改良间接酶联免疫吸附法

摘要

本发明公开了间接酶联免疫吸附法。本发明提供了一种利用低纯度抗原检测待测样本的间接酶联免疫吸附法，包括如下步骤：1)将能结合低纯度抗原的抗体加入孔板进行包被，得到包被抗体孔板；2)将低纯度抗原加入所述包被抗体孔板各孔，进行抗原捕获，得到捕获抗原孔板；3)依次将含有能结合所述低纯度抗原的待测样本、结合待测样本的二抗、显色反应液加入孔板，在特定波长读取待测样本OD值，实现待测样本的间接酶联免疫吸附法检测。本发明的实验证明了，本发明的方法提高了欲包被抗原的纯度，同时降低了抗原包被所需的含量。

权利要求

1.低纯度抗原在制备检测待测样本OD值的间接酶联免疫吸附试剂盒中的应用，所述应用的步骤为：

1)将抗体加入孔板进行包被，得到包被抗体孔板；

所述抗体为低纯度抗原中标签的抗体，所述低纯度抗原为蛋白与标签连接后的融合蛋白；

2)将所述低纯度抗原加入所述包被抗体孔板各孔，进行抗原捕获，得到捕获抗原孔板；

3)依次将待测样本、酶标二抗加入孔板，反应，检测OD值，实现待测样本的间接酶联免疫吸附法检测；

所述低纯度抗原为纯度小于或等于70％的抗原；

所述低纯度抗原的氨基酸序列为序列2；

所述标签为HIS标签；

所述酶标二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG。

说明书

改良间接酶联免疫吸附法

技术领域

[0001] 本发明涉及酶联免疫吸附法，尤其涉及间接酶联免疫吸附法。

背景技术

[0002] 间接酶联免疫吸附法(ELISA)是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。重组蛋白在原核表达中由于其物理特性(自身结构，酸碱性等)差异，难免有些无法达到预期纯度，而影响ELISA的准确性。

发明内容

[0003] 本发明的一个目的是提供一种利用低纯度抗原检测待测样本的间接酶联免疫吸附法。

[0004] 本发明提供的间接酶联免疫吸附法，包括如下步骤：

[0005] 1)将抗体加入孔板进行包被，得到包被抗体孔板；

[0006] 所述抗体为低纯度抗原中标签的抗体，所述低纯度抗原为蛋白与标签连接后的融合蛋白；

[0007] 2)将所述低纯度抗原加入所述包被抗体孔板各孔，进行抗原捕获，得到捕获抗原孔板；

[0008] 3)依次将待测样本、酶标二抗加入孔板，反应，检测OD值，实现待测样本的间接酶联免疫吸附法检测。

[0009] 上述方法中，所述低纯度抗原为纯度小于或等于70％的抗原。

[0010] 上述方法中，所述标签为HIS标签；

[0011] 所述酶标二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG。

[0012] 上述的方法在检测待测样本是否为副肿瘤性天疱疮样本中的应用也是本发明保护的范围；

[0013] 或上述的方法在检测待测人是否为副肿瘤性天疱疮患者中的应用也是本发明保护的范围。

[0014] 本发明另一个目的是提供一种利用低纯度抗原检测或候选检测待测样本是否为副肿瘤性天疱疮样本的方法。

[0015] 本发明提供的方法，包括如下步骤：

[0016] 1)将抗体加入孔板进行包被，得到包被抗体孔板；

[0017] 所述抗体为低纯度抗原中标签的抗体，所述低纯度抗原为蛋白与标签连接后的融合蛋白；

[0018] 2)将所述低纯度抗原加入所述包被抗体孔板各孔，进行抗原捕获，得到捕获抗原孔板；

[0019] 3)依次将待测样本、酶标二抗、显色反应液加入孔板，在特定波长读取待测样本OD值，根据所述待测样本OD值和空白OD值，确定待测样本是否为副肿瘤性天疱疮样本；

[0020] 所述低纯度抗原为包斑蛋白或其截短体或其亚基与标签连接后的融合蛋白，所述低纯度抗原的纯度小于或等于70％。

[0021] 上述方法中，

[0022] 所述根据所述待测样本OD值和空白OD值，确定待测样本是否为副肿瘤性天疱疮样本包括如下步骤：根据所述检测孔和所述空白对照孔的OD值用Medcalc软件计算cut-off值；若待测样本的OD值大于cut-off值，则待测样本为或候选为副肿瘤性天疱疮患者；若待测样本的OD值不大于cut-off值，则待测样本不为或候选不为副肿瘤性天疱疮患者。

