进行抗体表达和组装的重组系统及应用

摘要

本发明属于分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及抗体表达和组装的重组系统及应用，公开一种表达抗体重链和轻链的真核表达载体，其目的是提供一种重组真核表达载体及其构建方法，便于表达各类抗体。本发明还公开了pRTL1‑HC和pRTL1‑LC的上述真核表达载体的应用。本发明是以表达IgG抗体重链和轻链的真核表达载体为基础，进一步能够表达包括IgG抗体、Fab抗体、Fv抗体、人源化ScFv‑Fc抗体以及鼠/人嵌合抗体等各类不同功能的抗体，有助于提高抗体表达Fv、Fab及ScFv等片段的表达效率，为能够成功表达各种不同功能的抗体提供重要的参考。

权利要求

1.一种进行抗体表达和组装的重组系统，其特征在于，所述重组系统包括宿主细胞和重组载体；所述宿主细胞为CHO细胞或293F细胞；所述重组载体包括重链区域表达载体pRTL1-HC和轻链区域表达载体pRTL1-LC，重组载体的载体骨架为pRTL载体；

所述重组载体的构建方法如下：

（1）pRTL1-HC改造设计

a. 将含有Fd区域的pFabZip1克隆载体GenBank：AY190524中2364bp到2666bp的序列，与pFUSE-hFc2-adapt-ScFv载体GenBank：FJ716123上的CH1、CH2、CH3恒定区序列融合得到融合片段Fd-CH1-CH2-CH3；在融合片段的Fd端上加EoRI酶切位点，CH3端上加NheI酶切位点，人工合成该部分元件序列如SEQ ID NO：13所示；

b. 如SEQ ID NO：13所示的元件序列和改造载体pFUSE-hFc2-adapt-ScFv分别经EcoRI和NheI双酶切后连接，完成表达完整的具有铰链区的IgG重链质粒的构建，命名为pRTL载体；

c. 以抗HER2抗体的VH序列为模板，从EcoRI处设计正向引物a如SEQ ID NO：5所示，再设计反向引物b如SEQ ID NO：6所示，扩增VH序列；正向引物c如SEQ ID NO：7所示，CH3尾加XbaI切点设计的反向引物d如SEQ ID NO：8所示，一同扩增Fd-CH1-CH2-CH3融合序列；通过重叠延伸PCR将VH和Fd-CH1-CH2-CH3进行融合得VH-Fd-CH1-CH2-CH3；

d. 用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和XbaI双酶切的VH-Fd-CH1-CH2-CH3融合产物和经EcoRI和NheI双酶切的pRTL载体，其中XbaI和NheI为同尾酶，经连接后，这两个酶切位点消失，得到pRTL1-HC载体；

（2）pRTL1-LC改造设计

a. 将pMThIgG1-V表达载体GenBank：AM408495中562bp到885bp的CL区域序列如SEQ ID NO：14所示，通过人工合成得到具有EcoRI、BsiWI和NheI酶切位点的CL区域片段；

b. 将人工合成的CL区域序列经EcoRI和NheI双酶切后连接到经同样EcoRI和NheI双酶切的pFUSE-hFc2-adapt-ScFv骨架载体上，完成表达抗体轻链的质粒的构建，命名为pRTL’载体；

c. 以抗HER2抗体的VL序列为模板，从EcoRI处设计正向引物e序列如SEQ ID NO：9所示，从CL的端BsiWI酶切位点序列处设计反向引物f如SEQ ID NO：10所示和正向引物g如SEQ ID NO：11所示，从NheI处设计反向引物h如SEQ ID NO：12所示，PCR扩增VL序列；

d. 用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和BsiWI双酶切的步骤c中纯化的PCR产物和pRTL’载体，得到pRTL1-LC载体；

