一种极速获得分生孢子的方法

摘要

本发明涉及一种极速获得分生孢子的方法。该方法为一种改良的微循环产孢的技术，取中国被毛孢子囊孢子以蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅为载体，不经历菌丝生长阶段，直接诱导产生分生孢子，不仅培养周期短、成本低而且工艺稳定、产率高，为成功侵染蝙蝠蛾幼虫提供稳定的分生孢子来源。

权利要求

1.一种获得分生孢子的方法，其特征在于，以蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅为载体，中国被毛孢子囊孢子不经历菌丝生长阶段，直接产生分生孢子；

所述方法包括以下步骤：

1)将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面；

2)将涂抹有中国被毛孢子囊孢子的蝙蝠蛾幼虫、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅分别置于垫有湿滤纸的培养皿内，保持温度12～18℃，相对湿度60～90％，在避光的无菌环境下培养24～96h；

3)对蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅表面进行洗脱，收集分生孢子；

其中步骤1)中所述中国被毛孢子囊孢子溶液，子囊孢子的浓度为4500～5500个/ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的中国被毛孢子囊孢子溶液，包含具有保湿和粘附作用的溶剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述溶剂为2～5％甘油水溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，涂抹工具为柔性工具。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述柔性工具为毛笔、布条或棉签。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中的将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，每个载体的涂抹量为15～25μl。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中的湿滤纸为保证滤纸上肉眼可见水，倾斜无水流动。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的对蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕、或蝙蝠蛾成虫翅表面进行洗脱，洗脱液为含0.1％吐温80的0.003mol/l KH2PO4缓冲液。

说明书

一种极速获得分生孢子的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物科学领域，特别涉及一种极速获得分生孢子的方法。

背景技术

[0002] 冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sunget et al.]是我国青藏高原特产的传统名贵中药材，它是冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。近年来，随着冬虫夏草营养及药用价值认识的普及，加之人们生活水平不断提高，对冬虫夏草的需求不断增大，导致乱采滥挖不断加剧，资源破坏越来越严重，致使冬虫夏草资源锐减，人工培植冬虫夏草势在必行。由于现有技术存在幼虫染菌率低或染菌后存活率低等问题，一直制约着人工培植冬虫夏草规模化发展，多年的研究证实，中国被毛孢(H.sinensis)为冬虫夏草菌的无性型，分生孢子作为中国被毛孢生活史中极为重要的一个环节，在冬虫夏草侵染和形成过程中起着十分关键的作用，有研究表明采用中国被毛孢分生孢子来侵染蝙蝠蛾幼虫能够明显提高侵染率。

[0003] 目前，常用的获得中国被毛孢分生孢子的方法有：固体发酵诱导和微循环产孢。

[0004] 固体发酵诱导获得分生孢子的周期较长，一般为60～90天，导致培养过程中的染菌几率增加，且产量不稳定，受限于中国被毛孢菌株类型及固体培养基的优劣。

[0005] 微循环产孢是真菌的孢子萌发后，不经过(或仅有极微弱的)菌丝生长阶段，直接从孢子上产生产孢结构和孢子。该方法产孢周期短多用于冬虫夏草菌无性型的鉴定，莫明和等在期刊《菌物系统》2001年第4期发表的文章“冬虫夏草的微循环产孢及其无性型的分离”中公开了在载玻片上加一滴萨氏培养基，将子囊孢子点接于培养基上进行微循环产孢，5天后产生分生孢子，根据分生孢子的显微特征对其进行鉴定，作者认为该方法简便可靠，具有很好的实用性。肖岩岩等在期刊《安徽农业大学学报》2011年38卷第1期发表的文章“冬虫夏草子囊孢子及其无性型在培养过程中的形态学观察”中将中国被毛孢分生孢子接入液体培养基，进行微循环产孢后，结合分子生物学技术手段将分离到的菌株鉴定为中国被毛孢。可见，传统的微循环产孢以培育出少量的分生孢子作为冬虫夏草菌无性型的鉴定为目的，并不追求分生孢子的产量，未对微循环产孢的环境温湿度和营养条件做深入的研究。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改良的微循环产孢的的方法，该方法不仅培养周期短、成本低，而且工艺稳定、产率高，为成功侵染蝙蝠蛾幼虫提供稳定的分生孢子来源。

