多种病原菌平行检测的滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及其检测方法

摘要

本发明公开了多种病原菌平行检测的滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及其检测方法，生物传感器包括太赫兹超材料、包被于太赫兹超材料反应区的识别不同病原菌的捕获探针和聚苯乙烯玻片，所述聚苯乙烯玻片覆盖于太赫兹超材料上层并且形成用于液相扩增反应的液膜腔隙；将滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器包被的捕获探针与滚环扩增的环形模板杂交，实现原位复制扩增，使用本发明的方法结果稳定可靠，可以在3小时之内对六种临床常见病原菌的平行检测。

权利要求

1.利用滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器平行检测多种病原菌的方法，其特征在于，所述生物传感器包括太赫兹超材料、包被于太赫兹超材料反应区的识别不同病原菌的捕获探针和聚苯乙烯玻片，所述聚苯乙烯玻片覆盖于太赫兹超材料上层并且形成用于液相扩增反应的液膜腔隙，所述太赫兹超材料由硅基底上周期性排列的金属开口谐振环组成，硅片为470μm厚，硅片上的金膜为200nm厚，每个周期由五个金属开口谐振环所组成，其检测方法包括如下步骤：(1)根据不同病原菌的16S rDNA序列设计与不同病原菌的待检测模板序列项匹配的锁式探针和特异识别待检测模板序列的捕获探针，所述锁式探针能够与待检测模板序列连接形成滚环扩增的环形模板；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示；所述模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～18所示，所述锁式探针为5’端经磷酸基修饰的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的序列；

(2)将不同病原菌培养后，提取不同病原菌的基因组DNA，所述病原菌为大肠埃希菌、痢疾志贺菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺炎链球菌；

(3)将锁式探针分别加入到含不同病原菌的基因组DNA的连接反应体系中连接，使待检测模板序列与锁式探针形成滚环扩增的环形模板；

(4)向步骤(3)所得含滚环扩增的环形模板的反应体系中分别加入Phi29DNA聚合酶，dNTPs混合液以及BSA；然后分别加入包被识别相应病原菌捕获探针的太赫兹超材料反应区进行滚环扩增反应；

(5)将滚环扩增反应的生物传感器采用太赫兹时域光谱仪在18～25℃采用透射模式进行测量，光路中配置有密闭装置并冲入高浓度氮气使检测池相对湿度降至2％以下；并以高阻硅的透射光谱作为样本的参考信号；在RCA反应前后分别测量太赫兹超材料反应区的透射光谱，根据共振频率位移判断不同病原菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液膜腔隙的高度为50μm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)为将锁式探针分别加入到含不同病原菌的基因组DNA的连接反应体系中至锁式探针终浓度为100nM，95℃变性5min后冰浴1min，然后置于45℃水浴箱中杂交反应20min；随后加入DNA连接酶和质量分数为0.05％的BSA，37℃条件下连接45min，在连接产物中加入核酸外切酶反应体系再加入10U的exonuclease I和exonuclease III，37℃反应15min后，95℃，5min灭活外切酶。

说明书

多种病原菌平行检测的滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器

及其检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于检测领域，具体涉及多种病原菌平行检测的滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器，还涉及利用该生物传感器对多种病原菌平行检测的方法。

背景技术

[0002] 快速准确检测病原菌的种属，对于临床感染性疾病的诊断和后续治疗至关重要。目前在临床微生物学中，根据细菌培养后的酶学和生化反应特性的诊断方法仍被广泛采用，这种经典方法虽然准确但是往往随需时间较长，通常在细菌分离培养后还需要1-7天来进行复杂的生化反应实验才能准确获取病原菌的类型。虽然近年来出现的基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱被称为革命性的细菌鉴定方法，可在细菌培养后省略了生化反应实验，直接通过细菌特异性的电荷比来区分不同类新致病菌，其只能检测单一类型样本无法检测混合样本。虽然荧光PCR方法可以通过多种荧光标记同时检测几种病原菌，荧光染料间的干扰影响其检测特异性。因此，建立一种快速无标记的、可同时检测多种病原菌的方法对于临床感染性疾病的诊断具有非常重要的意义。

