一种用于抑制肠道病毒感染的制剂

摘要

本发明公开了一种用于抑制肠道病毒感染的制剂。本发明提供了一种制剂在如下(1)或(2)中的应用：(1)制备用于抑制肠道病毒感染的产品；(2)用于抑制肠道病毒感染；所述制剂主要由表没食子儿茶素没食子酸酯、单宁酸和黄芪多糖混合而成；所述表没食子儿茶素没食子酸酯、所述单宁酸和所述黄芪多糖的质量配比为(0.5‑1.0)：(0.5‑1.0)：(0.5‑1.5)。本发明所提供的复合配方制剂的细胞毒性不高于已经获得安全许可的对照样品利巴韦林，较为安全。在安全的使用浓度下，预防性使用本发明所提供的制剂可以有效的抑制肠道病毒感染，具有进一步研发为肠道病毒感染抑制剂的商业价值。

权利要求

1.一种制剂在制备用于抑制肠道病毒感染的产品中的应用；

所述制剂由表没食子儿茶素没食子酸酯、单宁酸和黄芪多糖混合而成；所述表没食子儿茶素没食子酸酯、所述单宁酸和所述黄芪多糖的质量配比为1：1：1.5；

所述抑制肠道病毒感染为如下(a)或(b)：(a)预防肠道病毒感染；

(b)在与肠道病毒同时作用于宿主或宿主细胞时，抑制所述肠道病毒对所述宿主或所述宿主细胞的感染。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肠道病毒为肠道病毒71型。

说明书

一种用于抑制肠道病毒感染的制剂

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于抑制肠道病毒感染的制剂。

背景技术

[0002] 自20世纪70年代发现EV71，已有3次EV71引起的大范围HFMD流行，每次都有死亡病例的发生。EV71病毒在学龄前儿童特别是5岁以下年龄组发病率最高，除引发一般的手足口病的临床症状外，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病，给家庭和社会造成了沉重负担。

[0003] 植物化合物被称为“第七类营养素”，广泛存在于日常食物，是一类对人体健康具有特殊作用的非营养性化学物质。相关研究发现部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物活性，并逐渐成为抗病毒研究的热点之一。初步的研究结果显示：植物化合物的生物学效应主要表现在其对细胞膜生物学特性的影响和局部微环境平衡的改变等方面，部分植物化合物通过直接嵌入细胞膜脂质双层结构，改变细胞膜正常的功能性流动和电势电位差，进而发挥一定的生物学效应。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种抑制肠道病毒感染的制剂及其应用。

[0005] 本发明所提供的应用具体为一种制剂在如下(1)或(2)中的应用：

[0006] (1)制备用于抑制肠道病毒感染的产品；

[0007] (2)用于抑制肠道病毒感染；

[0008] 所述制剂主要由表没食子儿茶素没食子酸酯、单宁酸和黄芪多糖混合而成；所述表没食子儿茶素没食子酸酯、所述单宁酸和所述黄芪多糖的质量配比为(0.5-1.0)：(0.5-1.0)：(0.5-1.5)。

[0009] 在本发明的一个实施例中，所述用于抑制病毒感染的制剂具体由表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、单宁酸和黄芪多糖混合而成；所述表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、所述单宁酸和所述黄芪多糖的质量配比为1：1：1.5。

[0010] 在本发明中，所述抑制肠道病毒感染为如下(a)或(b)：

[0011] (a)预防肠道病毒感染；

[0012] (b)在与肠道病毒同时作用于宿主或宿主细胞时，抑制所述肠道病毒对所述宿主或所述宿主细胞的感染。

[0013] 更加具体的，在本发明的实施例中，所述制剂对所述肠道病毒感染的抑制作用具体体现为：以哺乳动物细胞作为肠道病毒感染对象，在肠道病毒感染细胞的同时或者在肠道病毒感染细胞前施用所述制剂，所述制剂对肠道病毒的半数抑制浓度与抑制病毒感染的阳性对照药物相比显著降低。所述阳性对照药物具体为利巴韦林(Ribavirin)。

[0014] 在本发明中，所述哺乳动物细胞(或(b)中所述的宿主细胞)具体为非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。