[0007] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0008] 一种极速获得分生孢子的方法，将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫 虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，分别置于垫有湿滤纸的培养皿内，在温度12～18℃，相对湿度60～90％，避光的无菌环境下培养24～96h，即得中国被毛孢分生孢子。对蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅表面进行洗脱，收集分生孢子。

[0009] 一些实施例中，本发明所述的中国被毛孢子囊孢子溶液，包含具有保湿和粘附作用的溶剂，优选的为2～5％甘油水溶液。

[0010] 一些实施例中，本发明所述的中国被毛孢子囊孢子溶液，孢子的浓度为4500～5500个/ml，优选的为5000个/ml。

[0011] 一些实施例中，本发明所述的将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，涂抹工具为柔性工具，不损伤幼虫，柔性工具可以是毛笔、布条、棉签等，优选的为毛笔。

[0012] 一些实施例中，本发明所述的将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，每个载体的涂抹量为15～25μl，优选的为20μl。

[0013] 一些实施例中，本发明所述的将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，蝙蝠蛾幼虫优选的为3～5龄的活的幼虫。

[0014] 一些实施例中，本发明所述的垫有湿滤纸的培养皿，滤纸湿度控制为充分润湿，满盈但不溢出水分。每天检查，根据滤纸的水分状况进行补加水处理。

[0015] 一些实施例中，本发明所述的培养环境，优选的为温度14～16℃，相对湿度65～85％，避光的无菌环境。

[0016] 一些实施例中，本发明所述的对蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅表面进行洗脱，洗脱液优选的为含0.1％吐温80的0.003mol/l KH2PO4缓冲液。

[0017] 分生孢子在荧光显微镜下会产生蓝色荧光，可使用荧光显微镜实时监测产孢情况，于分生孢子量较大时进行收集，优选在涂抹后的24～96h产生大量分生孢子。

[0018] 本发明的子囊孢子可以为野生新鲜的冬虫夏草弹射的子囊孢子，也可采集自人工培植的新鲜冬虫夏草弹射的子囊孢子

[0019] 由于微循环产孢产生分生孢子的数量少，此项技术多用于冬虫夏草无性型的鉴定，中国被毛孢生长环境特殊，对人工诱导微循环产孢的营养和环境因素要求十分严格，申请人在对中国被毛孢生长特性长期深入研究的基础上，经过创造性的劳动，提供了一种能够获得大量分生孢子的改良的微循环产孢的方法。本发明的技术方案通过长新鲜的冬虫夏草弹射的子囊孢子直接诱导分生孢子，未经历菌丝生长阶段，产孢周期短，避免了在菌种分离和漫长的培养过程中存在的染菌或菌种性状发生改变等问题。以蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅为培养基，在特定的环境条件控制下，能产生大量的分生孢子，在获取中国被毛孢分生孢子领域具有突破性的进步。

附图说明

[0020] 附图1：荧光显微镜下虫体与分生孢子

[0021] 图例：1 蝙蝠蛾幼虫体表刚毛 2 分生孢子

具体实施方式

[0022] 本发明实施例公开了一种极速获得分生孢子的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本发明所述方法进行改动或者适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0023] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种极速获得分生孢子的方法进行详细说明。

[0024] 本发明所用滤纸经过预先高温121℃，高压30min灭菌处理。

[0025] 实施例1

[0026] 取新鲜收集的子囊孢子，用2％甘油水溶液稀释成浓度为4500个/ml的子囊孢子溶液；用预先消毒的细毛笔将子囊孢子液均匀涂抹于50条3龄的健康的蝙蝠蛾幼虫体表，每条虫的涂抹量为20μl，将涂抹后的蝙蝠蛾幼虫分别置于干净的垫有滤纸保湿的带盖培养皿内。滤纸湿度控制在充分润湿，满盈但不溢出水分的范围内。每天检查，根据滤纸的水分状况进行补加水处理。于温度14℃，相对湿度65％的洁净区环境下进行培养，避光。使用荧光显微镜实时监测产孢情况(如附图1所示)，于24h停止培养，用含0.1％吐温80的0.003mol/l KH2PO4缓冲液洗脱分生孢子，幼虫放回原空间继续饲养，过滤除去分生孢子液中的少许杂质，在显微镜下计数分生孢子数为8.14×105个分生孢子。显微镜下分生孢子无色，肾形，单胞，光滑。

