本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的5‑羟色氨酸甲酯衍生物及其制备方法和应用，具体为5‑羟基‑N‑[[1‑(4‑叔丁基苯甲基)‑1H‑1,2,3‑三氮唑‑4‑基]羰基]‑D‑色氨酸甲酯，其结构式为：。本发明还公开了该具有抗肿瘤活性的5‑羟色氨酸甲酯衍生物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明合成的化合物有良好的体外抗肿瘤细胞增殖活性，对TE‑1、MGC803、HCT116细胞生长均受到较明显的抑制，可作为抗肿瘤药物或先导化合物进一步开发。
1.具有抗肿瘤活性的5-羟色氨酸甲酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中抗肿瘤药物由5-羟色氨酸甲酯衍生物和药学上可接受的载体或赋形剂制备而成，肿瘤细胞为食管鳞癌细胞TE-1、人胃癌细胞MGC803或人结肠癌细胞HCT116，5-羟色氨酸甲酯衍生物的结构式为：；
具体过程为：取对数生长期的人食管鳞癌细胞TE-1、人胃癌细胞MGC803、人结肠癌细胞HCT116以6×103个/孔接种至96孔板中，培养24h后将培养基更换为含5-羟色氨酸甲酯衍生物的培养基，每个样品9个浓度，分别为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL，设空白对照组，继续培养72h，培养结束后，加MTT 20μL每孔，四个小时后甩掉培养基，每孔加150mL DMSO，震荡均匀后酶标仪490nm波长测其OD值，根据OD值利用SPSS软件计算化合物的IC50值，5-羟色氨酸甲酯衍生物作用72h后，TE-1、MGC803、HCT116细胞生长均受到较明显的抑制，对应的IC50值分别为10.106μg/mL、9.836μg/mL、
所述5-羟色氨酸甲酯衍生物的具体合成过程为：首先将4-叔丁基苄溴与叠氮化钠反应生成4-叔丁基苄基叠氮，该4-叔丁基苄基叠氮与丙炔酸甲酯发生Click反应制得N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸甲酯，N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-
4-羧酸甲酯脱去甲氧基制得N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸，最后在N,N-二甲基甲酰胺、三乙胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三氮唑中，将5-羟色氨酸甲酯和N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸缩合制得目标产物5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述5-羟色氨酸甲酯衍生物的具体合成步骤为：
（1）在500mL三颈瓶中加入44g 5-羟色氨酸和350mL甲醇，降温至-5℃滴加17.4mL氯化亚砜，滴加完毕后升温至35℃反应过夜，TLC检测原料消失停止反应，减压蒸馏除去甲醇，冷却后加入300mL乙酸乙酯搅拌，抽滤，烘干得到灰白色固体5-羟色氨酸甲酯；
（2）将2.27g 4-叔丁基苄溴溶解在10mL二甲基甲酰胺中，冰浴条件下加入0.975g叠氮化钠，室温条件下搅拌过夜，TLC检测原料消失停止反应，反应结束后加水溶解，依次用等量的乙酸乙酯进行萃取，分出有机层，用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩得到油状液体4-叔丁基苄基叠氮；
（3）将926.1mg 4-叔丁基苄基叠氮和0.295mL丙炔酸甲酯溶解于5mL体积比为1:1的四氢呋喃和水的混合溶液中，冰浴条件下加入392mg催化剂硫酸铜和970.7mg左旋抗坏血酸钠，在室温条件下反应5h，TLC检测原料消失停止反应，反应结束后加水溶解，依次用等量的乙酸乙酯进行萃取，分出有机层，用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，蒸去溶剂后得到淡黄色结晶性粉末N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸甲酯；
（4）将530.3mg N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸甲酯溶解于7mL体积比为4:2:1四氢呋喃、甲醇和水的混合溶液中，加入93mg氢氧化锂，室温条件下搅拌过夜，TLC检测原料消失停止反应，反应物加水溶解后，用盐酸溶液调节反应溶液的pH值至弱酸性，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相用水洗涤1次，饱和食盐水萃取1次，无水硫酸钠干燥，抽滤旋干得到棕色晶体N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸；
