一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物

摘要

本发明涉及一种诱导海洋微生物发酵产κ‑卡拉胶酶的组合诱导物，属于微生物发酵技术领域。所述组合诱导物组成成分按重量份计为0.5~1.5份低聚果糖、1~3份κ‑卡拉胶、0.5~1.5份酵母提取物。以一定配比的低聚果糖、κ‑卡拉胶、酵母提取物作为海洋微生物的产酶诱导物，发酵生产κ‑卡拉胶酶。通过摇瓶振荡发酵48 h，海旋菌（Thalassospirasp.Fjfst‑332）的κ‑卡拉胶酶活力为351 U/mL，与不添加诱导物时，菌株κ‑卡拉胶酶的酶活54.3 U/mL相比，提高了6.46倍。

权利要求

1.一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物，其特征在于：所述组合诱导物成分为低聚果糖、κ-卡拉胶、酵母提取物，其低聚果糖：κ-卡拉胶：酵母提取物的重量配比为1：3：1。

2.根据权利要求1所述的组合诱导物用于海洋微生物产κ-卡拉胶酶的培养方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)斜面培养：取海旋菌（Thalassospira  sp.）Fjfst-332接种于斜面培养基中，28 ℃静置培养48 h，获得纯化菌株；

2)种子培养：取纯化菌株接种于种子培养液中，25 ℃摇床培养24 h，作为种子培养液；

3)产酶培养：取种子培养液3mL接种于含有所述组合诱导物的产酶培养基中，25 ℃摇床诱导培养36h，检测κ-卡拉胶酶活力及含量；

斜面培养基的成分为：蛋白胨 5 g/L，酵母膏1 g/L，κ-卡拉胶15 g/L，人工海水800 mL，蒸馏水200 mL，pH 7.5±1；

种子培养液的组分为：氯化钠15 g/L，κ-卡拉胶2 g/L，酵母膏1 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1；

产酶培养基的成分为：氯化钠15 g/L，低聚果糖1g/L，κ-卡拉胶3g/L，酵母膏1g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL， pH 7.5±1；

无机盐母液含有NaNO3 20 g/L；MgSO4·7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L。

说明书

一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物

技术领域

[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物。

背景技术

[0002] 卡拉胶主要存在于角叉菜、麒麟菜及杉藻等海藻的细胞壁中，以α-1,4-D-半乳吡喃糖和β-1,3-D-半乳吡喃糖(或3,6-内醚-D-半乳吡喃糖)交替连接而成的一种亲水性的硫酸酯多糖。根据卡拉胶骨架结构的不同，卡拉胶主要可以分为：κ-型、ι-型和λ-型。

[0003] 研究显示，卡拉胶及其低聚糖的生物学活性与分子量大小和硫酸根含量密切相关，一般认为，分子量在5000-60000范围具有明显的生物活性，因此经降解后得到的卡拉胶低聚糖有可能成为新型海洋药物的重要来源。目前卡拉胶低聚糖制备方法主要有：物理降解法、化学降解法及酶解法。其中，化学法是制备卡拉胶低聚糖主要方法，但化学降解方法存在反应条件不易控制、降解产率低、目的产物不易分离等瓶颈问题，制约了其在工业生产中的应用。而酶解法能弥补化学降解法的不足，不但对生产工艺要求简单，反应条件温和、产物活性高，而且产物专一，从而成为制备卡拉胶低聚糖的热点。

[0004] 已研究发现的卡拉胶酶主要存在于海洋微生物和部分海洋软体动物。其中，大部分已发现卡拉胶酶来自于海洋细菌，包括交替单胞菌属、假单胞菌属、假交替单胞菌属、弧菌属等多种细菌。早在1943年，Mori就成功从海洋软体动物中提取到能够水解角叉菜卡拉胶的酶。研究已经发现并分离纯化出多种卡拉胶酶，其中研究最多的一类为κ-卡拉胶酶。κ-卡拉胶酶能水解κ-卡拉胶的β-1,4糖苷键产生低聚糖，可用于红藻细胞壁结构的分析和原生质体的制备。而海洋微生物产酶量低、酶活性普遍不高，成为了酶解法制备卡拉胶低聚糖的技术瓶颈。因此，寻找合适的诱导物、诱导方法及产酶技术，提高微生物产卡拉胶酶的能力及利用率，成为了国内外的科技工作者的主要方向。