[0015] 在本发明中，所述肠道病毒为肠道病毒71型。更加具体的，所述肠道病毒为肠道病毒71型Hn2株。

[0016] 本发明以肠道病毒(Enterovirus，EV)为实验对象，采用观察细胞病变的方法，在不同的感染条件下，分别分析了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、单宁酸和黄芪多糖这三种植物化合物单体及其混合制剂抑制病毒感染的规律和特点。结果证实：本发明所提供的三种植物化合物单体和复合配方混合物的细胞毒性均不高于已经获得安全许可的对照样品利巴韦林，较为安全。在安全的使用浓度下，预防性使用EGCG和单宁酸等植物化合物单体以及植物提取物复合配方混合物，可以有效的抑制肠道病毒的感染。本发明所提供的制剂具有进一步研发为肠道病毒感染抑制剂的商业价值。

具体实施方式

[0017] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0018] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0019] 下述实施例中涉及的定量实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 17.0统计软件运用单因素水平方差分析的方法对组间比较数据进行统计处理。

[0020] 细胞株：非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，Vero细胞的编号为ATCC CCL-81，细胞按常规方法传代培养。

[0021] 病毒：肠道病毒(炎肠道病毒71型Hn2株，简称EV71-Hn2)记载于“Chang Guohui,Luo Yanjun,Wu Xiaoyan,Si Bingyin,Lin Lei and Zhu Qingyu.Monoclonal antibody induced with inactived EV71-Hn2virus protects mice against lethal EV71-Hn2virus infection.Virology Journal 2010,7:106)。一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。

[0022] 培养液：1)、细胞生长培养液：以DMEM培养基(Glibo公司产品)为母液，分别加入10％(体积分数)胎牛血清(Sigma公司产品)，0.2mg/ml谷氨酰胺(Glibo公司产品)，100U/ml青霉素，链霉素。2)、细胞维持培养液，胎牛血清含量为2％(体积分数)，其余与1)均相同。
3)、病毒增殖培养液：与细胞生长培养液相同。

[0023] 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)：Sigma公司产品(分析纯度>95％)，产品编号为E4143，CAS#989-51-5。

[0024] 单宁酸(Tannin)：Sigma公司产品(分析纯度>99％)，产品编号为V900190；CAS#1401-55-4。

[0025] 黄芪多糖(APS)：上海金穗生物科技有限公司产品(2-(Chloromethyl)-4-(4-nitrophenyl)-1,3-thiazole)(分析纯度>70％)，产品编号为JS11328；CAS#89250-26-0。

[0026] 阳性对照药物：利巴韦林(Ribavirin)，美仑生物公司产品。因目前还未有通过改变宿主细胞膜特性抑制病毒感染的标准阳性对照药物。本研究以目前抗病毒最常用药物利巴韦林作为对照。实验前以PBS缓冲液溶解，制成2560μg/ml过滤，除菌后，-20℃保存。

[0027] 倒置相差显微镜：日本Olympus公司产品。

[0028] 细胞培养箱：美国Thermo公司产品。

[0029] 多功能酶仪：美国Molecular Devices公司SpectraMax M5型多功能酶标仪。

[0030] 1、细胞复苏与传代

[0031] 液氮中取出Vero细胞，37℃水浴，融化后，以1000rpm离心5min，弃上清，加入适当的细胞生长培养液，反复吹打均匀，使细胞密度约为2×105个/ml，以10ml/瓶，于T25细胞培养瓶中，细胞培养箱中常规培养。24h后于镜下观察，细胞的贴壁情况，48-72h后，或待细胞生长到密度大约为95％时，弃原培养液，加入PBS缓冲液，漂洗两次，0.5ml 0.25％(0.25g/100ml)EDTA，于37℃培养箱中温育消化，当细胞收缩变圆时，迅速加入细胞生长培养液，终止消化，反复吹打均匀后，以1000rpm离心，5min，弃上清，使悬浮细胞浓度约为1×105个/ml，10ml/每瓶，移入T25细胞培养瓶，放置细胞培养箱，进行常规传代培养。

[0032] 2、病毒增殖

[0033] 取细胞生长密度约为80％的T25细胞培养瓶，弃原液，以PBS，漂洗两次，以去除血清残留，加入已稀释病毒(稀释液为PBS缓冲液)，接种量MOI＝0.01，以及1ml培养基，晃匀，置于细胞培养箱中吸附1h，弃上清，每瓶加入10ml相应病毒增殖培养液。观察细胞病变，48-72h后，或待细胞病变达75％以上时，收毒，取上清，反复冻融3次，以3000rpm，4℃，离心
5min，分装上清，并测定病毒滴度TCID50。