（5）将315mg N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸溶解于5mL二甲基甲酰胺中，再加入363mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、249mg 1-羟基苯并三氮唑和0.4mL三乙胺，然后加入345.5mg 5-羟色氨酸甲酯，室温条件下搅拌过夜，TLC检测原料消失停止反应，反应物加水溶解后，用盐酸溶液调节反应溶液的pH值至中性，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相用水洗涤1次，饱和食盐水萃取1次，无水硫酸钠干燥，抽滤旋干，然后用体积比为6:1的二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶液过硅胶柱色谱分离得到浅棕色晶体粉末5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯。
具有抗肿瘤活性的5-羟色氨酸甲酯衍生物及其制备方法和
应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的5-羟色氨酸甲酯衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 恶性肿瘤是危害人类健康的重要疾病，其死亡率是仅次于心脑血管疾病的第二大疾病。目前恶性肿瘤的主要治疗方法仍以外科手术治疗为主，化疗、放疗、基因治疗及其他生物治疗等综合治疗为辅，但治疗效果仍不够理想，其中放疗和化疗是极其重要的非手术疗法，但是放疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时也对机体正常细胞产生严重损害。由于药物本身缺乏靶向性，因而使肿瘤部位药物有效浓度降低，全身毒副作用增强，出现治愈率低，多药耐药性、毒副作用大等治疗问题。因此我国已把抗癌药物的研究列为新药开发的最重要的战略性课题之一，研究新型具有高效、低毒和高选择性的抗癌药物成为我们长期的目标和任务。
发明内容
[0003] 本发明解决的技术问题是提供了一种操作简单易行、原料廉价易得、反应效率较高且重复性好的具有抗肿瘤活性的5-羟色氨酸甲酯衍生物及其制备方法，制得的5-羟色氨酸甲酯衍生物能够用于制备抗癌药物。
[0004] 本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，具有抗肿瘤活性的5-羟色氨酸甲酯衍生物，其特征在于该5-羟色氨酸甲酯衍生物为5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯，其结构式为：
[0005] 。
[0006] 本发明所述的具有抗肿瘤活性的5-羟色氨酸甲酯衍生物的制备方法，其特征在于具体步骤为：首先将4-叔丁基苄溴与叠氮化钠反应生成4-叔丁基苄基叠氮，该4-叔丁基苄基叠氮与丙炔酸甲酯发生Click反应制得N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸甲酯，N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸甲酯脱去甲氧基制得N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸，最后在N,N-二甲基甲酰胺、三乙胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三氮唑中，将5-羟色氨酸甲酯和N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸缩合制得目标产物5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯。
[0007] 进一步限定，所述的具有抗肿瘤活性的5-羟色氨酸甲酯衍生物的制备方法，其特征在于具体步骤为：
[0008] （1）在500mL三颈瓶中加入44g 5-羟色氨酸和350mL甲醇，降温至-5℃滴加17.4mL氯化亚砜，滴加完毕后升温至35℃反应过夜，TLC检测原料消失停止反应，减压蒸馏除去甲醇，冷却后加入300mL乙酸乙酯搅拌，抽滤，烘干得到灰白色固体5-羟色氨酸甲酯；
[0009] （2）将2.27g 4-叔丁基苄溴溶解在10mL二甲基甲酰胺中，冰浴条件下加入0.975g叠氮化钠，室温条件下搅拌过夜，TLC检测原料消失停止反应，反应结束后加水溶解，依次用等量的乙酸乙酯进行萃取，分出有机层，用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩得到油状液体4-叔丁基苄基叠氮；
[0010] （3）将926.1mg 4-叔丁基苄基叠氮和0.295mL丙炔酸甲酯溶解于5mL体积比为1:1的四氢呋喃和水的混合溶液中，冰浴条件下加入392mg催化剂硫酸铜和970.7mg左旋抗坏血酸钠，在室温条件下反应5h，TLC检测原料消失停止反应，反应结束后加水溶解，依次用等量的乙酸乙酯进行萃取，分出有机层，用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，蒸去溶剂后得到淡黄色结晶性粉末N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸甲酯；
