲液A洗涤并且重悬在SDS样品缓冲液中。通过蛋白质印迹分析，使用4G10抗体检测EphA4酪氨酸磷酸化。
在4℃与蛋白G琼脂糖凝胶(Sepharose)一起孵育1小时 。将样品用RIPA缓冲液或缓冲液A洗涤并且重悬在SDS样品缓冲液中。通过蛋白质印迹分析，使用4G10抗体检测EphA4酪氨酸磷酸化。
[0181] 免疫细胞化学、免疫组织化学、共聚焦显微镜法、以及定量分析
[0182] 为了研究经过Aβ处理的神经元中EphA4和PSD-95的亚细胞定位，在-20℃将神经元用甲醇固定20分钟24。如先前所述68进行免疫染色。简单地说，在4℃将神经元与抗PSD-95抗体(1:500)和抗EphA4抗体(1:1000)一起在GDB缓冲液中孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤，并且与相应的二抗在室温孵育1小时。对于图像采集，将细胞封固在ProLong抗猝灭试剂(英杰公司)中，并且使用具有63倍油浸物镜的Zeiss激光扫描共聚焦显微镜(LSM7DUO)使用Z堆栈采集模式采集图像。
[0183] 对于免疫组织化学分析，将小鼠麻醉，穿心灌注以盐水，继而灌注以4％多聚甲醛(pH 7.4)，并且取出脑66。在过夜后固定和一系列冷冻保护之后，使用恒冷切片机(MicromHM 560，赛默科技公司(Thermo Scientific))以20μm的厚度将脑冠向切片。在4℃将切片用β-淀粉样蛋白抗体(1:200)和Iba1抗体(1:500)染色过夜，继而与适当的荧光缀合的二抗一起孵育并且封固在Hydromount(National diagnostics公司)中。使用LeicaDMRA显微镜拍摄图像。对于3,3-二氨基联苯胺(DAB)染色，将切片再水化并且进行抗原修复。然后在4℃将切片与在Dako REAL抗体稀释剂(达可斯通公司(Dako Cytomation))中稀释的β-淀粉样蛋白抗体一起孵育过夜，继而在室温下与二抗一起孵育(使用Dako REAL EnVision/HRP，兔/小鼠)1小时。然后在室温下通过DAB法使β-淀粉样蛋白染色显影10分钟(Dako REAL DAB+发色团)。然后将切片用苏木精复染，在递升浓度的乙醇中脱水，用二甲苯透化，并且封固在DPX中。使用Zeiss Lumar.V12显微镜拍摄图像。
[0184] 使用相同的采集设置获得来自同一实验的图像，并且使用Metamorph软件(Meta 24,58
Image 7.5系列，通用成像公司(Universal Imaging Corp.))分析图像 。对于定量EphA4和PSD-95聚簇体，分析来自每一个神经元的两个树突段以进行定量。手动描绘树突的轮廓。
测量在每一个实验中所有图像的背景的基础阈值。然后将这些阈值的平均值应用于同一实验中的所有图像。为了测量树突中聚簇体的密度，首先将图像进行阈值分割以包括强度是相邻树突的信号的2倍的聚簇体，并且自动测量聚簇体的总数和树突长度。对于DAB、Iba1或Aβ染色的定量，将图像进行阈值分割以包括强度是对照中的背景信号的2.5倍的聚簇体。描绘皮层区和海马体区，并且将淀粉样蛋白沉积定量为皮层或海马体中斑块的数目和面积百分比(所关注的面积上由Aβ染色覆盖的面积)。对于定量斑块相关的Iba1染色，测量淀粉样蛋白沉积周围的Iba1染色的面积和强度。
Image 7.5系列，通用成像公司(Universal Imaging Corp.))分析图像 。对于定量EphA4和PSD-95聚簇体，分析来自每一个神经元的两个树突段以进行定量。手动描绘树突的轮廓。
测量在每一个实验中所有图像的背景的基础阈值。然后将这些阈值的平均值应用于同一实验中的所有图像。为了测量树突中聚簇体的密度，首先将图像进行阈值分割以包括强度是相邻树突的信号的2倍的聚簇体，并且自动测量聚簇体的总数和树突长度。对于DAB、Iba1或Aβ染色的定量，将图像进行阈值分割以包括强度是对照中的背景信号的2.5倍的聚簇体。描绘皮层区和海马体区，并且将淀粉样蛋白沉积定量为皮层或海马体中斑块的数目和面积百分比(所关注的面积上由Aβ染色覆盖的面积)。对于定量斑块相关的Iba1染色，测量淀粉样蛋白沉积周围的Iba1染色的面积和强度。
[0185] 使用NIH Image J程序对蛋白质条带强度进行光密度定量。在适当时，使用斯图登氏t检验或方差分析进行统计分析，继而使用如图例说明中所示的不同的检验进行统计分析。除非加以指示，否则所有实验进行至少3次。
[0186] Cdk5激酶测定
[0187] 在30℃在含有1-2μCi[γ-32P]ATP和8μg组蛋白-H1蛋白的激酶缓冲液(20mM MOPS[pH 7.4]、15mM MgCl2、以及100μM ATP)中进行Cdk5/p35激酶测定，持续30分钟24。然后使用15％SDS-PAGE分离磷酸化的组蛋白-H1蛋白并且通过放射自显影法可视化。
[0188] Rhy-EphA4结合测定
[0189] 对于沉降分析，使Bio-Rhy与链霉亲和素磁性珠粒结合1小时，然后将所述珠粒与重组EphA4-Fc或EphB2-Fc一起在0.5％BSA存在下孵育1小时。在孵育之后，将珠粒用DPBS洗涤4次并且通过蛋白质印迹分析确定复合体中Eph的存在。
[0190] 为了研究Rhy是否抑制肝配蛋白-A1与HT-22细胞的细胞表面的结合，如先前所述，69
在有一些改动的情况下进行基于细胞的结合测定 。将HT-22细胞接种到聚D-赖氨酸盖玻片上。在4℃将细胞与不同浓度的Rhy或KYL一起预孵育10分钟，继而在4℃与0.5μg/mL生物素化的肝配蛋白-A1一起孵育45分钟。然后将细胞用4％多聚甲醛固定，然后用与Alexa Fluor
488缀合的链霉亲和素抗体(分子探针公司(Molecular Probes))针对生物素化的肝配蛋白-A1的表面标记进行免疫染色。
在有一些改动的情况下进行基于细胞的结合测定 。将HT-22细胞接种到聚D-赖氨酸盖玻片上。在4℃将细胞与不同浓度的Rhy或KYL一起预孵育10分钟，继而在4℃与0.5μg/mL生物素化的肝配蛋白-A1一起孵育45分钟。然后将细胞用4％多聚甲醛固定，然后用与Alexa Fluor
488缀合的链霉亲和素抗体(分子探针公司(Molecular Probes))针对生物素化的肝配蛋白-A1的表面标记进行免疫染色。
[0191] EphA4聚簇和生长锥塌陷测定
[0192] 将神经元(3DIV)用不同浓度的Rhy或作为对照的KYL预处理15分钟，用预聚簇的肝配蛋白-A1再处理15分钟，并且用4％多聚甲醛固定61。对于EphA4聚簇，将神经元用抗EphA4抗体和抗τ-1抗体染色。对于生长锥塌陷测定，将神经元用与Alexa Fluor555缀合的毒伞素(分子探针公司)针对丝状肌动蛋白染色并且用抗τ-1抗体针对轴突染色。以双盲方式对塌陷的生长锥进行评分。将实验重复至少3次，并且每次实验分析>50个神经元。以平均值±SEM的形式呈现数据。
[0193] 树突棘分析
[0194] 将培养的大鼠海马体神经元在14-16DIV时用GFP质粒转染并且在用30μM的KYL肽24
处理后，在24-28DIV时暴露于Aβ，持续24小时。如先前所述 ，将神经元用4％多聚甲醛固定并且使用共聚焦显微镜法，使用63倍物镜进行研究。
处理后，在24-28DIV时暴露于Aβ，持续24小时。如先前所述 ，将神经元用4％多聚甲醛固定并且使用共聚焦显微镜法，使用63倍物镜进行研究。
[0195] 电生理学
[0196] 对于微小EPSC记录，将海马体神经元(约25-28DIV)用500nM Aβ或不用500nM Aβ连同测试试剂一起共处理24小时。在室温下用含有(以mM为单位)110NaCl、5KCl、2CaCl2、0.8MgCl2、10HEPES以及10D-葡萄糖(pH 7.4)的外部溶液以及含有(以mM为单位)135CsCl2、
10HEPES、2MgCl2、4NaATP、0.4NaGTP、以及0.5EGTA(pH 7.2)的内部溶液进行全细胞膜片钳记录24,27。在外部溶液中包括印防己毒素(200μm)以连同0.5μM的TTX一起阻断GABA能IPSC来阻止动作电位引起的EPSC。对于微小EPSC记录，将细胞保持在-70mV。这些实验的吸管电阻通常是3-5MΩ，而串联电阻是15-20MΩ。在每一种条件下将来自每一个细胞的微小兴奋性电位记录1分钟。mEPSC的测量是根据用于测量AMPA受体EPSC的微型分析程序(Mini Analysis Program)(Synaptosoft公司(Synaptosoft Inc.))中所述的那样。仅分析其中串联电阻和输入电阻差异<10％的记录期。以至少3次实验的平均值±SEM的形式呈现数据。