[0023] 上述方法中，

[0024] 所述低纯度抗原的氨基酸序列为序列2；

[0025] 所述待测样本为离体血清；

[0026] 所述特定波长为405nm；

[0027] 所述cut-off值为0.031。

[0028] 上述方法中，

[0029] 所述抗体为鼠源抗his标签抗体；

[0030] 所述二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG。

[0031] 上述方法中，

[0032] 在所述包被后每加入一种物质孵育完成后(显色反应除外)均要进行洗板的步骤。

[0033] 上述方法中，

[0034] 所述鼠源抗his标签抗体以鼠源抗his标签抗体溶液(溶剂为封闭液)的形式加入孔板；

[0035] 所述鼠源抗his标签抗体溶液的浓度为2.5ug/ml；所述鼠源抗his标签抗体的加样量50微升/孔；

[0036] 所述序列2所示的低纯度抗原以序列2所示的低纯度抗原溶液(溶剂为封闭液)的形式加入孔板；

[0037] 所述序列2所示的低纯度抗原溶液的浓度为4.375ug/ml；所述序列2所示的低纯度抗原溶液的加样量50微升/孔；

[0038] 所述碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG以碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG溶液(溶剂为封闭液)的形式加入孔板；

[0039] 所述碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG溶液的浓度为0.167ug/ml；所述碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG溶液的加样量50微升/孔；所述洗板采用的洗涤液为pH值为7.5浓度为0.02M的PBST；

[0040] 所述封闭采用的封闭液为将脱脂奶粉加入pH值为7.5浓度为0.02M的PBST中得到的溶液，使脱脂奶粉的质量百分含量为5％。

[0041] 本发明的实验证明了，本发明的方法在低纯度抗原包被前包被可通过特异性免疫反应与之作用的抗体，使低纯度抗原被该特异性抗体捕获，实现提高抗原纯度的目的，同时降低了抗原包被所需的含量；通过实验发现这种改良方法包被的纯度60％的抗原比常规间接法包被的纯度60％的抗原实验结果相比，具有更高的敏感度及特异度，并且差异具有统计学意义。

具体实施方式

[0042] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0043] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。MaxiSorp96孔板(Thermo Fisher 467466)、抗6组氨酸(his)鼠单克隆抗体(全式金生物有限公司HT501-01)、0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液(CBS)、脱脂奶粉(BD232100)、含0.05％Tween20的PH7.5磷酸盐缓冲液(PBST)、试验用含组氨酸标签的重组蛋白、待测样品、检测待测样品中抗体的特异性酶标二抗(life technologyies G-21060)、EL-P-NPP显色试剂盒(sangon biotech PW014)。

[0044] pH值为9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液(CBS)：1.59g碳酸钠(北京化工厂S0148)和2.93g碳酸氢钠(北京化工厂S0037)，溶于1L去离子水(millipore水机自制)，0.45um滤器(milliporeSLHV033RB)过滤，调节pH值，得到pH值为9.6浓度为0.05M的CBS。

[0045] pH值为7.5浓度为0.02M的PBST：将PBS粉剂(北京中杉金桥生物公司ZLI-9062)和Tween 20(Amresco 0777)溶于2L去离子水，PBS粉剂的浓度0.02M，Tween 20的体积百分含量为0.05％，调节pH值，得到pH值为7.5浓度为0.02M的PBST。

[0046] 封闭液：将脱脂奶粉加入上述pH值为7.5浓度为0.02M的PBST中得到的溶液，使脱脂奶粉的质量百分含量为5％。

[0047] 实施例1、间接酶联免疫吸附法

[0048] 一、抗原EVPL-N1的制备

[0049] EVPL-N1蛋白的氨基酸序列为序列2第6-146位氨基酸，其编码基因的核苷酸序列为序列1第16-438位核苷酸。

[0050] 1、重组载体的构建

[0051] 将序列表中序列1第16-438位核苷酸(为N1基因)所示的EVPL-N1蛋白编码基因插入pEASY-E2表达载体(全式金生物有限公司CE201-01)进行平端连接，得到的重组载体，命名为pEASY-E2-EVPL-N1实现EVPL-N1蛋白与载体上的MGIGP和his标签共表达，得到重组EVPL-N1。

[0052] 重组EVPL-N1的氨基酸序列为序列2，第1-5位为载体上的MGIGP，第6-146位为EVPL-N1蛋白，第147-158位为his标签；

[0053] 重组EVPL-N1的编码基因的核苷酸序列为序列1，第1-15位为载体上的MGIGP编码核酸，第16-438位为EVPL-N1蛋白编码基因，第439-477位为his标签编码基因。