[0011] （4）将530.3mg N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸甲酯溶解于7mL体积比为4:2:1四氢呋喃、甲醇和水的混合溶液中，加入93mg氢氧化锂，室温条件下搅拌过夜，TLC检测原料消失停止反应，反应物加水溶解后，用盐酸溶液调节反应溶液的pH值至弱酸性，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相用水洗涤1次，饱和食盐水萃取1次，无水硫酸钠干燥，抽滤旋干得到棕色晶体N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸；
[0012] （5）将315mg N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸溶解于5mL二甲基甲酰胺中，再加入363mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、249mg 1-羟基苯并三氮唑和0.4mL三乙胺，然后加入345.5mg 5-羟色氨酸甲酯，室温条件下搅拌过夜，TLC检测原料消失停止反应，反应物加水溶解后，用盐酸溶液调节反应溶液的pH值至中性，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相用水洗涤1次，饱和食盐水萃取1次，无水硫酸钠干燥，抽滤旋干，然后用体积比为6:1的二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶液过硅胶柱色谱分离得到浅棕色晶体粉末5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯。
[0013] 本发明所述的具有抗肿瘤活性的5-羟色氨酸甲酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中抗肿瘤药物由5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯和药学上可接受的载体或赋形剂制备而成，所述的肿瘤为脑瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、食道癌、胃癌和结肠癌或者白血病。
[0014] 经MTT实验发现，本发明合成的化合物有良好的体外抗肿瘤细胞增殖活性，对TE-1、MGC803、HCT116细胞生长均受到较明显的抑制，可作为抗肿瘤药物或先导化合物进一步开发。
具体实施方式
[0015] 以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。实施例
[0016] 5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯的合成方法：
[0017]
[0018] a: NaN3, DMF, rt, 12h; b: CuSO4, Sodium ascobate, THF-H2O(1:1), rt, 5 h; c: LiOH, THF-MeOH-H2O(4:2:1), rt, over night; d: SOCl2, MeOH, reflux, 5h; e: EDC·HCl, HOBt, DMF, triethylamine, rt, over night。
[0019] 合成过程的具体步骤为：
[0020] 1）5-羟色氨酸甲酯的合成
[0021] 在500mL三颈瓶中加入5-羟色氨酸44.00g（0.2mol）和甲醇350mL，降温至-5℃，低温下缓慢滴加氯化亚砜17.4mL (0.24mol)。滴加完毕后升温至35℃反应过夜。TLC检测原料消失停止反应。减压蒸馏掉甲醇，冷却后加入300mL乙酸乙酯搅拌，抽滤，烘干得到灰白色固体43.53g（92.90%）。M.p.135-136℃；分子式：C12H14N2O3，HRMS(FAB)(m/z): 235.1060[M+H]+。
[0022] 2）4-叔丁基苄基叠氮的合成
[0023] 4-叔丁基苄溴2.27g（10mmol）溶解于10mL二甲基甲酰胺中，冰浴条件下分批加入叠氮化钠0.975g（15mmol），室温条件下搅拌过夜，TLC检测原料消失停止反应。反应结束后加水溶解，依次用等量的乙酸乙酯进行萃取，分出有机层，用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩得到油状液体1.1719g（62%），分子式：C11H15N3，HRMS(FAB)(m/z)：190.1060[M+H]+。
[0024] 3) N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸甲酯的合成