[0005] 报道显示，不少研究工作者已采用紫外诱导、化学诱导及基因克隆等技术处理卡拉胶酶生产菌株，并有效地提高了其产酶量及酶活，但经过物理、化学及分子生物修饰的菌株产酶稳定性较差，且整个过程耗时耗力，又增加成本，因此仍然没有得到广泛应用。目前国内外研究中，尚没有报道具体的卡拉胶酶诱导物，且没有规模化的卡拉胶酶生产工厂线，因此寻求一种价廉高效的诱导物并应用于卡拉胶酶的生产成为本实验室科研者的研究方向。常见的产酶诱导物如蔗糖、麦芽糖、CMC、果糖等都已经广泛应用于其他蛋白酶的工业化诱导生产。本试验以κ-卡拉胶为专一碳源产酶的基础上，筛选获得一种或几种可有效辅助κ-卡拉胶酶发酵的诱导物或生长因子，以期简化发酵方法及成本，提高κ-卡拉胶酶的产量与活性。

发明内容

[0006] 本发明的目的是筛选一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物，以期提高菌株产酶能力。

[0007] 本发明的技术方案：

[0008] 一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物，所述组合诱导物组成成分按重量份计为0.5 1.5 份低聚果糖、1 3份κ-卡拉胶、0.5 1.5份酵母提取物。~ ~ ~

[0009] 所述低聚果糖：κ-卡拉胶：酵母提取物的最优配比为1：2：1。

[0010] 所述的海洋微生物为海旋菌、德沃斯氏菌、类芽孢杆菌。

[0011] 所述的组合诱导物用于海洋微生物产κ-卡拉胶酶的培养方法，包括如下步骤：

[0012] 1)斜面培养：取微生物菌株接种于斜面培养基中，28 ℃静置培养48 h，获得纯化菌株；

[0013] 2)种子培养：取纯化菌株接种于种子培养液中，25 ℃ 30 ℃摇床培养16 24 h，作~ ~为种子培养液；

[0014] 3)产酶培养：取种子培养液1 5 mL接种于含有所述组合诱导物的产酶培养基中，~25 ℃ 30 ℃摇床诱导培养36 48 h，检测κ-卡拉胶酶活力及含量。
~ ~

[0015] 斜面培养基的成分为：蛋白胨 5 g/L，酵母膏1 g/L，κ-卡拉胶15 g/L，人工海水800 mL，蒸馏水200 mL，pH 7.5±1。

[0016] 种子培养液的组分为：氯化钠15 g/L，κ-卡拉胶2 g/L，酵母膏1 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1。

[0017] 产酶培养基的成分为：氯化钠15 g/L，低聚果糖0.5 1.5 g/L，κ-卡拉胶1 3 g/L，~ ~酵母膏0.5 1.5 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL， pH 7.5±1。
~

[0018] 无机盐母液含有NaNO3 20 g/L；MgSO4·7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L。

[0019] κ-卡拉胶酶诱导组合物中，在以κ-卡拉胶为专一降解碳源的基础上，按一定比例复配低聚果糖及酵母膏为诱导引物，此组合物同时可应用于诱导其他微生物菌株提高产κ-卡拉胶酶能力，所述细菌为德沃斯氏菌（Devosiasp. fjfst-330）、类芽孢杆菌（Paenibacillussp. fjfst-333）。

[0020] 本发明的效益在于：κ-卡拉胶为κ-卡拉胶酶作用的专一底物，在发酵培养液中，加入一定配比的低聚果糖及酵母膏有利于微生物细菌生长产生κ-卡拉胶酶。本发明采用α-乳糖（一水）、低聚果糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、酵母膏、干酪素、蛋白胨等常见的廉价碳源及氮源为诱导物，结果表明，低聚果糖及酵母膏的诱导效果最好且不引入其他附加产物，其诱导效果与低聚果糖、κ-卡拉胶、酵母膏的含量及配比有关。该诱导物的发现可为其他卡拉胶酶产生菌开发新型诱导物提供一种新的配方。对于实现卡拉胶低聚糖产业化生产有重要的应用价值。

[0021] 以一定配比的低聚果糖、κ-卡拉胶、酵母提取物作为海洋微生物的产酶诱导物，发酵生产κ-卡拉胶酶。通过摇瓶振荡发酵48 h，海旋菌（Thalassospirasp. Fjfst-332）的κ-卡拉胶酶活力为351 U/mL，与不添加诱导物时，菌株κ-卡拉胶酶的酶活54.3 U/mL相比，提高了6.46倍。

附图说明

[0022] 图1不同碳源诱导物对κ-卡拉胶酶酶活力的影响。

[0023] 图2不同氮源诱导物对κ-卡拉胶酶酶活力的影响。

[0024] 图3为不同浓度低聚果糖、酵母膏诱导下κ-卡拉胶酶酶活力比较。

[0025] 图4 诱导物成分对菌株产κ-卡拉胶酶酶活力的影响。

具体实施方式

[0026] 以下是说明本发明的具体实施例，但本发明并不限于此：

[0027] 实施例1

[0028] 1.目标菌株：海旋菌（Thalassospirasp.）Fjfst-332（专利号2014100931304），从卡拉胶提取原料角叉菜中自主筛选获得。