[0034] 3、病毒滴度TCID50测定

[0035] 采用致细胞病变法(CPE)测定，以单细胞悬液，加入96孔微量培养板中，每孔200μ5
l，使细胞量达到2×10 个/ml，细胞培养箱中培养48-72h，直至细胞单层密度约为80％时，取出，弃培养基，以PBS漂洗两遍，利用病毒增殖培养液将病毒原液10倍梯度稀释为10-3～
10-13，每浓度梯度8孔一列，每孔100μl，设立空白对照两列，于细胞培养箱中吸附1h，弃上清，后加入维持培养液200μl。每日镜下观察，当病毒对照组细胞病变为“++++”时记录实验结果。按Reed-Muench两氏法计算，病毒滴度TCID50。每组毒株，重复三次。

[0036] lgTCID50＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)×稀释度对数之间的差+lg(高于50％病变率的稀释度)。

[0037] 实施例1、植物提取物复合配方病毒感染抑制剂的制备

[0038] 将表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、单宁酸和黄芪多糖按照质量配比为1：1：1.5的比例混合均匀，得到植物提取物复合配方制剂。

[0039] 实验前以PBS缓冲液溶解，制成2560μg/ml(EGCG、单宁酸和黄芪多糖在溶液中的总浓度)过滤，除菌后，-20℃保存备用。

[0040] 实施例2、细胞毒性试验

[0041] 本实施例采用中性红吞噬法测定实施例1制备的复合配方制剂对哺乳动物细胞的细胞毒性。具体操作如下：

[0042] 将实施例1制备的复合配方制剂溶液(2560μg/ml)倍比梯度稀释，得到20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160μg/ml，320μg/ml，640μg/ml，1280μg/ml共6个浓度。然后将不同稀释度的稀释液分别添加至培养有Vero细胞且细胞密度约为80％的96孔细胞培养板中，每孔100μl，各个稀释度均做4个复孔，以正常细胞(即未添加复合配方制剂)作为对照，作用2h后，弃受试液，加入细胞维持培养液，每孔加入200μl，置于细胞培养箱中培养，48h后，每孔加入0.1％(0.1g/100mL)中性红25μl，于37℃中作用1.5h后，将每孔中的液体吸出，用PBS漂洗2次。每孔加入100μl的细胞裂解液(乙酸:乙醇:水＝1:50:49，体积比)，每孔加入100μl，且设空白对照，利用SpectraMax M5多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)，设定吸收光波长为492nm，测定OD值，通过单因素方差分析，比较各浓度组与对照组(正常细胞，即未添加复合配方制剂)OD值之间的统计学差异，确定实施例1制备的复合配方制剂的最大无毒性浓度(即与对照组OD值相比无统计学差异的最大浓度)。

[0043] 实验同时设置表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、单宁酸和黄芪多糖这三种化合物的单体作为复合配方制剂的单体对照；并设置抗病毒感染阳性对照药利巴韦林作为阳性对照。

[0044] 结果如表1所示，可见：复合配方制剂对Vero细胞的最大无毒性浓度为640μg/ml，与上市药物利巴韦林的最大无毒性浓度相同。可见，实施例1制备的植物化合物复合配方制剂具有较好的安全性。

[0045] 表1植物化合物单体和复合配方制剂的细胞最大无毒性实验结果

[0046]

[0047]

[0048] 实施例3、肠道病毒感染抑制试验

[0049] 本实施例采用CPE法测定实施例1制备的复合配方制剂对肠道病毒感染的抑制效果。供试肠道病毒为肠道病毒EV71-Hn2株。

[0050] 取已长成单层细胞生长密度约为80％的培养有Vero细胞的96孔培养板，倒掉培养液，用PBS漂洗细胞3遍后，分别以A，B，C三种条件下添加实施例1制备的复合配方制剂：

[0051] A.于病毒吸附同时：将等体积的2×100TCID50的肠道病毒的病毒液与2倍浓度的受试物溶液混合后，于细胞培养板中加入混合液100μl/孔，于细胞培养箱中，待病毒吸附1h后，弃之。PBS冲洗细胞面3遍后，加入细胞维持培养液。

