本发明公开了一种硫氢根离子纳米探针材料及其制备方法和应用。首先利用还原法制备金纳米簇，其中金纳米簇以11‑巯基十一烷酸为配体；然后利用1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化金纳米簇，结合壳聚糖分子具有较多的氨基分子，再利用酰胺反应，在金纳米簇外面包裹一层壳聚糖分子；最后利用壳聚糖上未反应完的氨基分子，通过酰胺反应，将对硫氢根离子具有响应的荧光小分子通过共价键方式修饰到金纳米簇表面，最终得到具有较好水溶性的硫氢根离子纳米探针。该硫氢根离子纳米探针材料粒径小且均一，且能实现溶液和细胞内硫氢根值的检测，具有很好的应用前景。
1.一种硫氢根离子纳米探针材料，其特征在于所述纳米探针材料包括金纳米簇以及对硫氢根离子具有响应的荧光小分子，具体结构为：其中： 表示11-巯基十一烷酸； 表示壳聚糖分子； 表示氯金酸； 表示对硫氢根离子具有响应的荧光小分子；
所述纳米探针材料的制备包括：首先利用还原法制备金纳米簇，其中金纳米簇以11-巯基十一烷酸为配体，然后利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化金纳米簇，结合壳聚糖分子具有较多的氨基分子，再利用酰胺反应，在金纳米簇外面包裹一层壳聚糖分子，最后利用壳聚糖上未反应完的氨基分子，通过酰胺反应，将对硫氢根离子具有响应的荧光小分子通过共价键方式修饰到金纳米簇表面。
2.根据权利要求1所述的硫氢根离子纳米探针材料的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：S1.制备以十一巯基烷酸为配体的金纳米簇(Au@MUA)：将11-MUA和NaOH完全溶解于水中，再加入HAuCl4和四羟甲基氯化磷THPC，在室温下搅拌2h后加入NaCl水溶液，再离心处理
15min,去除上清液，沉淀用水和乙醇溶液，V水:V乙醇＝2:1洗涤，得到最终提纯产物Au@MUA；
S2.对获得的Au@MUA修饰上壳聚糖分子，得到金纳米簇(Au@MUA@CSa)：将上述得到的Au@MUA溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺甲醇溶液活化4h,再加入1mg/mL壳聚糖的PBS溶液，室温下搅拌24h，再离心处理除去未接枝的壳聚糖；
S3.对Au@MUA@CSa修饰上对硫氢根具有响应的小分子金纳米簇(Au@MUA@CSa@Dye)：将染料溶于甲醇中溶解,加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化4h后,将修饰后的金纳米簇产物加入到上述溶液中搅拌24h,再离心处理得到最终产物。
3.根据权利要求2所述的硫氢根离子纳米探针材料的制备方法，其特征在于步骤S1中所述离心处理的离心力为6000g，步骤S2及S3中所述的离心处理，其转速为20000rpm/min，时长50分钟。
4.根据权利要求2所述的硫氢根离子纳米探针材料的制备方法，其特征在于步骤S1所制备出的金纳米簇粒径为1～2nm。
5.根据权利要求2所述的硫氢根离子纳米探针材料的制备方法，其特征在于步骤S2中修饰壳聚糖分子后的金纳米簇材料粒径为1～2nm。
6.根据权利要求2所述的硫氢根离子纳米探针材料的制备方法，其特征在于步骤S3中修饰对硫氢根离子具有响应的荧光小分子后金纳米簇材料粒径为1～2nm。
7.根据权利要求1所述的硫氢根离子纳米探针材料的应用，其特征在于所述纳米探针材料可用于生物检测。
8.根据权利要求7所述的硫氢根离子纳米探针材料的应用，其特征在于所述纳米探针材料可用于生物成像技术。
一种硫氢根离子纳米探针材料及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于纳米发光材料技术领域，具体涉及一种硫氢根离子纳米探针材料及其制备方法及其在生物检测和成像中的应用。
背景技术
[0002] 硫化氢在正常情况下是一种无色、易燃的酸性气体，浓度低时带恶臭，气味如臭蛋；浓度高时反而没有气味(因为高浓度的硫化氢可以麻痹嗅觉神经)。同时，硫化氢是一种急性剧毒，短期内吸入高浓度的硫化氢后出现流泪、眼痛、眼内异物感等现象，重者可出现脑水肿、肺水肿，极高浓度(1000Mg/m3以上)时可在数秒内突然昏迷，发生闪电型死亡；并且长期低浓度接触，可引起神经衰弱综合症和植物神经功能紊乱。然而，研究发现硫化氢在哺乳动物体内广泛存在，而且具有重要的细胞保护作用，例如内源性H2S能保护大鼠心脏对抗缺血-再灌注引起的损伤。所以研究硫化氢的具体生理机制具有非常重要的意义。
[0003] 由于硫化氢对人类健康非常重要，所以准确的确定硫化氢的浓度也是非常必要的。目前，检测硫化氢的报道的方法有：电化学分析法(Electroanalysis.2000,18,1453-1460)，比色法(Commun.2009,7390-7392),荧光分析法(Chem.Commun,2012,48,10529-
10531)等。但是都存在一些问题，例如：电化学分析法与比色法检测前样品处理麻烦，且不能用于活细胞中含量的检测。目前，设计合成的检测硫化氢的荧光探针的发射波长都集中在500-650nm，在活体细胞中硫化氢的检测，虽然有报道合成了近红外探针，但由于自身存在的缺陷，还没有实现在活体中检测硫化氢。