（3）以pRTL1-HC和pRTL1-LC重组载体共转染宿主细胞，表达完整的IgG抗体；

所述重链区域表达载体用EcoRI和NheI双酶切并与所需的VH连接，转化获得质粒，转染真核细胞即可表达不同抗体的IgG重链；所述轻链区域表达载体用EcoRI和BsiWI双酶切并与所需的VL连接，转化获得质粒，转染真核细胞表达不同抗体的轻链；所述重组系统在共转染宿主细胞后表达抗体；

所述pRTL载体骨架包含启动子和信号肽，启动子为两种复合启动子，选自hFerL、hEF1-HTLV、u6、H1、GAP或CaMV，信号肽选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2、Igkappa或hGHRH。

2.如权利要求1所述的进行抗体表达和组装的重组系统，其特征在于，所述重组载体的测序引物，正向测序引物序列如SEQ ID NO：15所示，反向测序引物如SEQ ID NO：16所示。

3.如权利要求1所述的进行抗体表达和组装的重组系统，其特征在于，所述重组载体可分别编码抗体的重链和轻链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.如权利要求1所述的进行抗体表达和组装的重组系统，其特征在于，所述抗体片段选自IgG、Fab、Fv或ScFv-Fc。

5.如权利要求1所述的进行抗体表达和组装的重组系统，其特征在于，所述pRTL1-HC表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，pRTL1-LC表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

说明书

进行抗体表达和组装的重组系统及应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及抗体表达和组装的重组系统及应用。技术背景

[0002] 自抗体研究以来，许多棘手的临床疾病对于医生来说并非不可能。随着技术的不断发展，抗体的研究也有了突飞猛进的进步。抗体的研究也进入新阶段，从最初简单的抗体到鼠源化抗体，再到如今的人源化抗体。如今人源化抗体的不断进步和完善，在医学领域得到了广泛应用，在医学领域的应用已显示出它巨大的潜力。

[0003] 人源化抗体是在嵌合抗体的基础上减少鼠源成分，保留鼠抗体CDR区，其余全部替换成人抗体相应部分，经过改型抗体，人源成分达90％即为所指的人源化抗体。在疾病治疗中，人源化抗体优于鼠源化抗体，不仅因为抗体中鼠源性成分的减少降低了机体的免疫排斥反应，还在于人源化抗体中Fc段，能够诱发机体的效应机能募集效应因子或效应细胞，后者对靶细胞具有杀伤作用。还有一个优点在于人源化抗体在体内的半衰期可达数天，而鼠源抗体的半衰期则不到20h。

[0004] 随着抗体工程的发展，建立在噬菌体外壳表达抗体片段的能力基础上的噬菌体展示技术产生，即从免疫后的脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体上，并在适当的宿主细胞中表达成有功能的抗体分子，从而利用抗原-抗体特异性结合进行筛选、扩增，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。

[0005] 近几年来，随着对鼠单克隆抗体的人源化技术越来越成熟，大量的人源化抗体被用于临床治疗肿瘤疾病研究，它已成为继手术切除、放疗及化疗后又一治疗肿瘤的药物。因此研究有利于表达人源化抗体的载体骨架也变的至关重要。

[0006] 以pRTL骨架为基础的表达人源化抗体的真核载体已有一些研究，pRTL质粒的特点：

[0007] hEF1-HTLV启动子是一个含有延伸因子-1α(EF-1α)核心启动子和人类T细胞白血病病毒(HTLV)I型长末端重复区域的R片段和R-U5，序列的复合启动子。在体外转基因研究中EF-1α启动子展示出很强的活性，并启动产生持久的表达。R-U5，和EF-1α一同以提高RNA的稳定性。

[0008] SV40pAn：猿猴病毒40晚期多聚腺苷酸化信号促使有效的分割和聚腺苷酸化反应，导致大量稳定态mRNA的产生。

[0009] Ori：一个最短的E.coli复制起点，它可用来控制载体的大小，但是与长的Ori具有相同的活性。

[0010] CMV enhancor/hFerLpromter:这种复合启动子由人类巨细胞病毒immediate-early基因1增强子和人类铁蛋白轻链基因的核心启动子所组成。这个普遍存在的启动子引导ZeocinTM抗性基因在哺乳动物细胞中的表达。

