一种脑胶质瘤细胞及其用途

摘要

本发明提供了一种脑胶质瘤细胞，其中，该脑胶质瘤细胞的保藏编号为CGMCC NO.11100。本发明还提供了如上所述的脑胶质瘤细胞在筛选药物中的用途。通过上述技术方案，本发明能够简化和加快对脑胶质瘤细胞亚型的药物筛选。

权利要求

1.一种脑胶质瘤细胞，其特征在于，该脑胶质瘤细胞的保藏编号为CGMCC NO.11100。

2.权利要求1所述的脑胶质瘤细胞在筛选药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述药物为治疗肿瘤的药物。

4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述胶质母细胞瘤为表达融合蛋白的胶质母细胞瘤亚型，所述融合蛋白在N末端至C末端方向上由第一蛋白片段和第二蛋白片段连接而成，所述第一蛋白片段如SEQ ID NO:1、2、3或4所示，所述第二蛋白片段如SEQ ID NO:5或6所示。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述胶质母细胞瘤亚型为还转录有融合mRNA的胶质母细胞瘤亚型，所述融合mRNA的cDNA在5’至3’方向上由第一核酸片段和第二核酸片段连接而成，所述第一核酸片段如SEQID NO:7、8、9或10所示，所述第二核酸片段如SEQ ID NO:

11或12所示。

说明书

一种脑胶质瘤细胞及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞生物技术领域，具体地，涉及一种脑胶质瘤细胞以及该脑胶质瘤细胞的用途。

背景技术

[0002] 胶质母细胞瘤是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤。该肿瘤位于皮质下，多数生长于幕上大脑半球的各处。呈浸润性生长，常侵犯几个脑叶，并侵犯深部结构，还可经胼胝体波及对侧大脑半球。发生部位以额叶最多见，其他依次为颞叶、顶叶，少数可见于枕叶/丘脑和基底节等。

[0003] 胶质母细胞瘤生长速度快、病程短，70-80％患者病程在3-6个月，病程超过1年者仅10％。个别病例因肿瘤出血，可呈卒中样发病，由于肿瘤生长迅速，脑水肿广泛颅内压增高症状明显，几乎全部患者都有头痛、呕吐、视盘水肿有头痛、精神改变、肢体无力、呕吐、意识障碍与言语障碍。肿瘤浸润性破坏脑组织，造成一系列的局灶症状，患者有不同程度的偏瘫、偏身感觉障碍失语和偏盲等。神经系统检查可发现偏瘫、脑神经损害、偏身感觉障碍与偏盲。约33％的患者有癫痫发作，约20％的患者表现淡漠、痴呆、智力减退等精神症状。

[0004] 胶质母细胞瘤可分为由低级别星形细胞瘤发展而来的继发性胶质母细胞瘤(secondary glioblastoma)和不表现低度病变恶性前期的原发性胶质母细胞瘤(primary glioblastoma)两类，而在组织学上很难区分继发性胶质母细胞瘤和原发性胶质母细胞瘤。目前，已经发现异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase,IDH)的突变只在继发性胶质母细胞瘤中，但仍然有一部分继发性胶质母细胞瘤中并不发生异柠檬酸脱氢酶的突变。

[0005] 原发性胶质母细胞瘤是从第一次临床诊断即为四级胶质母细胞瘤，其最明显的分子特征是EGFR扩增，突变或过表达(40％)，P53突变(30％),CDKN2A/B缺失(30-40％)，RB1突变或缺失，10号染色体丢失(70％)，以及PTEN突变(30％)等。继发性胶质母细胞瘤是由低级别(II级或III级)进展而来的四级胶质母细胞瘤。它的临床第一次诊断即为低级别胶质瘤，一般经过手术或者放化疗之后肿瘤再次出现，而级别进展到四级胶质母细胞瘤。研究发现，继发性胶质母细胞瘤的分子标志物及基因细胞通路与原发性胶质母细胞瘤不同。目前研究最热的是异柠檬酸脱氢酶1突变(70％)，另外还包括P53突变(65％)，PDGFA和PDGFRA过表达(60％)，19号染色体长臂的缺失(50％)，以及RB1的突变或者缺失(25％)。

[0006] 这些分子标志物的发现为胶质母细胞瘤的靶向治疗提供了重要靶点。然而，针对这些分子标志物的靶向药物已经很多，但都未真正进入临床应用阶段，归根结底是靶向关系的特异性较低，由此导致疗效较低且副作用较大，不适于临床应用。

[0007] 本发明的发明人在之前的研究中发现，在脑胶质瘤中，有一个类群的患者特异性地表达一种融合蛋白，表达该融合蛋白的患者类群属于脑胶质瘤的一个新的亚型，表现出与其它脑胶质瘤患者不同的预后和药物敏感性。但是由于缺少合适的细胞模型，目前对该脑胶质瘤的药物开发存在筛选困难的问题。