[0029] 2.培养方法、培养基、诱导物

[0030] 2.1 培养方法

[0031] 1)斜面培养：取微生物菌株接种于斜面培养基中，28℃静置培养48 h，获得纯化菌株；

[0032] 2)种子培养：取纯化菌株接种于种子培养液中，25 ℃摇床培养24 h，作为种子培养液；

[0033] 3)产酶培养：取种子培养液3 mL接种于产酶培养基中，25 ℃摇床诱导培养36 h，检测κ-卡拉胶酶活力及含量。

[0034] 2.2 培养基

[0035] 1)斜面培养基：蛋白胨 5 g/L，酵母膏1 g/L，κ-卡拉胶15 g/L，人工海水800 mL，蒸馏水200 mL，pH 7.5±1；

[0036] 2)种子培养基：氯化钠15 g/L，κ-卡拉胶2 g/L，酵母膏1 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1（无机盐母液：NaNO3 20 g/L；MgSO4 7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L）；

[0037] 3)产酶培养基：氯化钠15 g/L，低聚果糖0.5 1.5 g/L，κ-卡拉胶1 3 g/L，酵母膏~ ~0.5~1.5 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1（无机盐母液：NaNO3 20 g/L；
MgSO4 7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L）。

[0038] 2.3 诱导物

[0039] 优选：低聚果糖1 g/L、κ-卡拉胶3 g/L、酵母膏1 g/L。

[0040] 3.κ-卡拉胶酶酶活测定

[0041] 取 l mL 酶液加入到盛有5 mL 0.2% 卡拉胶底物的试管中，于32 ℃恒温水浴反应60 min，对照组用 l mL灭活酶液和 5mL 底物溶液混合。以反应液中还原糖的增加量作为检测酶活力的指标。还原糖的测定则采用DNS法(3,5-二硝基水杨酸)。取 1 mL 反应液加 l mL DNS溶液，沸水浴反应5 min 后，冷却，定容至10 mL，于540 nm 下测定吸光值。以半乳糖做标准曲线，根据反应组和对照组吸光值的差值计算还原糖的产生量。1 个酶活力单位(U)定义为在32℃条件下，每分钟产生 1 µg 还原糖(以半乳糖计)所需要的酶量。

[0042] 表1卡拉胶酶培养基正交试验

[0043]

[0044] 表2 卡拉胶酶培养基优化正交试验结果

[0045]

[0046] 表3 正交设计方差分析表(完全随机模型）

[0047]

[0048] 实施例2

[0049] 4.目标菌株：海旋菌（Thalassospirasp.）Fjfst-332（专利号2014100931304），从卡拉胶提取原料角叉菜中自主筛选获得。

[0050] 5.培养方法、培养基、诱导物

[0051] 2.1 培养方法

[0052] 1)斜面培养：取微生物菌株接种于斜面培养基中，28℃静置培养48 h，获得纯化菌株；

[0053] 2)种子培养：取纯化菌株接种于种子培养液中，25 ℃摇床培养24 h，作为种子培养液；

[0054] 3)产酶培养：取种子培养液3 mL接种于产酶培养基中，25 ℃摇床诱导培养36 h，检测κ-卡拉胶酶活力及含量。

[0055] 2.2 培养基

[0056] 1)斜面培养基：蛋白胨 5 g/L，酵母膏1 g/L，κ-卡拉胶15 g/L，人工海水800 mL，蒸馏水200 mL，pH 7.5±1；

[0057] 2)种子培养基：氯化钠15 g/L，κ-卡拉胶2 g/L，酵母膏1 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1（无机盐母液：NaNO3 20 g/L；MgSO4 7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L）；

[0058] 3)产酶培养基：氯化钠15 g/L，低聚果糖0.5 1.5 g/L，κ-卡拉胶1 3 g/L，酵母膏~ ~0.5 1.5 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1（无机盐母液：NaNO3 20 g/L；
~
MgSO4 7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L）。

[0059] 2.3 诱导物

[0060] 试验量：低聚果糖1 g/L、κ-卡拉胶2g/L、酵母膏1 g/L。

[0061] 实施例3

[0062] 6.目标菌株：海旋菌（Thalassospirasp.）Fjfst-332（专利号2014100931304），从卡拉胶提取原料角叉菜中自主筛选获得。

[0063] 7.培养方法、培养基、诱导物

[0064] 2.1 培养方法

[0065] 1)斜面培养：取微生物菌株接种于斜面培养基中，28℃静置培养48 h，获得纯化菌株；

[0066] 2)种子培养：取纯化菌株接种于种子培养液中，25 ℃摇床培养24 h，作为种子培养液；

[0067] 3)产酶培养：取种子培养液3 mL接种于产酶培养基中，25 ℃摇床诱导培养36 h，检测κ-卡拉胶酶活力及含量。

[0068] 2.2 培养基

[0069] 1)斜面培养基：蛋白胨 5 g/L，酵母膏1 g/L，κ-卡拉胶15 g/L，人工海水800 mL，蒸馏水200 mL，pH 7.5±1；

[0070] 2)种子培养基：氯化钠15 g/L，κ-卡拉胶2 g/L，酵母膏1 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1（无机盐母液：NaNO3 20 g/L；MgSO4 7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L）；