[0054] 2、重组克隆感受态的构建

[0055] 将重组载体pEASY-E2-EVPL-N1导入大肠杆菌Trans1-T1(全式金生物有限公司CD5010-01)中，得到重组菌Trans1-T1-EVPL-N1。

[0056] 提取重组菌的质粒送去测序，质粒为pEASY-E2-EVPL-N1的为阳性重组质粒。

[0057] 3、EVPL-N1蛋白表达

[0058] 将上述的阳性重组质粒转化至表达感受态细胞Transetta(DE3)Chemically Competent Cell(全式金生物有限公司CD801-01)，在固态LB上挑取单克隆后摇菌，分装冻存。复苏表达感受态细胞，过夜培养后1:50接种至液态LB，37℃，200rpm/min,摇至OD600＝0.6，加入终浓度0.05mM的诱导剂IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,全式金生物有限公司GF101-01)，37℃，200rpm/min，诱导5小时。4℃，10000rpm离心10min收集菌体，并重悬至含蛋白酶抑制剂(罗氏Complete tablets EDTA-free,EASYpack 04693132001)的结合缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，PH 7.4)中，得到菌体悬浮液。

[0059] 4、纯化重组EVPL-N1蛋白

[0060] 菌体悬浮液冰浴中用超声破碎仪裂解(300W功率，超声5s停10s,持续20min)菌体，4℃，14000g，20min离心，取上清0.45um滤器过滤，加入咪唑，使其终浓度为10mM/L，使用镍柱亲和层析技术纯化，将准备好上清加入镍柱(Ni-NTAHis Bind Resins默克公司70666-3,流速1ml/min)4℃，100rpm，摇1小时，含15mM咪唑的漂洗缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，PH8.0，15mM咪唑)漂洗，250mM咪唑的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，PH 
8.0，250mM咪唑)洗脱目的蛋白。

[0061] 收集2倍柱体积的洗脱液即为分子质量为18.0KD重组EVPL-N1蛋白。

[0062] 将重组EVPL-N1蛋白进行SDS-PAGE电泳，目的蛋白EVPL-N1的分子质量为18.0KD；结合缓冲液100倍EVPL-N1蛋白体积，4℃条件下透析2次除去咪唑，以BSA标准品(PierceTM Bovine Serum Albumin Standard Ampules,23209,2mg/mL)为对照，经过染胶，扫描照片，在Bandscan软件分析目的蛋白的纯度。同时BCA法检测蛋白浓度。

[0063] 结果重组EVPL-N1的纯度为60％；重组EVPL-N1的浓度为3.5mg/ml。

[0064] 二、用于检测低纯度抗原的间接酶联免疫吸附法

[0065] 重组EVPL-N1的纯度为60％、浓度为3.5mg/ml。

[0066] 待测样本为27例副肿瘤性天疱疮患者(已经确诊，且患者知情，其血清可结合包斑蛋白)的血清样本和20例正常健康人的血清样本。

[0067] 用间接酶联免疫吸附法检测待测样本，具体如下：

[0068] 1、包被抗体：用pH值为9.6浓度为0.05M的CBS按照体积比为1：400稀释浓度为1mg/ml的鼠源抗his标签抗体(Transgen Biotech HT501-01)，得到包被抗体，按照每孔加入50微升包被抗体2.5ug/ml至96孔板，4℃过夜；

[0069] 次日用300微升pH值为7.5浓度为0.02M的PBST(含0.05％Tween-20)洗板三次，每次1分钟；

[0070] 扣干孔板，加入200微升封闭液封闭，室温，1小时；

[0071] 再次洗板(同上)，扣干孔板，得到包被抗体孔板；

[0072] 2、捕获抗原：用封闭液按照体积比为1:800稀释实施例1制备的纯度为60％、浓度为3.5mg/ml的重组EVPL-N1，得到稀释抗原，

[0073] 将稀释抗原按照每孔50微升4.375ug/ml加入上述包被抗体孔板，37℃，1小时；

[0074] 洗板(同上)，扣干孔板，得到捕获抗原孔板；

[0075] 3、加入待测样本：用封闭液按照体积比为1：100稀释待测样本，得到稀释待测样本，

[0076] 将稀释待测样本按照每孔100微升加入上述捕获抗原孔板，37℃，1小时；

[0077] 洗板4次，每次1分钟，扣干孔板，得到加入待测样本孔板；

[0078] 4、加入二抗：用封闭液按照体积比为1：6000稀释浓度为1mg/ml碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG二抗(Life technologies81-7122)，得到稀释二抗；