[0003] 太赫兹(Terahertz，THz)辐射是指频率为0.1～10THz的电磁波，由于其波段位于微波和红外之间，相比于紫外可见吸收光谱、X射线成像分析等传统技术，THz光谱有其独特的优势。太赫兹超材料是指与其相互作用为THz波段电磁波的新型人工材料，可对THz波的振幅和相位等进行灵活的控制。金属开口谐振环(SRR)是目前最常见的超材料结构类型，如果把SRR看作为一个电感电容电路元件，超材料的共振频率即可表示为其中L和C分别是电感和电容。电感主要是所制备超材料的几何参数
所决定，而电容与电容器的有效介电常数密切相关。当超材料表面覆盖物质后或者物质改变后，其局域有效介电常数的改变会引起电容的改变，从而导致其共振频率的改变。因此，可通过检测太赫兹超材料共振频率的位移来实现微量标本的检测。

[0004] 滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是一种恒温的DNA扩增过程，避免了传统PCR的复杂热循环带来的非特异性扩增和不兼容性等技术缺陷。RCA可在固相载体上实现捕获探针的固定，同靶序列杂交后，建立生物传感器芯片表面的滚环扩增系统。但是，目前RCA主要通过琼脂糖凝胶电泳检测，周期长，结果稳定性差。

[0005] 因此，急需一种结果稳定可靠，能够在较短周期内完成多种病原菌的平行检测。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供多种病原菌平行检测的滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器；本发明的目的之二在于提供利用所述滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器平行检测多种病原菌的方法。

[0007] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0008] 1、多种病原菌平行检测的滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器，所述生物传感器包括太赫兹超材料、包被于太赫兹超材料反应区的识别不同病原菌的捕获探针和聚苯乙烯玻片，所述聚苯乙烯玻片覆盖于太赫兹超材料上层并且形成用于液相扩增反应的液膜腔隙。

[0009] 本发明中，太赫兹超材料由硅基底上周期性排列的金属开口谐振环组成，硅片为470μm厚，硅片上的金膜为200nm厚，每个周期由五个金属开口谐振环所组成。优选的，将太赫兹超材料分为为5个独立反应区域。

[0010] 本发明中所述液膜腔隙的高度优选为50μm。

[0011] 本发明中，所述不同病原菌为大肠埃希菌、粪肠球菌、痢疾志贺菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中的至少一种。

[0012] 优选的，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示。

[0013] 更优选的，还包括滚环扩增的环形模板，所述环形模板由不同病原菌的待检测模板序列与相匹配的锁式探针通过连接酶连接形成的环形DNA分子。

[0014] 最优选的，所述待检测模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～18所示，所述锁式探针为5’端经磷酸基修饰的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的序列。

[0015] 2、利用所述滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器平行检测多种病原菌的方法，包括如下步骤：

[0016] (1)根据不同病原菌的16S rDNA序列设计与不同病原菌的待检测模板序列项匹配的锁式探针和特异识别待检测模板序列的捕获探针，所述锁式探针能够与待检测模板序列连接形成滚环扩增的环形模板；

[0017] (2)将不同病原菌培养后，提取不同病原菌的基因组DNA；

[0018] (3)将锁式探针分别加入到含不同病原菌的基因组DNA的连接反应体系中连接，使待检测模板序列与锁式探针形成滚环扩增的环形模板；

[0019] (4)向步骤(3)所得含滚环扩增的环形模板的反应体系中分别加入Phi29DNA聚合酶，dNTPs混合液以及BSA；然后分别加入包被识别相应病原菌捕获探针的太赫兹超材料反应区进行滚环扩增反应；