[0004] 在新型的纳米探针当中，相对于有机染料，金纳米簇由于其粒径小(小于2nm)从而具有独特的光物理性质，例如长寿命(Anal.Chem,2015,216-229)，好的生物相溶性，大Stokes位移等。
[0005] 由于一般有机分子难溶于水，毒性大，因此，随着纳米技术的发展，设计合成新型的硫氢根纳米探针来解决医学上的难题是十分必要的。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于改善现有存在的技术问题，如毒性大、不能在活体细胞中检测硫化氢、光稳定性差等问题，提供一种具有较好水溶性及长发光寿命的硫氢根离子纳米探针材料及其制备方法，以及在其生物检测和成像中的应用。
[0007] 一种硫氢根离子纳米探针材料，其主要包括金纳米簇以及对硫氢根离子具有响应的荧光小分子，具体结构为：
[0008]
[0009] 其中： 表示11-巯基十一烷酸； 表示壳聚糖分子； 表示氯金酸； 表示对硫氢根离子具有响应的荧光小分子。
[0010] 硫氢根离子纳米探针材料的制备方法，该方法包括以下步骤：首先利用还原法制备金纳米簇，其中金纳米簇以11-巯基十一烷酸为配体；然后利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化金纳米簇，结合壳聚糖分子具有较多的氨基分子，再利用酰胺反应，在金纳米簇外面包裹一层壳聚糖分子；最后利用壳聚糖上未反应完的氨基分子，通过酰胺反应，将对硫氢根离子具有响应的荧光小分子通过共价键方式修饰到金纳米簇表面，最终得到具有较好水溶性的硫氢根离子纳米探针，具体如下：
[0011] S1.制备以十一巯基烷酸为配体的金纳米簇(Au@MUA)：将11-MUA和NaOH完全溶解于水中，再加入HAuCl4和THPC，在室温下搅拌2h后加入NaCl水溶液，再离心处理15min,去除上清液，沉淀用水和乙醇溶液(V水:V乙醇＝2:1)洗涤，得到最终提纯产物Au@MUA；
[0012] S2.对获得的Au@MUA修饰上壳聚糖分子，得到金纳米簇(Au@MUA@CSa)：将上述得到的Au@MUA溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺甲醇溶液活化4h,再加入1mg/mL壳聚糖的PBS溶液，室温下搅拌24h，再离心处理除去未接枝的壳聚糖；
[0013] S3.对Au@MUA@CSa修饰上对硫氢根具有响应的小分子金纳米簇(Au@MUA@CSa@Dye)：将染料溶于甲醇中溶解,加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化4h后,将修饰后的金纳米簇产物加入到上述溶液中搅拌24h,再离心处理得到最终产物。
[0014] 其中：步骤S1中所述离心处理的离心力为6000g，步骤S2及S3中所述的离心处理，其转速为20000rpm/min，时长为50min；
[0015] 所述步骤S1所制备出的金纳米簇粒径为1～2nm；
[0016] 所述步骤S2中修饰壳聚糖分子后的金纳米簇材料粒径为1～2nm；
[0017] 所述步骤S3中修饰对硫氢根离子具有响应的荧光小分子后金纳米簇材料粒径为1～2nm。
[0018] 硫氢根离子纳米探针材料具有较好的水溶性，从而可应用于生物检测上。
[0019] 硫氢根离子纳米探针材料具有长发光寿命，同时结合时间分辨技术，可以实现在生物成像中消除背景荧光干扰，从而可应用于生物成像上。
[0020] 有益效果：本发明相较于现有的技术具有以下优点：
[0021] 1.所制备的金纳米簇粒径小，尺寸在1～2nm，且分散性很好；
[0022] 2.所制备的金纳米簇和对硫氢根响应的染料分子构成能量主/客体体系；
[0023] 3.所制备的水溶性金纳米簇探针，可以实现对溶液和细胞内硫氢根值的检测；
[0024] 4.具有长发光寿命的金纳米簇纳米探针结合时间分辨技术，可以实现在生物成像[0025] 中消除背景荧光干扰，从而更好实现其在生物成像中的应用。
附图说明
[0026] 为了使本发明更直观且易于理解，下面结合本发明具体实例以及相关数据，对本发明进行进一步的说明：
[0027] 图1.硫氢根离子纳米探针材料制备示意图；
[0028] 图2.硫氢根离子纳米探针材料透射电镜图片；
[0029] 图3.硫氢根离子纳米探针材料制备对硫氢根离子的发射光谱响应；
[0030] 图4.硫氢根离子纳米探针材料对不同阴离子的响应。
具体实施方式
[0031] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明附图对本发明实施方式做进一步的说明：
[0032] 下列实施例中所述的有关试剂均是市售(十一巯基烷酸，氯金酸，壳聚糖，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，80％THPC(四羟甲基氯化磷))，使用前未经任何处理。
[0033] 实施例1.一种硫氢根离子纳米探针材料，具体制备路线如下：
[0034] S1.制备以十一巯基烷酸为配体的金纳米簇(Au@MUA)：
[0035] 1. 13.1mg 11-MUA和200μL 1M NaOH加入20mL水中，完全溶解.