10HEPES、2MgCl2、4NaATP、0.4NaGTP、以及0.5EGTA(pH 7.2)的内部溶液进行全细胞膜片钳记录24,27。在外部溶液中包括印防己毒素(200μm)以连同0.5μM的TTX一起阻断GABA能IPSC来阻止动作电位引起的EPSC。对于微小EPSC记录，将细胞保持在-70mV。这些实验的吸管电阻通常是3-5MΩ，而串联电阻是15-20MΩ。在每一种条件下将来自每一个细胞的微小兴奋性电位记录1分钟。mEPSC的测量是根据用于测量AMPA受体EPSC的微型分析程序(Mini Analysis Program)(Synaptosoft公司(Synaptosoft Inc.))中所述的那样。仅分析其中串联电阻和输入电阻差异<10％的记录期。以至少3次实验的平均值±SEM的形式呈现数据。
[0197] 对于LTP记录，将小鼠脑在处死之后立即解剖并且浸泡在冰冷的95％O2/5％CO2(aCSF)中58。使用振动组织切片机(HM650V；赛默公司)制备脑切片(300μm厚)，并且在32℃在充氧缓冲液中浸泡2小时。切除海马体区并且将所述海马体区放置在具有64个嵌入式记录电极的MED-P210A探针(松下国际公司(Panasonic International Inc))的中央。然后在LTP诱导之前，将切片灌注以于充氧aCSF中的500nM Aβ，持续2小时70。对于用EphA4抑制剂进行的处理，在施加Aβ之前将切片用肽或化学品预处理1小时。使用MED64多通道记录系统记录fEPSP，并且从区CA1的树突层以10kHz的采样率采集数据。对于每一个切片，将基线刺激强度设定在引出根据输入-输出曲线所确定的最大fEPSP响应的约50％的水平。通过3串HFS(100Hz，1秒，相隔30秒递送)诱导LTP。LTP的量值被定量为在LTP诱导之后在60分钟时间间隔期间所获得的fEPSP斜率的变化百分比(10％-90％)。
[0198] 实施例2：补骨脂异黄酮和石斛碱抑制EphA4信号转导
[0199] 为了筛选小分子EphA4抑制剂，本申请的发明人使用小分子文库进行了分子对接分析。除了Rhy之外，两种小分子(从一个TCM数据库中所筛选)也表现出EphA4抑制活性。使用培养的海马体神经元测试它们抑制EphA4，从而抑制EphA4依赖性生长锥塌陷的能力。当将大鼠海马体神经元用图13中所示的浓度的小分子(补骨脂异黄酮、石斛碱)处理并且用肝配蛋白-A1处理时，所述化合物抑制肝配蛋白-A1刺激的生长锥塌陷。
[0200] 实施例3：衍生自Cpd1的化合物抑制EphA4信号转导
[0201] 如Noberini等(同上)中所述，Cpd1具有化学名称2-羟基-4-(2,5-二甲基-1-吡咯基)苯甲酸并且具有以下化学式：
[0202]
[0203] 本申请的发明人已经由Cpd1产生若干化学衍生物并且发现化合物6、14以及21具有EphA4信号转导抑制剂的活性。这些Cpd1衍生化合物由它们的化学名称和化学式示于图14中。它们的EphA4抑制作用示于图15中。简单地说，将大鼠皮层神经元用不同浓度的衍生自Cpd1的化合物处理并且用肝配蛋白-A1处理。图15示出了针对EphA4酪氨酸磷酸化进行蛋白质印迹分析的结果。
[0204] 实施例4：新型Rhy衍生物的合成
[0205] RHY-26：
[0206]
[0207] 向Rhy(100mg)于四氢呋喃(THF，5mL)中的溶液中添加氢化钠(NaH，50mg)，继而添加1,8-二氯辛烷(0.24mL)。将混合物加热到50℃，并且在搅拌20小时之后，将反应物用水(10mL)骤冷，用二氯甲烷(DCM，3×15mL)萃取，并且用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的RHY-26(5mg)。
[0208] RHY-37：
[0209]
[0210] 步骤1：
[0211] 向RHY(100mg)于THF(2mL)中的溶液中添加NaH(50mg)，继而添加1,8-二溴辛烷(0.20mL)。将混合物加热到50℃，并且在搅拌20小时之后，将反应物用水(10mL)骤冷，用DCM(3×15mL)萃取，并且用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:20)将残余物纯化，得到呈黄色油状的ZJ-4-172-1(70mg)。
[0212] 步骤2：
[0213] 向ZJ-4-172-1(70mg)于DMF(1mL)中的溶液中添加NaH(20mg)，继而添加3,4-二甲氧基苯酚(56mg)。将混合物加热到50℃，并且在搅拌20小时之后，将反应物用水(5mL)骤冷，用DCM(3×5mL)萃取，并且用饱和NaHCO3水溶液(10mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:33)将残余物纯化，得到呈黄色油状的RHY-37(20mg)。
[0214] RHY-36：
[0215]
[0216] 步骤1：
[0217] 向RHY(100mg)于THF(2mL)中的溶液中添加NaH(50mg)，继而添加1,8-二溴辛烷(0.20mL)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(10mL)骤冷，用DCM(3×15mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:20)将残余物纯化，得到呈黄色油状的ZJ-4-172-1(70mg)。
[0218] 步骤2：
[0219] 向ZJ-4-172-1(40mg)于DMF(1mL)中的溶液中添加K2CO3(38mg)，继而添加3,4-二甲氧基苯甲酸(38mg)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(5mL)骤冷，用DCM(3×5mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(10mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:33)将残余物纯化，得到呈黄色油状的RHY-36(10mg)。
[0220] RHY-42：
[0221]
[0222] 步骤1：
[0223] 向RHY(300mg)于THF(10mL)中的溶液中添加NaH(150mg)，继而添加1,6-二溴己烷(0.5mL)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(20mL)骤冷，用DCM(3×30mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(30mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的ZJ-4-178(200mg)。
[0224] 步骤2：
[0225] 向ZJ-4-178(90mg)于DMF(3mL)中的溶液中添加K2CO3(68mg)，继而添加4-(苯甲氧基)苯酚(100mg)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(10mL)骤冷，用DCM(3×10mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的RHY-42(50mg)。
[0226] RHY-45：
[0227]
[0228] 步骤1：
[0229] 向RHY(300mg)于THF(10mL)中的溶液中添加NaH(150mg)，继而添加1,7-二溴庚烷(0.53mL)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(20mL)骤冷，用DCM(3×30mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(30mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的ZJ-4-183(220mg)。
[0230] 步骤2：