发明内容

[0008] 为了克服缺少合适的细胞模型的缺陷，本发明提供了一种脑胶质瘤细胞，该脑胶质瘤细胞特别适合用于上述脑胶质瘤亚型的药物筛选。

[0009] 本发明的发明人从脑胶质瘤组织中进行原代细胞培养和传代细胞培养，筛选得到了一株稳定连续传代的脑胶质瘤细胞，该脑胶质瘤细胞稳定表达上述融合蛋白，且表现出特异的药物敏感性，由此得到了本发明。

[0010] 本发明提供了一种脑胶质瘤细胞，其中，该脑胶质瘤细胞的保藏编号为CGMCC NO.11100。

[0011] 本发明还提供了如上所述的脑胶质瘤细胞在筛选药物中的用途。

[0012] 通过上述技术方案，本发明能够简化和加快对上述脑胶质瘤细胞亚型的药物筛选。

[0013] 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

[0014] 生物材料保藏

[0015] 本发明的脑胶质瘤细胞是本发明的发明人从脑胶质瘤组织中进行原代细胞培养和传代细胞培养，筛选得到了一株稳定连续传代的脑胶质瘤细胞，其保藏编号为CGMCC No.11100，保藏日期为2015年8月31日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为人属脑胶质瘤细胞系。

附图说明

[0016] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

[0017] 图1是保藏编号为CGMCC No.11100的本发明的细胞的照片。

具体实施方式

[0018] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0019] 本发明提供了一种脑胶质瘤细胞，其中，该脑胶质瘤细胞的保藏编号为CGMCC NO.11100。

[0020] 本发明还提供了如上所述的脑胶质瘤细胞在筛选药物中的用途。

[0021] 其中，如上所述的脑胶质瘤细胞可以用于多种药物的筛选，优选地，所述药物可以为治疗肿瘤的药物；更优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。

[0022] 其中，根据本发明特别优选的一种实施方式，所述胶质母细胞瘤为表达融合蛋白的胶质母细胞瘤亚型，所述融合蛋白在N末端至C末端方向上由第一蛋白片段和第二蛋白片段连接而成，所述第一蛋白片段如SEQ ID NO:1、2、3或4所示，所述第二蛋白片段如SEQ ID NO:5或6所示。

[0023] 其中，SEQ ID NO:1的序列是来自人PTPRZ1基因(NCBI Gene ID为5803)的第一外显子和内含子序列编码的蛋白序列。

[0024] 其中，SEQ ID NO:2的序列是来自人PTPRZ1基因的第二外显子和内含子序列编码的蛋白序列。

[0025] 其中，SEQ ID NO:3的序列是来自人PTPRZ1基因的第三外显子和内含子序列编码的蛋白序列。

[0026] 其中，SEQ ID NO:4的序列是来自人PTPRZ1基因的第八外显子和内含子序列编码的蛋白序列。

[0027] 其中，SEQ ID NO:5的序列是来自人MET基因(NCBI Gene ID为4233)编码的同源异构体1蛋白序列的片段。

[0028] 其中，SEQ ID NO:6的序列是来自人MET基因编码的同源异构体2蛋白序列的片段。

[0029] 本发明中，上述融合蛋白可以由融合核酸编码，其中，编码如上所述的融合蛋白的融合核酸的序列可以根据氨基酸密码子对照表解码得到，由于密码子简并性的存在，编码同一氨基酸序列的融合蛋白的多个融合核酸的序列可以彼此不同。

[0030] 优选地，所述胶质母细胞瘤亚型为还转录有融合mRNA的胶质母细胞瘤亚型，所述融合mRNA的cDNA在5’至3’方向上由第一核酸片段和第二核酸片段连接而成，所述第一核酸片段如SEQ ID NO:7、8、9或10所示，所述第二核酸片段如SEQ ID NO:11或12所示。

[0031] 其中，SEQ ID NO:7的序列来自人PTPRZ1基因的第一外显子和内含子序列，编码如SEQ ID NO:1所示的蛋白。

[0032] 其中，SEQ ID NO:8的序列来自人PTPRZ1基因的第二外显子和内含子序列，编码如SEQ ID NO:2所示的蛋白。

[0033] 其中，SEQ ID NO:9的序列来自人PTPRZ1基因的第三外显子和内含子序列，编码如SEQ ID NO:3所示的蛋白。

[0034] 其中，SEQ ID NO:10的序列为来自人PTPRZ1基因的第八外显子和内含子序列，编码如SEQ ID NO:4所示的蛋白。

[0035] 其中，SEQ ID NO:11的序列是来自人MET基因的片段，编码如SEQ ID NO:5所示的蛋白。

[0036] 其中，SEQ ID NO:12的序列是来自人MET基因的片段，编码如SEQ ID NO:6所示的蛋白。

[0037] 以下，通过实施例进一步详细说明本发明。

[0038] 实施例1：

[0039] 把脑胶质瘤组织块(在天坛医院按照符合医学伦理的操作流程手术摘取的脑胶质瘤组织)置于烧杯中，用Hanks液漂洗3次，去除血污；然后置于含有青链霉素的混合液中60分钟；用眼科剪把组织切成2-3毫米大小的块，以便于消化；加入相当于组织块总量50倍体积的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；置于37℃温箱消化，消化中每隔20分钟摇动一次；消化时间为60分钟；然后通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块；800转/分离心消化液；吸出上清，向沉淀中加入原代培养基，至细胞密度为105个/mL；置于37℃温箱培养。其中，原代培养基的基础培养基为DMEM培养基；还含有10体积％的胎牛血清、0.1ng/ml的EGF、0.1ng/ml的FGF细胞因子、链霉素和青霉素双抗、B27和转铁蛋白。