[0036] 2.加入510μL(1％by mass)HAuCl4和445μL THPC(80％水溶液12μL水加入到1mL水中溶解)，溶液室温下搅拌2h,溶液变成黄色。
[0037] 3.得到的产物加入10mL 500mM NaCl水溶液，在6000g离心力下离心15min,去除上清液，沉淀用水和乙醇溶液(V水:V乙醇＝2:1)洗涤两次，得到最终提纯产物。
[0038]
[0039] S2.对获得的Au@MUA修饰上壳聚糖分子，得到金纳米簇(Au@MUA@CSa)：
[0040] 将上述得到的Au@MUA 2mL溶液加入0.25mL 0.05M EDC和0.25mL 0.05M NHS甲醇溶液活化4h,将1mg/mL壳聚糖的PBS溶液逐滴加入到上述溶液中,室温下搅拌24h.在20000rpm下用PBS离心40min除去未接枝的壳聚糖。
[0041]
[0042] S3.对Au@MUA@CSa修饰上对硫氢根具有响应的小分子金纳米簇(Au@MUA@CSa@Dye)[0043] 将1mg染料溶于1mL甲醇中溶解,加入12mg EDC和2mg NHS活化4h后,将修饰后的金纳米簇产物逐滴加入到上述溶液中搅拌24h,在20000rpm下用甲醇/PBS混合溶液离心1h得到产物。
[0044]
[0045] 实施例2.形貌表征
[0046] 按上述具体步骤分别制备样品，将样品溶液滴在铜网上，待干燥后进行形貌测试，如图2，可以发现所制备的各种金纳米簇粒径都在1～2nm，且分散性都很好。
[0047] 实施例3.光谱测试
[0048] 通过共价键修饰上的金纳米簇材料对硫氢根离子的荧光发射光谱测试：取200ul分散有金纳米簇的PBS缓冲液于比色皿中，逐渐加入硫氢根离子(NaHS溶于PBS溶液中)，如图3测得荧光发射光谱。
[0049] 通过共价键修饰上的金纳米簇材料对不同阴离子的响应测试：取200uL分散有金纳米簇的PBS缓冲液于比色皿中，分别加入2uL 10-2M的F-、Cl-、Br-、NO3-、NO2-、oAC-、SCN-、HPO4-、SO42-、CO32-、S2O32-、HClO4-、H2O2、NO、Gly和2uL 10-1M Hcy、Cys、GHS、HS-、GHS+HS-、Cys+HS-，测得荧光发射光谱如图4。
[0050] 通过共价键修饰上的金纳米簇材料对硫氢根响应光谱图可知，随着硫氢根离子的加入，在597nm处有机染料的最大发射峰逐渐减弱；与此相反，在534nm处金纳米簇本身的发射峰强度逐渐增强。由此可知，通过共价键修饰上的金纳米簇材料对硫氢根具有响应；同时金纳米簇和对硫氢根响应的染料分子构成能量主、客体体系，存在共振能量传递。在365nm激发下，有机染料吸收金纳米簇所发出的光从而发光，而金纳米簇本身的发射强度减弱，随着硫氢根离子的加入，由于染料与硫氢根反应，破坏了其共振能量传递，导致金纳米簇本身的强度增强，而有机染料部分的发射强度减弱。
[0051] 通过共价键修饰上的金纳米簇材料对不同阴离子选择性图可知，本发明所制备的金纳米簇材料对硫氢根离子具有特异性响应。