[0071] 3)产酶培养基：氯化钠15 g/L，低聚果糖0.5 1.5 g/L，κ-卡拉胶1 3 g/L，酵母膏~ ~0.5 1.5 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1（无机盐母液：NaNO3 20 g/L；
~
MgSO4 7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L）。

[0072] 2.3 诱导物

[0073] 试验量：低聚果糖0.5 g/L、κ-卡拉胶3g/L、酵母膏1 g/L。

[0074] 实施例4

[0075] 1、其他试验菌株：德沃斯氏菌（Devosia .  sp）  fjfst-330（专利号2014100931465）、类芽孢杆菌（Paenibacillus. sp） fjfst-333（专利号2014100931272），自主筛选获得。

[0076] 2、培养方法、培养基、诱导物

[0077] 2.1 培养方法

[0078] 1)斜面培养：取微生物菌株接种于斜面培养基中，28℃静置培养48 h，获得纯化菌株；

[0079] 2)种子培养：取纯化菌株接种于种子培养液中， 30 ℃摇床培养24 h，作为种子培养液；

[0080] 3)产酶培养：取种子培养液5 mL接种于产酶培养基中， 30 ℃摇床诱导培养48 h，检测κ-卡拉胶酶活力及含量。

[0081] 2.2 培养基

[0082] 1)斜面培养基：蛋白胨 5 g/L，酵母膏1 g/L，κ-卡拉胶15 g/L，人工海水800 mL，蒸馏水200 mL，pH 7.5±1；

[0083] 2)种子培养基：氯化钠15 g/L，κ-卡拉胶2 g/L，酵母膏1 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1（无机盐母液：NaNO3 20 g/L；MgSO4 7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L）；

[0084] 3)产酶培养基：氯化钠15 g/L，低聚果糖0.5 1.5 g/L，κ-卡拉胶2 3 g/L，酵母膏~ ~0.5~1.5 g/L，无机盐母液100 mL，蒸馏水900 mL，pH 7.5±1（无机盐母液：NaNO3 20 g/L；
MgSO4 7H2O 5g/L；K2HPO4 10 g/L；CaC12 l g/L）。

[0085] 2.3 诱导物

[0086] 优选：低聚果糖1 g/L、κ-卡拉胶3 g/L、酵母膏1 g/L。

[0087] 1.κ-卡拉胶酶酶活测定

[0088] 取 l mL 酶液加入到盛有5 mL 0.2% 卡拉胶底物的试管中，于32 ℃恒温水浴反应60 min，对照组用 l mL灭活酶液和 5 mL 底物溶液混合。以反应液中还原糖的增加量作为检测酶活力的指标。还原糖的测定则采用DNS法(3,5-二硝基水杨酸)。取 1 mL 反应液加 l mL DNS溶液，沸水浴反应5 min 后，冷却，定容至10 mL，于540 nm 下测定吸光值。以半乳糖做标准曲线，根据反应组和对照组吸光值的差值计算还原糖的产生量。1 个酶活力单位(U)定义为在32℃条件下，每分钟产生 1 µg 还原糖(以半乳糖计)所需要的酶量。

[0089] 表4 低聚果糖对各菌株产酶的影响

[0090]

[0091] 在2 g/L κ-卡拉胶产酶培养基的基础上，添加其他碳源（1 g/L）诱导物，观察其对菌株Fjfst-332产酶的影响（图1。结果表明，额外添加低聚果糖、蔗糖时能有效地提高了发酵液的酶活。试验在2 g/L κ-卡拉胶产酶培养基的基础上，研究了几种有机氮源和无机氮源对菌株产酶的影响（图2），当以胰蛋白胨和酵母膏为氮源时，菌株获得较高的酶活，考虑到酶液中过多蛋白杂质会影响后期的酶的分离纯化，因此选取酵母膏为产酶培养基的氮源。

[0092] 低聚果糖是由1 3个果糖基通过β(2-1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果~三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。因此进一步研究低聚果糖中哪种成分对菌株Fjfst-332产酶起到诱导作用具有重要意义。结果表明（图4），一定浓度的低聚果糖类物质均能有效诱导菌株Fjfst-332增殖且提高其产κ-卡拉胶酶的能力，其中蔗果五糖与低聚果糖对菌株Fjfst-332产酶的诱导效果优于蔗果三糖与蔗果四糖。

[0093] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。