[0020] (5)将滚环扩增反应的生物传感器采用太赫兹时域光谱仪在18～25℃采用透射模式进行测量，光路中配置有密闭装置并冲入高浓度氮气使检测池相对湿度降至2％以下；并以高阻硅的透射光谱作为样本的参考信号；在RCA反应前后分别测量太赫兹超材料反应区的透射光谱，根据共振频率位移判断不同病原菌。

[0021] 本发明中，所述病原菌为大肠埃希菌、痢疾志贺菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺炎链球菌中的至少一种。

[0022] 优选的，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示；所述模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～18所示，所述锁式探针为5’端经磷酸基修饰的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的序列。

[0023] 更优选的，所述步骤(3)为将锁式探针分别加入到含不同病原菌的基因组DNA的连接反应体系中至锁式探针终浓度为100nM，95℃变性5min后冰浴1min，然后置于45℃水浴箱中杂交反应20min；随后加入DNA连接酶和质量分数为0.05％的BSA，37℃条件下连接45min，在连接产物中加入核酸外切酶反应体系再加入10U的exonuclease I和exonuclease III，37℃反应15min后，95℃，5min灭活外切酶。

[0024] 发明的有益效果：本发明公开了滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器，通过将将太赫兹超材料和RCA有机结合，通过设计六种常见致病菌的DNA的锁式探针(Padlock Probe，PLP)，特异识别基因组靶序列，通过连接酶连接成环形DNA分子，作为滚环扩增的环形模板，其靶序列与固定在超材料上的捕获探针杂交，实现了原位复制扩增。由于DNA分子的有效扩增、分子链延长，导致超材料表面的有效介电常数发生改变，使得太赫兹超材料的共振频率发生位移。当在超材料表面不同区域中分别固定特定病原菌的捕获探针后，从而可以通过监测太赫兹超材料特定区域的反应前后的共振频率的改变检测特定类型的病原菌。由于不同类新病原菌的扩增反应在同一片超材料的不同区域进行，从而可以通过监测不同区域反应前后共振频率的改变实现同时多种病原菌的平行检测。其反应快速灵敏，可实现3小时内对六种临床常见病原菌的平行检测。

附图说明

[0025] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

[0026] 图1为太赫兹超材料结构的光镜示意图。

[0027] 图2为滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器的侧面结构示意图。

[0028] 图3为滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器的原理示意图。

[0029] 图4为RCA反应前后太赫兹超材料共振频率的变化。

具体实施方式

[0030] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0031] 用于多种病原菌平行检测的滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器，包括太赫兹超材料、包被于太赫兹超材料反应区识别多种病原菌的捕获探针和聚苯乙烯玻片，所述聚苯乙烯玻片覆盖于太赫兹超材料上层并且形成用于液相扩增反应的液膜腔隙，液膜腔隙高度约为50μm；其中太赫兹超材料结构如图1所示，由硅基底上周期性排列的金属开口谐振环组成，硅片为470μm厚，硅片上的金膜为200nm厚，每个周期由五个金属开口谐振环所组成，太赫兹超材料由现有光刻技术制备(图1)。为检测不同的模板，将超材料分隔多个独立地反应区域，如本实施例分为6个独立的反应区域，分别包被检测不同病原菌的捕获探针(图2)。

[0032] 利用滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器平行检测多种病原菌的方法，具体步骤如下：

[0033] (1)探针及模板设计：以大肠埃希菌(E.coli)、粪肠球菌(E.faecalis)、痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)6种菌作为检测对象：然后根据NCBI核酸数据库和基因分析软件，采用Primer premier5.0软件对各种病原菌16S rDNA序列设计相应的锁式探针、识别不同病原菌的捕获探针和不同病原菌待检测模板序列，具体见表1所示；