[0027] 实施例2

[0028] 取新鲜收集的子囊孢子，用3％甘油水溶液稀释成浓度为5000个/ml的子囊孢子溶液；用预先消毒的细毛笔将子囊孢子液均匀涂抹于50条4龄的健康的蝙蝠蛾幼虫体表，每条虫的涂抹量为20μl，将涂抹后的蝙蝠蛾幼虫分别置于干净的垫有滤纸保湿的带盖培养皿内。滤纸湿度控制在充分润湿，满盈但不溢出水分的范围内。每天检查，根据滤纸的水分状况进行补加水处理。于温度15℃，相对湿度70％的洁净区环境下进行培养，避光。使用荧光显微镜实时监测产孢情况，于54h停止培养，用含0.1％吐温80的0.003mol/l KH2PO4缓冲液洗脱分生孢子，幼虫放回原空间继续饲养，过滤除去分生孢子液中的少许杂质，在显微镜下计数分生孢子数为9.23×105个分生孢子。

[0029] 实施例3

[0030] 取新鲜收集的子囊孢子，用4％甘油水溶液稀释成子囊孢子浓度为5500个/ml的子囊孢子溶液；用预先消毒的细毛笔将子囊孢子液均匀涂抹于50条5龄的健康的蝙蝠蛾幼虫体表，每条虫的涂抹量为25μl， 将涂抹后的蝙蝠蛾幼虫分别置于干净的垫有滤纸保湿的带盖培养皿内。滤纸湿度控制在充分润湿，满盈但不溢出水分的范围内。每天检查，根据滤纸的水分状况进行补加水处理。于温度16℃，相对湿度75％的洁净区环境下进行培养，避光。使用荧光显微镜实时监测产孢情况，于48h停止培养，用含0.1％吐温80的0.003mol/l KH2PO4缓冲液洗脱分生孢子，幼虫放回原空间继续饲养，过滤除去分生孢子液中的少许杂
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质，在显微镜下计数分生孢子数为1.05×10个分生孢子。

[0031] 实施例4

[0032] 取新鲜收集的子囊孢子，用5％甘油水溶液稀释成浓度为5000个/ml的子囊孢子溶液；用预先消毒的细毛笔将子囊孢子液均匀涂抹于50个蝙蝠蛾幼虫虫蜕表面，每个虫蜕的涂抹量为20μl，将涂抹后的虫蜕分别置于干净的垫有滤纸保湿的培养皿内。滤纸湿度控制在充分润湿，满盈但不溢出水分的范围内。每天检查，根据滤纸的水分状况进行补加水处理。于温度18℃，相对湿度90％的洁净区环境下进行培养，避光。使用荧光显微镜实时监测产孢情况，于78h停止培养，用含0.1％吐温80的0.003mol/l KH2PO4缓冲液洗脱分生孢子，过滤除去分生孢子液中的少许杂质，在显微镜下计数分生孢子数为7.42×105个分生孢子。

[0033] 实施例5

[0034] 取新鲜收集的子囊孢子，用3％甘油水溶液稀释成子囊孢子浓度为5000个/ml的子囊孢子溶液；用预先消毒的细毛笔将子囊孢子液均匀涂抹于50个蝙蝠蛾成虫的翅表面，每个翅表面涂抹量为20μl，将涂抹后的虫翅分别置于干净的垫有滤纸保湿的培养皿内。滤纸湿度控制在充分润湿，满盈但不溢出水分的范围内。每天检查，根据滤纸的水分状况进行补加水处理。于温度12℃，相对湿度80％的洁净区环境下进行培养，避光。使用荧光显微镜实时监测产孢情况，于72h停止培养，用含0.1％吐温80的0.003mol/l KH2PO4缓冲液洗脱分生孢子，过滤除去分生孢子液中的少许杂质，在显微镜下计数分生孢子数为6.56×105个分生孢子。