[0079] 将稀释二抗按照每孔50微升0.167ug/ml加入上述加入待测样本孔板，37℃，1小时；

[0080] 洗板4次，每次1分钟，扣干孔板，得到加入二抗孔板；

[0081] 5、避光环境下按照每孔加入100微升显色液(用去离子水按照体积比1：4稀释分析液(生工生物C510014-0500)，将试剂盒中10mg干粉p-NPP溶于10ml稀释过的分析液即配制成显色液)至二抗孔板中，室温30分钟后按照每孔加入50微升终止液(生工生物C510014-0500)。在显色试剂盒推荐的波长405nm下读结果。

[0082] 6、计算：Index＝样本读数OD405-空白对照孔读数OD405。

[0083] 结果如表1所示。

[0084] 表1

[0085]

[0086]

[0087] 经Medcalc软件分析，cut-off值为0.031。

[0088] 若待测样本的OD值大于0.031，则待测样本为或候选为副肿瘤性天疱疮患者；

[0089] 若待测样本的OD值不大于0.031，则待测样本不为或候选不为副肿瘤性天疱疮患者；

[0090] 灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％；

[0091] 特异度＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％；

[0092] 上述结果表明，采用重组EVPL-N1作为检测抗原，ELISA检测，27例实际为副肿瘤性天疱疮患者中有3例的OD值小于0.031，检测为非副肿瘤性天疱疮患者，本方法的检测敏感度92.59％(25/27)，50例正常志愿者中全部OD值不大于0.031，检测不为副肿瘤性天疱疮患者，特异性100％。

[0093] 因此，本发明的方法灵敏度和特异性都高。

[0094] 对比例1、常规方法检测低纯度抗原

[0095] 用如下方法检测实施例1中的27例副肿瘤性天疱疮患者(已经确诊，且患者知情)的血清样本和20例正常健康人的血清样本：

[0096] 1、包被抗原：用PH 9.6的CBS按照体积比1:100为稀释实施例1制备的纯度为60％、浓度为3.5mg/ml的重组EVPL-N1，按照每孔50微升加入96孔板，4℃过夜；

[0097] 次日用300微升pH值为7.5浓度为0.02M的PBST洗板三次，每次1分钟。

[0098] 扣干孔板，加入200微升封闭液封闭，室温，1小时；

[0099] 再次洗板(同上)，扣干孔板，得到包被抗原孔板；

[0100] 2、加入待测样本：用封闭液按照体积比为1：100稀释待测样本，得到稀释待测样本，

[0101] 将稀释待测样本按照每孔100微升加入上述抗原包被孔板，37℃，1小时；

[0102] 洗板4次，每次1分钟，扣干孔板，得到加入待测样本孔板；

[0103] 3、加入二抗：用封闭液按照体积比为1：6000稀释碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG二抗(Life technologies81-7122)，得到稀释二抗(原浓度为1mg/ml)；

[0104] 将稀释二抗按照每孔50微升加入上述捕获抗原孔板，37℃，1小时；

[0105] 洗板4次，每次1分钟，扣干孔板，得到加入二抗孔板；

[0106] 4、显色：同实施例中避光环境下按照每孔100微升量将显色反应液加入二抗孔板中，室温30分钟后按照每孔50微升加入终止液。在显色试剂盒推荐的波长405nm下读结果。

[0107] 5、计算：Index＝样本读数OD405-空白对照孔读数OD405。

[0108] 对比例结果

[0109] 结果如表2所示。

[0110] 表2

[0111]

[0112]

[0113] 对比例cutoff值为0.136，灵敏度为77.78％(21/27)，特异度80％。

[0114] 为进一步比较两种方法是否在诊断中有差异，在Medcalc软件中对两方法的ROC曲线进行统计学分析，得到下面表3-表5的结果。其中P值＝0.01(95％CI＝0.0306to 0.225)，差异有统计学意义(p<0.05)。

[0115] 表3为两方法ROC曲线比较

[0116]

[0117] a DeLong et al.,1988

[0118] b AUC±1.96SE

[0119] 注：AUC:曲线下面积，SE:标准误，CI:置信区间

[0120] 表4为ROC曲线的两两比较

[0121]

[0122] c DeLong et al.,1988

[0123] 注：AUC:曲线下面积，SE:标准误，CI:置信区间。