[0034] (2)标本准备：六种病原菌的标准菌株，大肠埃希菌标准菌株ATCC 25922、痢疾志贺菌标准菌株ATCC 51105、粪肠球菌标准菌株ATCC 29212、金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923、表皮葡萄球菌标准菌株ATCC 12228、肺炎链球菌标准菌株ATCC 49619，均购于卫生部临床检验中心；将冻存的标准菌株接种于哥伦比亚血琼脂平板，在温度为37℃、CO2体积分数为5％的恒温孵箱中培养过夜，培养后挑选无污染、形态典型的单菌落，利用灭菌生理盐水充分润洗去除培养基成分，随后离心富集，重悬于灭菌生理盐水中，根据麦氏比浊法配置成浓度大约为108CFU/ml的菌液；取1ml细菌菌液，加入到1.5ml的离心管中，在室温(18～25℃)条件下，8000rpm，2min，去除上清液，收集细菌沉淀；将收集的细菌沉淀按照TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0使用说明书提取病原菌基因组DNA，把提取的基因组DNA溶于CE缓冲液中，3min后12000rpm室温离心2min，然后收集DNA溶液从而获取不同病原菌的基因组DNA；

[0035] (4)RCA反应准备：把线性锁式探针(终浓度为100nM)与含有不同病原菌待检测模板序列的基因组DNA溶液加入到10μL的连接反应体系(pH7.8，30mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，4mM MgCl2，0.1mMNAD，1.2mM EDTA)中，震荡混匀，在95℃实验条件下进行变性5min后，立即冰浴3min，然后把反应体系混合液放入60℃的水浴箱中进行杂交反应，持续30min；杂交反应结束后加入质量分数为0.05％的BSA和5U的E.coli DNA连接酶，在37℃条件下连接
45min；将连接混合液加入到20μL的核酸外切酶酶切体系(pH 9.5，67mM glycine-KOH，1mM DTT，6.7mM MgCl2)中，体系中含有10U的Exonuclease I和Exonuclease III，酶切反应在37℃反应30min，然后在95℃实验条件下持续5min灭活核酸外切酶，获得滚环扩增的环形模板。

[0036] (5)RCA反应：将上述含有滚环扩增的环形模板的反应体系中加入0.5U/μL Phi29DNA聚合酶，1mM dNTPs混合液以及0.2μg/μL BSA，在包被对应病原菌的捕获探针的太赫兹超材料反应区域分别加入含滚环扩增的环形模板的反应体系，在温度为37℃条件下RCA反应1小时，由于锁式探针和匹配模板序列互补杂交成环形DNA分子，在Phi29DNA聚合酶作用下启动了RCA反应，将dNTPs转变成一条长的单链DNA片段不断延长(图3)[0037] (6)太赫兹光谱检测：实验采用太赫兹时域光谱仪(THz-TDS，Terahertz time-domain spectroscopy)在室温(18～25℃)下采用透射模式进行测量，为了避免水蒸气的强烈吸收影响检测结果，在光路中配置有密闭装置并冲入高浓度氮气，使检测池相对湿度降至2％以下；并测量高阻硅的透射光谱作为样本的参考信号，以消除硅片本身带来F-P驻波的影响；在RCA反应前分别测量太赫兹超材料6个不同区域的透射光谱，反应1h后再次测量，分别除以高阻硅的透射光谱后进行比较，结果如图4所示。结果显示，太赫兹超材料各区域中由于捕获探针与反应产物结合导致超材料表面微环境有效介电常数的改变，导致反应前后超材料的共振频率发生位移。

[0038] 表1、探针及模板序列设计

[0039]

[0040]

[0041] 有效性验证：按照上述方法检测大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的混合菌液。提取出基因组DNA标本后，分别和六种锁式探针混合成六个反应体系，分别加入太赫兹超材料的六个不同区域，检测反应前后太赫兹超材料的共振频率的改变，结果如表2。结果显示，第一个区域和第六个区域，由于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌匹配模板的存在，和锁式探针结合后进行环形DNA分子，启动RCA反应，导致共振频率蓝移(右移)，而在另外四个区域对应的锁式探针未能成环，无法启动RCA反应，共振频率无明显改变。说明本发明结果准确可靠，不会导致假阳性结果产生。

[0042] 表2检测混合菌液反应前后太赫兹超材料的共振频率的改变

[0043]

[0044] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。