[0011] EM2KC：是一个细菌启动子，它能够使抗性基因在E.coli细胞内中持续表达。EM2KC位于内含子内，是在哺乳动物细胞中被剪切掉。

[0012] βGlopAn:人beta-globin 3，UTR和多腺苷酸化序列能够让转基因转录得到有效捕获。

[0013] Human IgHG1(IgG1重链恒定区)：当将重链可变区插入到多克隆位点时，务必注意读码框的正确，以保证重链恒定区的完整。

[0014] Zeocin：抗Zeocin抗性序列是来源于Streptoalloteichushindustanus的Shble基因。这个基因可用于哺乳动物和原核生物如E.coli的抗性选择。这种抗生素可用来分离对其它筛选剂(如：庆大霉素，潮霉素)有抗性的克隆。Zeocin是一种属于争光霉素家族的糖蛋白抗生素，在体内能作用于大多数细菌(包括E.coli)、真菌(如：酵母菌)、植物细胞、动物细胞。

[0015] 所述重组载体为一种穿梭质粒，具有两种不同复制起点，因而可以在真核和原核两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。为了提高表达效率，本载体在起始密码子侧翼加上了Kozak序列，后期在设计插入基因时不必考虑Kozak序列的引入问题。所述重组载体是真核原核细胞共用一个抗性筛选标记，为：zeocin抗性，在原核质粒制备系统中的使用浓度为25μg/ml，在真核表达系统中的筛选浓度约为500μg/ml，不同真核细胞抗性筛选浓度稍有不同。

[0016] 将插入序列连接到由限制性内切酶酶切的载体后，在原核细胞中纯化质粒，共转染至相对应的真核宿主细胞(293F细胞或CHO细胞)，表达具有功能的各类抗体。

发明内容

[0017] 本发明提供一种进行抗体表达和组装的重组系统，所述重组系统包括宿主细胞和重组载体。

[0018] 本发明的技术方案是：

[0019] 一种进行抗体表达和组装的重组系统，所述重组系统包括宿主细胞和重组载体。

[0020] 所述宿主细胞为CHO细胞或293F细胞。

[0021] 所述重组载体包括重链区域表达载体pRTL1-HC和轻链区域表达载体pRTL1-LC，重组载体的载体骨架为pRTL载体。

[0022] 所述重组载体的测序引物，正向测序引物序列如SEQ ID NO：15所示，反向测序引物如SEQ ID NO：16所示。

[0023] 所述重组载体可分别编码抗体的重链和轻链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0024] 所述抗体片段选自IgG、Fab、Fv或ScFv-Fc。

[0025] 所述pRTL载体骨架包含CMV enhancor/hFerL promter复合启动子和IL2信号肽，启动子和信号肽不限于一种，可选自hFerL、hEF1-HTLV、u6、H1、GAP或CaMV，信号肽可选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2、Igkappa或hGHRH。

[0026] 所述pRTL1-HC表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的，pRTL1-LC表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的。

[0027] 所述重组载体的构建方法如下：

[0028] (1)pRTL1-HC改造设计

[0029] a.将含有Fd区域的pFabZip1克隆载体GenBank：AY190524中2364bp到2666bp的序列，与pFUSE-hFc2-adapt-ScFv载体GenBank：FJ716123上的CH1、CH2、CH3恒定区序列融合得到融合片段Fd-CH1-CH2-CH3；在融合片段的Fd端上加EoRI酶切位点，CH3端上加NheI酶切位点，人工合成该部分元件序列如SEQ ID NO：13所示；