[0231] 向ZJ-4-183(60mg)于DMF(2mL)中的溶液中添加K2CO3(50mg)，继而添加5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(64mg)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(10mL)骤冷，用DCM(3×10mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的RHY-45(20mg)。
[0232] RHY-48：
[0233]
[0234] 步骤1：
[0235] 向RHY(300mg)于THF(10mL)中的溶液中添加NaH(150mg)，继而添加1,7-二溴庚烷(0.53mL)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(20mL)骤冷，用DCM(3×30mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(30mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的ZJ-4-183(220mg)。
[0236] 步骤2：
[0237] 向ZJ-4-183(60mg)于DMF(2mL)中的溶液中添加K2CO3(45mg)，继而添加4-(苯甲氧基)苯酚(50mg)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(10mL)骤冷，用DCM(3×10mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的ZJ-4-185-1(30mg)。
[0238] 步骤3：
[0239] 向ZJ-4-185-1(20mg)于MeOH(2mL)中的溶液中添加10％Pd/C(10mg)，在H2中将混合物搅拌20小时，然后将混合物经过硅藻土垫过滤(MeOH洗脱剂)并且在真空中蒸发溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将粗产物纯化，得到呈黄色油状的RHY-48(10mg)。
[0240] RHY-50：
[0241]
[0242] 步骤1：
[0243] 向RHY(300mg)于THF(15mL)中的溶液中添加NaH(150mg)，继而添加1,8-二溴辛烷(0.58mL)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(20mL)骤冷，用DCM(3×30mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(30mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的ZJ-4-189(200mg)。
[0244] 步骤2：
[0245] 向ZJ-4-189(60mg)于DMF(2mL)中的溶液中添加K2CO3(60mg)，继而添加5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(50mg)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(10mL)骤冷，用DCM(3×10mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的RHY-50(20mg)。
[0246] RHY-23：
[0247]
[0248] 向RHY(100mg)于THF(5mL)中的溶液中添加NaH(50mg)，继而添加1,5-二溴戊烷(0.18mL)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(10mL)骤冷，用DCM(3×15mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的RHY-23(100mg)。
[0249] RHY-46：
[0250]
[0251] 步骤1：
[0252] 向RHY(300mg)于THF(10mL)中的溶液中添加NaH(150mg)，继而添加1,7-二溴庚烷(0.53mL)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(20mL)骤冷，用DCM(3×30mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(30mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的ZJ-4-183(220mg)。
[0253] 步骤2：
[0254] 向ZJ-4-183(70mg)于DMF(1mL)中的溶液中添加2-(吡咯烷-1-基)乙胺(90μL)，将混合物加热到80℃，在搅拌20小时之后，将反应物用饱和NaHCO3水溶液(10mL)骤冷，用DCM(3×10mL)萃取，用饱和H2O(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM/NH3·H2O＝6:100:1)将残余物纯化，得到呈黄色油状的RHY-46(10mg)。
[0255] RHY-47：
[0256]
[0257] 步骤1：
[0258] 向RHY(300mg)于THF(10mL)中的溶液中添加NaH(150mg)，继而添加1,7-二溴庚烷(0.53mL)，将混合物加热到50℃，在搅拌20小时之后，将反应物用水(20mL)骤冷，用DCM(3×30mL)萃取，用饱和NaHCO3水溶液(30mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM＝1:30)将残余物纯化，得到呈黄色油状的ZJ-4-183(220mg)。
[0259] 步骤2：
[0260] 向ZJ-4-183(70mg)于DMF(1mL)中的溶液中添加3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(90μL)，将混合物加热到80℃，在搅拌20小时之后，将反应物用饱和NaHCO3水溶液(10mL)骤冷，用DCM(3×10mL)萃取，用饱和H2O(20mL)洗涤。将合并的有机层经过Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中去除溶剂。通过柱色谱(硅胶，MeOH/DCM/NH3·H2O＝6:100:1)将残余物纯化，得到呈黄色油状的RHY-47(15mg)。
[0261] 实施例5：功能和分析测定
[0262] 肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定
[0263] 在EphA4聚簇测定中研究Rhy衍生物抑制EphA4信号转导的能力。将大鼠海马体神经元以每孔6000个细胞接种到包被有聚D-赖氨酸(50μg/mL)的48孔板上。将神经元与补充有2％B27(英杰公司)的Neurobasal培养基(英杰公司)一起孵育。将神经元(3DIV)用Rhy或Rhy衍生物预处理20分钟，继而用预聚簇的肝配蛋白-A1(0.25μg/mL)配体再处理40分钟，并且用4％多聚甲醛固定。然后将神经元用抗EphA4抗体和抗τ-1抗体进行免疫染色。使用IN Cell Analyzer 6000高内涵测定系统(通用电气医疗公司(GE Healthcare))对EphA4聚簇体进行细胞成像和定量。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例来定量EphA4聚簇体。使用单因素方差分析，继而使用纽曼-柯尔斯多重比较检验(Prism 5GraphPad软件)进行统计分析。
[0264] Rhy的分析检测
[0265] 使用Waters Acquity UPLC系统联同装备有turbo V源和电喷雾电离(ESI)探针的AB SCIEX 4500QTRAP系统(UPLC-MS/MS)分析Rhy的身份和量。在C18柱(BEH C18，50×2.1mm，1.7μm，40℃)上使用由含0.1％甲酸的水和乙腈(ACN)组成的流动相分离ACN中的Rhy。将五微升的样品注入并且通过下列程序以0.6毫升/分钟的流速洗脱：0分钟-4.0分钟，
10％-35％的ACN；4.0分钟-4.1分钟，100％的ACN；7.0分钟-7.1分钟，100％-10％的ACN；7.1分钟-10分钟，10％的ACN。使用正电离模式对Rhy进行检测。ESI条件如下：去聚簇电位：