[0052] B.于病毒吸附前：每孔加入相应稀释度的受试物溶液100μl，弃受试物溶液，PBS冲洗细胞面3遍后，加入滴度为100TCID50的肠道病毒的病毒液100μl，于细胞培养箱中，待病毒吸附1h后弃之。PBS冲洗细胞面3遍后，加入细胞维持培养液。

[0053] C.于病毒吸附后：100TCID50的肠道病毒的病毒液100μl/孔，于细胞培养箱中，待病毒吸附1h后弃之。加入相应稀释度的受试物溶液每孔100μl，弃受试物溶液，于细胞培养箱中吸附1h后弃病毒液。PBS漂洗3遍后，加入细胞维持培养液。

[0054] 其中，受试物为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、单宁酸和黄芪多糖这三种化合物的单体、实施例1制备的复合配方制剂，或抗病毒感染阳性对照药利巴韦林。受试物溶液的浓度设置如下浓度梯度：20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160μg/ml，320μg/ml，640μg/ml，1280μg/ml。

[0055] 每组实验设置空白对照与阳性对照组(阳性对照为只加入100TCID50病毒，空白对照只加入细胞维持培养液)，于细胞培养箱中培养,每日于倒置显微镜下观察，当病毒对照组(即阳性对照组)细胞病变为“++++”时记录实验结果。按Reed-Muench两氏法计算半数抑制浓度IC50。

[0056] 结果显示：在三种方式给药方式条件下，EGCG、植物复合配方制剂和利巴韦林均可干扰肠道病毒感染Vero细胞。其中，在病毒吸附同时和吸附前添加抑制剂的情况下，植物提取物复合配方制剂抑制病毒感染的效果最好，其病毒半数抑制浓度分别为131±13μg/ml和112±16μg/ml，而在病毒吸附后添加抑制剂的条件下，对照药品利巴韦林抑制病毒的效果较好，其病毒半数抑制浓度为357±31μg/ml。在单体抑制剂中，EGCG在病毒吸附前添加时，其抑制病毒的感染效果最好，病毒半数抑制浓度为196±12μg/ml，在病毒吸附后添加单宁酸和黄芪多糖时，均不能有效抑制肠道病毒的感染。具体结果见表2。

[0057] 表2各抑制剂的肠道病毒感染半数抑制浓度(IC50)

[0058]

[0059] 注：*表示与利巴韦林组比较，p<0.05。

[0060] 综合实施例2和3的实验结果，可见：本发明所提供的复合配方制剂的细胞毒性不高于已经获得安全许可的对照样品利巴韦林，较为安全。在安全的使用浓度下，预防性使用本发明所提供的植物提取物复合配方制剂，可以有效的抑制肠道病毒的感染。本发明所提供的复合配方制剂具有进一步研发为肠道病毒感染抑制剂的商业价值。

[0061] 对比例、不同配比的植物提取物复合配方制剂对肠道病毒感染的抑制效果比较[0062] 实验方法参见实施例3，受试物为实施例1制备的复合配方制剂、对照复合配方制剂1、对照复合配方制剂2、对照复合配方制剂3，或抗病毒感染阳性对照药利巴韦林，其余操作均同实施例3。其中，对照复合配方制剂1、对照复合配方制剂2和对照复合配方制剂3的配方如下：

[0063] 对照复合配方制剂1：将表没食子儿茶素没食子酸酯、单宁酸和黄芪多糖按照质量配比为0.5：1：0.5的比例混合而成。

[0064] 对照复合配方制剂2：将表没食子儿茶素没食子酸酯、单宁酸和黄芪多糖按照质量配比为1：0.5：1的比例混合而成。

[0065] 对照复合配方制剂3：将表没食子儿茶素没食子酸酯、单宁酸和黄芪多糖按照质量配比为1：1：1的比例混合而成。

[0066] 结果显示：对照复合配方制剂1、对照复合配方制剂2和对照复合配方制剂3对肠道病毒感染的半数抑制浓度(IC50)在A、B和C三种条件下均显著高于实施例1制备的复合配方制剂(p<0.05)。具体结果参见表3。

[0067] 表3不同复合配方制剂对肠道病毒感染半数抑制浓度(IC50)

[0068]

[0069]

[0070] 注：*表示与利巴韦林组比较，p<0.05。#表示与实施例1复合配方制剂组比较，p<0.05。