[0040] 培养传代至第7代时，将原代培养基替换为不含血清的DMEM培养基；再传代培养7代，在7代传代培养过程中，原代细胞出现全部死亡、停止生长或生长缓慢的现象；偶然地，有个别细胞系能够在不含血清的DMEM培养基中呈现良好增殖的状态，将这些能够良好增殖的细胞系作为进一步筛选对象。

[0041] 在进一步筛选过程中，通过PCR进行融合蛋白表达的验证。提取待进一步筛选的细胞的RNA得到的cDNA进行融合蛋白的PCR验证。PCR验证所用的引物由SEQ ID NO:17所示的第一引物和如SEQ ID NO:18所示的第二引物组成。PCR的操作按照合成引物和PCR试剂盒的说明书进行。PCR的产物经过琼脂糖凝胶核酸电泳展示扩增条带的有无，所出现的扩增条带使用DNA凝胶回收试剂盒(QIAquick PCR purification kit，购自Qiagen)进行回收，然后克隆至T载体(pGEM-T easy vector，购自Promega)，并用DNA测序仪(ABI Prism 3730×l DNA Sequencer，购自Applied Biosystems)进行测序。对测序结果，按照表1进行检验，扩增产物中出现SEQ ID NO:13-16中任意一个的细胞系为符合筛选期望的细胞系。

[0042] 表1

[0043]

[0044] 在符合筛选期望的细胞系中，进一步进行MTT实验和Transwell实验检测增殖和迁移能力，选取增殖和迁移能力最强的一个细胞系进行保藏，其保藏编号为CGMCC No.11100，即为本发明的脑胶质瘤细胞，其细胞形态图片如图1所示，其扩增产物中的片段序列如SEQ ID NO:14所示。

[0045] 对比例1

[0046] 首先用慢病毒载体PCDH(SBI公司货号CD510B-1)按其说明书操作，制备表达融合基因(第一核酸片段为SEQ ID NO:8且第一核酸片段为SEQ ID NO:12)的真核表达载体并用病毒的包装质粒(SBI公司货号LV500A-1)共转染293T细胞以制备慢病毒。

[0047] 人类胶质瘤细胞系U87购自中国医学科学院细胞库，原本不表达本发明上述融合蛋白。用包装了上述载体的慢病毒感染U87细胞，进行嘌呤霉素筛选(0.5μg/mL筛选，0.2μg/mL维持)，建立稳定表达融合蛋白的细胞模型，并用免疫杂交和反转录PCR验证上述细胞模型具有融合蛋白的表达和融合基因的转录。稳定表达融合蛋白的U87细胞模型即为本对比例的细胞模型。

[0048] 测试实施例1

[0049] 已知替莫唑胺对部分脑胶质瘤患者有效，但对本发明涉及的表达上述融合蛋白的脑胶质瘤患者无效；并且克唑替尼对本发明涉及的表达上述融合蛋白的脑胶质瘤患者有效，而对部分其它脑胶质瘤患者无效。本测试实施例对原始U87细胞、稳定表达融合蛋白的U87细胞和保藏编号为CGMCC No.11100的本发明的细胞对克唑替尼的药物反应性进行测试。

[0050] 对原始U87细胞、转染空白对照细胞、稳定表达融合蛋白的U87细胞和保藏编号为CGMCC No.11100的本发明的细胞，分别加入替莫唑胺、克唑替尼以及空白对照，药物终浓度为3μM。药物作用24小时后，用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)检测细胞活力，结果如表2所示。

[0051] 表6

[0052]

[0053] 根据表2的结果，具有融合基因表达的U87细胞和CGMCC No.11100的本发明的细胞的增殖相比原始U87细胞明显加快，替莫唑胺能够抑制原始U87细胞的增殖，对具有融合基因表达的U87细胞的增殖抑制作用较弱；而基本上不能抑制CGMCC No.11100的本发明的细胞的增殖，克唑替尼能够抑制原始U87细胞的增殖，对具有融合基因表达的U87细胞的增殖也有较强的抑制作用；也能抑制CGMCC No.11100的本发明的细胞的增殖。由此说明，CGMCC No.11100的本发明的细胞能够作为筛选表达融合蛋白的脑胶质瘤亚型的细胞模型。