120V，入口电位：10V，碰撞池出口电位：12V，碰撞能：38V，气帘气：50(任意单位)，碰撞气：10(任意单位)，离子喷雾电压：4500kV，源温：500℃，离子源气体：1:45(任意单位)，离子源气体：2:60(任意单位)。使用多反应监测(MRM)以在m/z 385.1→353.1、385.1→269.1、385.1→160.1通过三对母离子/子离子确定和测量Rhy。在这种条件下，Rhy的保留时间是2.56分钟。
10％-35％的ACN；4.0分钟-4.1分钟，100％的ACN；7.0分钟-7.1分钟，100％-10％的ACN；7.1分钟-10分钟，10％的ACN。使用正电离模式对Rhy进行检测。ESI条件如下：去聚簇电位：
120V，入口电位：10V，碰撞池出口电位：12V，碰撞能：38V，气帘气：50(任意单位)，碰撞气：10(任意单位)，离子喷雾电压：4500kV，源温：500℃，离子源气体：1:45(任意单位)，离子源气体：2:60(任意单位)。使用多反应监测(MRM)以在m/z 385.1→353.1、385.1→269.1、385.1→160.1通过三对母离子/子离子确定和测量Rhy。在这种条件下，Rhy的保留时间是2.56分钟。
[0266] Rhy的体外稳定性测定
[0267] 将于乙腈(ACN)中的3μM Rhy添加到由C57Bl/6小鼠制备的血清中，并且以各个时间间隔孵育混合物。通过添加ACN终止孵育。将混合物短暂离心并且将一半上清液空气干燥。将残余物重新溶解在ACN中并且注入到UPLC-MS/MS系统中。
[0268] Rhy的血液和脑穿透测定
[0269] 从香港科技大学(HKUST)动物护理机构获得雄性C57Bl/6小鼠(16周大)并且在研究之前一周在实验室中适应。将Rhy(5mg/mL)溶解在水中并且以10mL/kg的体积经口给予50mg/kg。这一研究中的程序是由HKUST动物伦理委员会(Animal Ethics Committee)批准的并且根据实验用动物实施和使用守则(Code ofPractice and Use ofAnimals
forExperimental Purpose)进行的。
forExperimental Purpose)进行的。
[0270] 在Rhy施用之后以不同的时间间隔(0分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、240分钟、480分钟)采集末梢血(K2EDTA管)和脑组织(n＝6)。通过在4℃将血液以3,800×g离心10分钟以获得血浆。在使用0.9％盐水进行30分钟心脏灌注之后采集小鼠脑。使用瓷珠以4000rpm将添加有80μL的0.9％盐水的整个小鼠脑进行匀浆10秒(Precellys Minilys)。然后将接受Rhy施用的小鼠或含有20μL所需浓度(2.5-500ng/mL范围内的9个数据点)的Rhy的血浆(80μL)和脑匀浆用约1mL甲醇提取并且涡旋3分钟。在4℃将样品以12,000×g离心10分钟。将上清液转移到新的管中并且再对剩余样品进行提取。将由两次提取获得的上清液汇集并且蒸发至干燥。将干燥的样品溶解在0.3mL甲醇中，涡旋30秒，继而超声处理5分钟并且以17,900×g离心5分钟。将上清液(80μL)转移到小瓶中以进行UPLC-MS/MS分析。使用软件PhoenixWinNonlin 6.3计算Rhy在小鼠血浆和脑中的Cmax、Tmax以及t1/2。Rhy由小鼠血浆和脑的回收率分别是82％和68％。血浆和脑中Rhy的标准曲线的R2值分别是0.9987和0.9963。
[0271] 实施例6：钩藤碱和补骨脂异黄酮在培养的海马体神经元中抑制肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体
[0272] 已经证实钩藤碱(Rhy)和补骨脂异黄酮(Cory)是EphA4抑制剂。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy和Cory在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Cory预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例来定量EphA4聚簇体。如图16中所示，Rhy和Cory减少了培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇。
[0273] 实施例7：Rhy的新型衍生物RHY-26和RHY-37表现出更强效的EphA4抑制
[0274] 使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy和它的衍生物在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。通过计算轴突上EphA4聚簇体的总面积相对于τ蛋白阳性面积的比例来定量EphA4聚簇体。如图17中所示，Rhy和它的衍生物以剂量依赖性方式显著地减少了培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇。新型衍生物RHY-26和RHY-37对EphA4聚簇体的抑制作用分别是Rhy的5倍和12倍。
[0275] 实施例8：新型化合物RHY-26在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用
[0276] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的氯基取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-22(5-亚甲基连接基团)、以及RHY-26(8-亚甲基连接基团)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(30μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图18中所示，当与Rhy相比时，具有氯取代基的衍生物使培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇减少了约40％-80％，这表明添加通过亚甲基与Rhy的N1位点连接的氯基允许提高在EphA4抑制方面的效能。还在相同的测定系统中测试和验证了RHY-61(3-亚甲基连接基团)、RHY-62(9-亚甲基连接基团)、RHY-63(6-亚甲基连接基团)、RHY-64(7-亚甲基连接基团)、RHY-65(10-亚甲基连接基团)、RHY-66(11-亚甲基连接基团)、以及RHY-67(12-亚甲基连接基团)作为EphA4抑制剂的效能。
[0277] 实施例9：新型化合物RHY-37、RHY-39、RHY-43、RHY-56在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用
[0278] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的3,4-二甲氧基-苯氧基取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-39(6-亚甲基连接基团)、RHY-43(7-亚甲基连接基团)、RHY-37(8-亚甲基连接基团)、以及RHY-56(9-亚甲基连接基团)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(30μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图19中所示，当与Rhy相比时，RHY-39、RHY-43和RHY-37以及RHY-56使培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇显著减少了约70％-80％，这表明在Rhy的N1位点处添加6个至9个亚甲基连接的3,4-二甲氧基-苯氧基允许提高在EphA4抑制方面的效能。
[0279] 实施例10：新型化合物RHY-38、RHY-36、RHY-57在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用