[0025] 取4-叔丁基苄基叠氮926.1mg（4.9mmol）和丙炔酸甲酯0.295mL（3.3mol）溶解于5mL四氢呋喃和水（体积比为1:1）溶液中，冰浴条件下分别加入催化剂硫酸铜392mg和左旋抗坏血酸钠970.7mg，继续在室温条件下反应5h，TLC检测原料消失停止反应。反应结束后加水溶解，依次用等量的乙酸乙酯进行萃取，分出有机层，用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，蒸去溶剂后得到淡黄色结晶性粉末629.4mg（70%），分子式：C15H19O2N3，1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6)：δH 8.76(1H, s)，7.39(2H, d, J=8Hz)，7.27(2H, d, J=8Hz)，5.59(2H, s)，3.68(3H, s)，1.24(3H×3, s)。
[0026] 4) N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸的合成
[0027] N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸甲酯530.3mg（2.04mmol），溶解在7mL四氢呋喃、甲醇和水（体积比为4:2:1）的混合溶液中，分批加入93mg（4mmol）氢氧化锂，室温条件下搅拌过夜，TLC检测原料消失停止反应。反应物加水溶解后，用1mol/L的盐酸溶液调节反应溶液pH值至弱酸性，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相用水洗涤1次，饱和食盐水萃取1次，无水硫酸钠干燥，抽滤旋干得到棕色晶体488mg（97%），分子式：C14H17O2N3，1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6)：δH 8.76(1H, s)，7.39(2H, d, J=8Hz)，7.27(2H, d, J=8Hz)，5.59(2H, s)，1.24(3H×3, s)。
[0028] 5）5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯的合成
[0029] N-1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸315mg（1.23mmol）溶解于5mL二甲基甲酰胺溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）363mg（1.845mmol）、1-羟基苯并三氮唑（HOBt）249mg（1.845mmol）和三乙胺0.4mL，然后加入5-羟色氨酸甲酯345.5mg（1.47mmol），室温条件下搅拌过夜。TLC检测原料消失停止反应，反应物加水溶解后，用1mol/L的盐酸溶液调节反应溶液pH值至中性，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相用水洗涤1次，饱和食盐水萃取1次，无水硫酸钠干燥，抽滤旋干，用二氯甲烷和乙酸乙酯（体积比为6:1）的混合溶液过硅胶柱色谱分离得到浅棕色晶体粉末368mg（77.8%）。分子+ 1式：C26H29O4N5，分子量：475.20。HRMS(FAB)(m/z)：498.2119[M+Na] ，H-NMR (400MHz, DMSO-D6)：δH 9.88(1H, s, indole-NH)，8.37 (1H, s)，7.39(2H, d, J=8Hz)，7.27(2H, d, J=
8Hz)，7.20(1H, d, J=8Hz)，7.19(1H, s)，6.97 (1H, s)，6.70(1H, d, J=8Hz)，5.59(2H, s)，4.92(1H, m)，3.68(3H, s)，3.33(1H, dd, J=9.0, 15.0Hz )，2.91(1H, dd, J=4.8,
15.0Hz)，1.29(3H×3, s)。
[0030] 实验例1
[0031] 本试验例的目的是在研究本发明化合物的体外抗肿瘤细胞增值活性
[0032] 取对数生长期的人食管鳞癌细胞（TE-1）、人胃癌细胞（MGC803）、人结肠癌细胞（HCT116）以6×103个/孔接种至96孔板中，培养24h后将培养基更换为含5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯的培养基，每个样品9个浓度，分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/mL，设空白对照组，继续培养72h。培养结束后，加MTT 20μL每孔，四个小时后甩掉培养基，每孔加150mL DMSO，震荡均匀后酶标仪490nm波长测其OD值，根据OD值利用SPSS软件计算化合物的IC50值。
[0033] 实验结果表明：5-羟基-N-[[1-(4-叔丁基苯甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基]羰基]-D-色氨酸甲酯作用72h后，TE-1、MGC803、HCT116细胞生长均受到较明显的抑制，IC50值分别为10.106μg/mL、9.836μg/mL、16.756μg/mL。
[0034] 以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