[0280] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的二甲氧基苯甲酸酯取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-33(6-亚甲基连接基团)、RHY-38(7-亚甲基连接基团)、RHY-36(8-亚甲基连接基团)、以及RHY-57(9-亚甲基连接基团)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(50μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图20中所示，具有这种修饰的所有化合物使培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇减少了约20％-80％。RHY-38、RHY-36以及RHY-57比Rhy表现出更强效的活性，并且RHY-33显示出与Rhy相当的效能，这表明添加6-9个亚甲基连接的二甲氧基苯甲酸酯允许维持或提高在EphA4抑制方面的效能。
[0281] 实施例11：新型化合物RHY-54和RHY-60在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用
[0282] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的二甲氧基苯甲酸酯取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-48(7-亚甲基连接基团)、RHY-54(8-亚甲基连接基团)以及RHY-60(9-亚甲基连接基团)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或衍生物(30μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图21中所示，具有这一修饰基团的化合物对肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇显示出抑制作用，RHY-54和RHY60比Rhy显著更强效，RHY-48显示出与Rhy相当的效能，这表明在Rhy的N1处添加亚甲基连接的羟基-苯氧基允许维持或提高在EphA4抑制方面的效能。
[0283] 实施例12：新型化合物RHY-40、RHY-45、RHY-50、RHY-59在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用
[0284] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的甲氧基-硝基苯甲酸酯或甲氧基-苯基丙烯酸取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-40(6-亚甲基连接基团)、RHY-45(7-亚甲基连接基团)、RHY-50(8-亚甲基连接基团)、RHY-58以及RHY-59(9-亚甲基连接基团)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(30μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图22中所示，所有化合物均使培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇减少了约30％-60％。当与Rhy相比时，RHY-40、RHY-45、RHY-50以及RHY-59是更强效的，这表明在Rhy的N1位点处添加亚甲基连接的甲氧基-硝基苯甲酸酯或甲氧基-苯基丙烯酸允许提高在EphA4抑制方面的效能。
[0285] 实施例13：新型化合物RHY-42、RHY-44、RHY-49以及RHY-55表现出EphA4抑制活性[0286] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的苯甲氧基-苯氧基取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-42(6-亚甲基连接基团)、RHY-44(7-亚甲基连接基团)、RHY-49(8-亚甲基连接基团)、以及RHY-55(9-亚甲基连接基团)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(30μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图23中所示，具有这种修饰的化合物使培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇减少了约40％-60％，这表明添加亚甲基连接的苯甲氧基-苯氧基允许提高在EphA4抑制方面的效能。
[0287] 实施例14：具有溴取代基的新型RHY衍生物在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用
[0288] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的溴基取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-23(5-亚甲基连接基团)、RHY-27(6-亚甲基连接基团)、RHY-35(7-亚甲基连接基团)、RHY-34(8-亚甲基连接基团)、以及RHY-31(9-亚甲基连接基团)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(30μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图24中所示，当与Rhy相比时，在Rhy的N1位点处用溴基进行修饰使培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇减少了约50％-70％，这表明在Rhy的N1位点处添加5-9个亚甲基连接的溴基允许提高在EphA4抑制方面的效能。
[0289] 实施例15：具有含有氨基的取代基的新型RHY衍生物在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用
[0290] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的吡咯烷-1-基-乙氨基或咪唑-1-基-丙氨基取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-41(6-亚甲基连接基团)、RHY-46(7-亚甲基连接基团)、RHY-53(8-亚甲基连接基团)、或RHY-47(7-亚甲基连接基团)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(50μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图25中所示，在Rhy的N1位点处用吡咯烷-1-基-乙氨基或咪唑-1-基-丙氨基进行修饰使培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇减少了约40％-50％，这表明添加与5-9个亚甲基连接的部分的这些基团允许提高在EphA4抑制方面的效能。还在相同的测定系统中测试和验证了RHY-53(8-亚甲基连接基团)作为EphA4抑制剂的效能。
[0291] 实施例16：具有氨基-己基氨基的新型RHY衍生物在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用
[0292] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的氨基-己基氨基取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-24(5-亚甲基连接基团)、以及RHY-32(9-亚甲基连接基团)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(50μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图26中所示，在Rhy的N1位点处用氨基-己基氨基进行修饰使培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇减少了约20％，这表明添加5-9个或6-9个亚甲基连接的氨基-己基氨基允许维持或提高在EphA4抑制方面的效能。
[0293] 实施例17：新型RHY-51和RHY-52在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用[0294] 已经通过将N1位点用由亚甲基连接的碘-苯甲酸酯或碘-溴-苯甲酸酯取代而由Rhy修饰得到一组化合物。使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定来研究Rhy、RHY-51(具有8-亚甲基连接基团的碘-苯甲酸酯)、以及RHY-52(具有8-亚甲基连接基团的碘-溴-苯甲酸酯)在抑制EphA4介导的细胞功能方面的作用。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(30μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图27中所示，在Rhy的N1位点处进行的这些修饰使培养的海马体神经元中肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇减少了约20％-70％，这表明添加与亚甲基连接的部分的这些基团允许维持或提高在EphA4抑制方面的效能。
[0295] 实施例18：对Rhy的N1进行的修饰在EphA4抑制方面比Rhy表现出更强效的作用[0296] 使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定研究由Rhy修饰的在N1位点处被以下基团取代的一组化合物抑制EphA4介导的细胞功能的能力：4-苯甲酰基-苯甲基(RHY-21)、3-氯-苯甲基(RHY-19)、甲基(RHY-18)、4-甲基-苯甲基(RHY-11)、4-甲氧基-苯甲基(RHY-12)、联苯-2-基甲基(RHY-10)、2,6-二氯-苯甲基(RHY-8)、4-溴-苯甲基(RHY-5)、苯甲酰基(RHY-30)、(4-甲氧基-苯基)-乙酮(RHY-28)、烯丙基(RHY-17)、苯基-烯丙基(RHY-9)、吡啶-2-基甲基(RHY-15)、吡啶-3-基甲基(RHY-14)、或吡啶-4-基甲基(RHY-16)。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(50μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图28中所示，所有化合物均对EphA4聚簇体形成显示出抑制作用，其中RHY-10、RHY-28、RHY-9、RHY-19、RHY-5、RHY-17是最显著的。
[0297] 实施例19：新型化合物RHY-13、RHY-6、RHY-1、RHY-7与Rhy相比显著地减少了EphA4聚簇体
[0298] 使用肝配蛋白-A1诱导的EphA4聚簇体测定研究由Rhy修饰的一组化合物抑制EphA4介导的细胞功能的能力，所述化合物在N1位点处被甲基-(RHY-13)、苯甲基-(RHY-6)、甲氧基-苯甲基(RHY-1)、叔丁基-苯甲基(RHY-7)取代或生物素化-(RHY-25、RHY-2、RHY-3)、二聚-(RHY-29)、在C23处二甲基化(RHY-4)。将神经元用Rhy或Rhy衍生物(50μM)预处理20分钟，然后继而再用预聚簇的肝配蛋白-A1处理40分钟。将神经元用EphA4抗体和τ-1抗体染色。如图29中所示，所有化合物均对EphA4聚簇体形成显示出抑制作用，其中RHY-13、RHY-6、RHY-1以及RHY-7是最显著的。
[0299] 实施例20：在经口施用之后Rhy在脑和血浆中是可检测的
[0300] Rhy的药理活性促使对Rhy在全身施用之后在脑或血浆中的可及性或稳定性进行研究。为了研究Rhy的稳定性，首先在将所述化合物与小鼠血清一起孵育之后以不同的时间间隔测量剩余Rhy的量。通过HPLC-MS/MS分析测定Rhy的浓度。以多反应监测模式用三对母离子-产物离子峰在约2.56分钟的保留时间检测到Rhy。发现在最初60分钟内Rhy的浓度在血清中保持相对不变并且在360分钟孵育时间段内减少了约20％(图30A)。
[0301] 随后，研究在经口施用之后Rhy是否可以在小鼠血浆和脑中被检测到。在以50mg/kg(于10mL/kg中)单次经口施用之后以各个时间间隔从小鼠的血浆和缓冲盐水灌注的脑中提取Rhy。在施用之后10分钟时在血浆和脑这两者中容易检测到Rhy(图30B)。Rhy在血浆中的浓度在约0.5小时之时达到峰值(Tmax＝30.84分钟±2.52分钟，Cmax＝583.20ng/mL±32.86ng/mL)并且在约1.5小时之时减少了50％(t1/2＝81.12分钟±12.06分钟)。在脑中，Rhy的水平在约1小时之时达到峰值(Tmax＝55.02分钟±9.18分钟，Cmax＝442.73±27.38ng/脑)，t1/2是约2小时(107.22分钟±27.30分钟)(图30C)。在施用3小时之后，在血浆和脑这两者中Rhy的水平下降到Cmax的10％。综上所述，证实在经口施用之后，Rhy从消化系统快速地进入体循环中并且在血液中被检测到。此外，所述化合物可以穿过血脑屏障并且在小鼠脑组织中被检测到。
[0302] 实施例21：补骨脂异黄酮在AD小鼠模型中恢复了正常的LTP诱导
[0303] 在LTP测量之前，通过每日灌胃向野生型小鼠和APP/PS1突变(Tg)小鼠经口施用补骨脂异黄酮(于水中10mg/mL)，持续3-4周。测量海马体的SC通路的CA1区中由3串HFS(100Hz，持续1秒，相隔30秒递送)诱导的LTP。LTP的量值被定量为在LTP诱导之后在60分钟时间间隔期间所获得的fEPSP斜率的变化百分比(10％-90％)。如图31中所示，与野生型小鼠(黑色迹线)相比，在Tg小鼠(绿色迹线)中观测到受损的LTP。50mg/kg或100mg/kg的补骨脂异黄酮的处理解除了Tg小鼠的LTP损伤并且恢复到与对照小鼠相当的水平。
[0304] 实施例22：Rhy施用提高了APP/PS1小鼠的海马体中的成年神经发生。
[0305] 向APP/PS1小鼠经口施用Rhy(50mg/kg)，持续超过三个月。将小鼠脑切片并且用Ki67抗体染色，所述Ki67抗体标记细胞周期中的所有细胞，但是不标记那些分化的祖细胞和新生的神经元。如图32中所示，与经过对照处理的小鼠相比，Rhy(R1)施用增加了APP/PS1小鼠的海马体的齿状回中Ki-67+神经祖细胞的数目。
[0306] 本申请中所引用的包括基因库登录号在内的所有专利、专利申请、以及其它出版物出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
[0307] 参考文献
[0308] 1.Selkoe,D.J.Alzheimer's disease is a synaptic failure.Science 298,789-791(2002).
[0309] 2.Walsh,D.M.,et al.Naturally secreted oligomers ofamyloid[beta]protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.Nature
416,535-539(2002).
416,535-539(2002).
[0310] 3.Shankar,G.M.,et al.Amyloid-[beta]protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory.NatMed 14,837-842(2008).
[0311] 4.Huang,Y.&Mucke,L.Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies.Cell 148,1204-1222(2012).
[0312] 5.Lacor,P.N.,et al.Synaptic Targeting by Alzheimer's-Related AmyloidβOligomers.The Journal of Neuroscience 24,10191-10200(2004).
[0313] 6.Ting,J.T.,Kelley,B.G.,Lambert,T.J.,Cook,D.G.&Sullivan,J.M.Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms.Proc NatlAcadSci USA 104,353-358(2007).
[0314] 7.Koffie,R.M.,et al.Oligomeric amyloidβassociates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques.Proceedings of the National Academy of Sciences 106,4012-4017(2009).[0315] 8.Shankar,G.M.,et al.Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway.JNeurosci 27,2866-2875(2007).
[0316] 9.Li,S.,et al.Soluble Oligomers of AmyloidβProtein Facilitate Hippocampal Long-Term Depression by Disrupting Neuronal Glutamate
Uptake.Neuron 62,788-801(2009).
Uptake.Neuron 62,788-801(2009).
[0317] 10.Hsieh,H.,et al.AMPAR Removal Underlies Aβ-Induced Synaptic Depression and Dendritic Spine Loss.Neuron 52,831-843(2006).
[0318] 11.Venkitaramani,D.V.,et al.β-Amyloid Modulation of Synaptic Transmission and Plasticity.The Journal of Neuroscience 27,11832-11837(2007).[0319] 12.Snyder,E.M.,et al.Regulation ofNMDA receptor trafficking by
amyloid-beta.NatNeurosci 8,1051-1058(2005).
amyloid-beta.NatNeurosci 8,1051-1058(2005).
[0320] 13.Renner,M.,et al.Deleterious Effects ofAmyloidβOligomers Acting as an Extracellular Scaffold for mGluR5.Neuron 66,739-754(2010).
[0321] 14.Zhao,W.-Q.,et al.Insulin Receptor Dysfunction Impairs Cellular Clearance of Neurotoxic Oligomeric Aβ.Journal ofBiological Chemistry 284,18742-18753(2009).
[0322] 15.Cisse,M.,et al.Reversing EphB2 depletion rescues cognitive functions inAlzheimer model.Nature 469,47-52(2011).
[0323] 16.Klein,R.Bidirectional modulation of synaptic functions by Eph/ephrin signaling.NatNeurosci 12,15-20(2009).
[0324] 17.Chen,Y.,Fu,A.K.&Ip,N.Y.Bidirectional signaling ofErbB and Eph receptors at synapses.Neuron Glia Biol 4,211-221(2008).
[0325] 18.Pasquale,E.B.Eph-ephrin bidirectional signaling in physiology and disease.Cell 133,38-52(2008).
[0326] 19.Sheffler-Collins,S.I.&Dalva,M.B.EphBs:an integral link between synaptic function and synaptopathies.Trends in Neurosciences 35,293-304(2012).
[0327] 20.Dalva,M.B.,et al.EphB receptors interact with NMDA receptors and regulate excitatory synapse formation.Cell 103,945-956(2000).
[0328] 21.Murai,K.K.&Pasquale,E.B.Eph receptors and ephrins in neuron-astrocyte communication at synapses.Glia 59,1567-1578(2011).
[0329] 22.Pasquale,E.B.Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour.NatRevMol CellBiol 6,462-475(2005).
[0330] 23.Bourgin,C.,Murai,K.K.,Richter,M.&Pasquale,E.B.The EphA4 receptor regulates dendritic spine remodeling by affecting beta1-integrin signaling pathways.JCellBiol 178,1295-1307(2007).
[0331] 24.Fu,W.Y.,et al.Cdk5 regulates EphA4-mediated dendritic spine retraction through an ephexin1-dependent mechanism.Nat Neurosci 10,67-76(2007).
[0332] 25.Richter,M.,Murai,K.K.,Bourgin,C.,Pak,D.T.&Pasquale,E.B.The EphA4 receptor regulates neuronal morphology through SPAR-mediated inactivation of Rap GTPases.J Neurosci 27,14205-14215(2007).
[0333] 26.Chen,Y.,Fu,A.K.Y.&Ip,N.Y.Eph receptors at synapses:Implications in neurodegenerative diseases.Cellular Signalling 24,606-611(2012).
[0334] 27.Fu,A.K.,et al.APC(Cdh1)mediates EphA4-dependent downregulation of AMPA receptors in homeostatic plasticity.Nat Neurosci 14,181-189(2011).[0335] 28.Simon,A.M.,et al.Early changes in hippocampal Eph receptors precede the onset of memory decline in mouse models of Alzheimer's
disease.JAlzheimers Dis 17,773-786(2009).
disease.JAlzheimers Dis 17,773-786(2009).
[0336] 29.Murai,K.K.,Nguyen,L.N.,Irie,F.,Yamaguchi,Y.&Pasquale,E.B.Control of hippocampal dendritic spine morphology through ephrin-A3/EphA4 signaling.NatNeurosci 6,153-160(2003).
[0337] 30.Sheng,M.,Sabatini,B.L.&Sudhof,T.C.Synapses and Alzheimer's disease.ColdSpringHarb PerspectBiol 4(2012).
[0338] 31.Jacobsen,J.S.,et al.Early-onset behavioral and synaptic deficits in a mouse model of Alzheimer's disease.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103,5161-5166(2006).
[0339] 32.Bowden,T.A.,et al.Structural Plasticity of Eph Receptor A4Facilitates Cross-Class Ephrin Signaling.Structure 17,1386-1397(2009).[0340] 33.Murai,K.K.,et al.Targeting the EphA4 receptor in the nervous system with biologically active peptides.Mol Cell Neurosci 24,1000-1011(2003).
[0341] 34.Lacor,P.N.,et al.Abeta oligomer-induced aberrations in synapse composition,shape,and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimer's disease.J Neurosci 27,796-807(2007).
[0342] 35.Noberini,R.,et al.Small molecules can selectively inhibit ephrin binding to the EphA4 and EphA2 receptors.J Biol Chem 283,29461-29472(2008).[0343] 36.Lambert,M.P.,et al.Diffusible,nonfibrillar ligands derived from Aβ1-42 are potent central nervous system neurotoxins.Proceedings of the
NationalAcademy of Sciences 95,6448-6453(1998).
NationalAcademy of Sciences 95,6448-6453(1998).
[0344] 37.Qin,H.,et al.Structural characterization of the EphA4-Ephrin-B2 complex reveals new features enabling Eph-ephrin binding promiscuity.J Biol Chem 285,644-654(2010).
[0345] 38.Singla,N.,et al.Crystal structure of the ligand-binding domain of the promiscuous EphA4 receptor reveals two distinct conformations.Biochemical and Biophysical Research Communications 399,555-559(2010).
[0346] 39.Qin,H.,Shi,J.,Noberini,R.,Pasquale,E.B.&Song,J.Crystal structure and NMR binding reveal that two small molecule antagonists target the high affinity ephrin-binding channel of the EphA4 receptor.J Biol Chem 283,29473-29484(2008).
[0347] 40.Zhou,J.&Zhou,S.Antihypertensive and neuroprotective activities of rhynchophylline:The role of rhynchophylline in neurotransmission and ion channel activity.Journal of Ethnopharmacology 132,15-27(2010).
[0348] 41.Noberini,R.,Koolpe,M.,Lamberto,I.&Pasquale,E.B.Inhibition of Eph receptor-ephrin ligand interaction by tea polyphenols.PharmacolRes 66,363-373(2012).
[0349] 42.Cameron,B.&Landreth,G.E.Inflammation,microglia,and Alzheimer's disease.NeurobiolDis 37,503-509(2010).
[0350] 43.Shen,L.,et al.Whole genome association study ofbrain-wide imaging phenotypes for identifying quantitative trait loci in MCI and AD:A study ofthe ADNI cohort.NeuroImage 53,1051-1063(2010).
[0351] 44.Logue,M.W.,et al.A comprehensive genetic association study of Alzheimer disease in African Americans.Arch Neurol 68,1569-1579(2011).
[0352] 45.Carmona,M.A.,Murai,K.K.,Wang,L.,Roberts,A.J.&Pasquale,E.B.Glial ephrin-A3 regulates hippocampal dendritic spine morphology and glutamate transport.Proc Natl Acad Sci U S A 106,12524-12529(2009).
[0353] 46.Filosa,A.,et al.Neuron-glia communication via EphA4/ephrin-A3 modulates LTP through glial glutamate transport.Nat Neurosci 12,1285-1292(2009).
[0354] 47.Palop,J.J.&Mucke,L.Amyloid-beta-induced neuronal dysfunction in Alzheimer's disease:from synapses toward neural networks.Nat Neurosci 13,812-818(2010).
[0355] 48.Zhou,L.,et al.EphA4 signaling regulates phospholipase Cgamma1 activation,cofilin membrane association,and dendritic spine morphology.JNeurosci 27,5127-5138(2007).
[0356] 49.Masliah,E.,et al.Abnormal Glutamate Transport Function in Mutant Amyloid Precursor Protein Transgenic Mice.Experimental Neurology 163,381-387(2000).
[0357] 50.Munro,K.M.,Perreau,V.M.&Turnley,A.M.Differential gene expression in the EphA4 knockout spinal cord and analysis of the inflammatory response following spinal cord injury.PLoS One 7,e37635(2012).
[0358] 51.Noberini,R.,Lamberto,I.&Pasquale,E.B.Targeting Eph receptors with peptides and small molecules:progress and challenges.Semin CellDev Biol 23,51-57(2012).
[0359] 52.Lamberto,I.,et al.Distinctive binding of three antagonistic peptides to the ephrin-binding pocket of the EphA4 receptor.Biochem J 445,47-
56(2012).
56(2012).
[0360] 53.Van Hoecke,A.,et al.EPHA4 is a disease modifier of amyotrophic lateral sclerosis in animal models and in humans.Nat Med 18,1418-1422(2012).[0361] 54.Goldshmit,Y.,et al.EphA4 blockers promote axonal regeneration and functional recovery following spinal cord injury in mice.PLoS One 6,e24636(2011).
[0362] 55.Kang,T.H.,et al.Rhynchophylline and isorhynchophylline inhibit NMDA receptors expressed in Xenopus oocytes.EurJPharmacol 455,27-34(2002).[0363] 56.Kang,T.H.,et al.Protective effect of rhynchophylline and isorhynchophylline on in vitro ischemia-induced neuronal damage in the hippocampus:putative neurotransmitter receptors involved in their action.Life Sci 76,331-343(2004).
[0364] 57.Kawakami,Z.,Ikarashi,Y.&Kase,Y.Isoliquiritigenin is a novel NMDA receptor antagonist in kampo medicine yokukansan.Cell MolNeurobiol 31,1203-1212(2011).
[0365] 58.Shen,Y.,Fu,W.-Y.,Cheng,E.Y.L.,Fu,A.K.Y.&Ip,N.Y.Melanocortin-4 Receptor Regulates Hippocampal Synaptic Plasticity through a Protein Kinase A-Dependent Mechanism.The Journal of Neuroscience 33,464-472(2013).
[0366] 59.Lambert,M.P.,et al.Vaccination with soluble Aβoligomers generates toxicity-neutralizing antibodies.Journal ofNeurochemistry 79,595-605(2001).[0367] 60.Klein,W.L.Aβtoxicity in Alzheimer's disease:globular oligomers(ADDLs)as new vaccine and drug targets.Neurochemistry International 41,345-352(2002).
[0368] 61.Shi,L.,et al.Alpha2-chimaerin interacts with EphA4 and regulates EphA4-dependent growth cone collapse.Proc Natl Acad Sci U S A 104,16347-16352(2007).
[0369] 62.Morris,G.M.,et al.AutoDock4 and AutoDockTools4:Automated docking with selective receptor flexibility.J Comput Chem 30,2785-2791(2009).
[0370] 63.Morris,G.M.,et al.Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function.Journal ofComputational Chemistry 19,1639-1662(1998).
[0371] 64.Huey,R.,Morris,G.M.,Olson,A.J.&Goodsell,D.S.A semiempirical free energy force field with charge-based desolvation.Journal ofComputational Chemistry 28,1145-1152(2007).
[0372] 65.Thomas-Crusells,J.,Vieira,A.,Saarma,M.&Rivera,C.A novel method for monitoring surface membrane trafficking on hippocampal acute slice preparation.J Neurosci Methods 125,159-166(2003).
[0373] 66.Wan,J.,et al.Tyk2/STAT3 signaling mediates beta-amyloid-induced neuronal cell death:implications in Alzheimer's disease.JNeurosci 30,6873-6881(2010).
[0374] 67.Bouvier,D.,et al.EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.JNeurochem 113,153-165(2010).
[0375] 68.Sala,C.,et al.Inhibition ofdendritic spine morphogenesis and synaptic transmission by activity-inducible protein Homer1a.J Neurosci 23,6327-6337(2003).
[0376] 69.Massa,S.M.,et al.Small molecule BDNF mimetics activate TrkB signaling and prevent neuronal degeneration in rodents.J Clin Invest 120,
1774-1785(2010).
1774-1785(2010).
[0377] 70.Jo,J.,et al.A[beta]1-42 inhibition of LTP is mediated by a signaling pathway involving caspase-3,Akt1 and GSK-3[beta].Nat Neurosci 14,
545-547(2011).
545-547(2011).
[0378] 表1
[0379]
[0380]
[0381] 表2
[0382]
[0383] 表3
[0384]
[0385]