[0030] b.如SEQ ID NO：13所示的元件序列和改造载体pFUSE-hFc2-adapt-ScFv分别经EcoRI和NheI双酶切后连接，完成表达完整的具有铰链区的IgG重链质粒的构建，命名为pRTL载体；

[0031] c.以抗HER2抗体的VH序列为模板，从EcoRI处设计正向引物a如SEQ ID NO：5所示，再设计反向引物b如SEQ ID NO：6所示，扩增VH序列；正向引物c如SEQ ID NO：7所示，CH3尾加XbaI切点设计的反向引物d如SEQ ID NO：8所示，一同扩增Fd-CH1-CH2-CH3融合序列；通过重叠延伸PCR将VH和Fd-CH1-CH2-CH3进行融合得VH-Fd-CH1-CH2-CH3；

[0032] d.用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和XbaI双酶切的VH-Fd-CH1-CH2-CH3融合产物和经EcoRI和NheI双酶切的pRTL载体，其中XbaI和NheI为同尾酶，经连接后，这两个酶切位点消失，得到pRTL1-HC载体；

[0033] (2)pRTL1-LC改造设计

[0034] a.将pMThIgG1-V表达载体GenBank：AM408495中562bp到885bp的CL区域序列如SEQ ID NO：14所示，通过人工合成得到具有EcoRI、BsiWI和NheI酶切位点的CL区域片段；

[0035] b.将人工合成的CL区域序列经EcoRI和NheI双酶切后连接到经同样EcoRI和NheI双酶切的pFUSE-hFc2-adapt-ScFv骨架载体上，完成表达抗体轻链的质粒的构建，命名为pRTL’载体；

[0036] c.以抗HER2抗体的VL序列为模板，从EcoRI处设计正向引物e序列如SEQ ID NO：9所示，从CL的端BsiWI酶切位点序列处设计反向引物f如SEQ ID NO：10所示和正向引物g如SEQ ID NO：11所示，从NheI处设计反向引物h如SEQ ID NO：12所示，PCR扩增VL序列；

[0037] d.用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和BsiWI双酶切的步骤c中纯化的PCR产物和pRTL’载体，得到pRTL1-LC载体；

[0038] (3)以pRTL1-HC和pRTL1-LC重组载体在共转染宿主细胞，表达完整的IgG抗体。

[0039] 所述重链区域表达载体用EcoRI和NheI双酶切并与所需的VH连接，转化获得质粒，转染真核细胞即可表达抗体的IgG重链；所述轻链区域表达载体用EcoRI和BsiWI双酶切并与所需的VL连接，转化获得质粒，转染真核细胞表达抗体的轻链；所述重组系统在共转染宿主细胞后表达抗体。

[0040] 本发明的有益效果：

[0041] 1.本发明利用分子克隆技术可将抗HER2、CD3等抗体序列克隆至真核表达载体，并使其在细胞中大量表达，且纯化得到其表达产物，为表达人类IgG抗体提供重要的参考。

[0042] 2.本发明专利的主要优势在于在不改变抗体骨架氨基酸的序列前提下，能够高效表达相对应的由H链和L链组成的天然状态的人源抗体。

[0043] 3.本发明中的重组载体是真核原核细胞共用一个抗性筛选标记，为zeocin抗性，在原核质粒制备系统中的使用浓度为25μg/ml，在真核表达系统中的筛选浓度约为500μg/ml。

[0044] 说明书附图

[0045] 图1为表达抗体重链的重组质粒图谱；

[0046] 图2为表达抗体轻链的重组质粒图谱；

[0047] 图3为HER2抗体纯化后的SDS-PAGE结果；

[0048] 图4为CD3抗体纯化后的SDS-PAGE结果。

具体实施方式

[0049] 一种进行抗体表达和组装的重组系统，所述重组系统包括宿主细胞和重组载体。

[0050] 一种进行抗体表达和组装的重组系统，所述重组系统包括宿主细胞和重组载体。

[0051] 所述宿主细胞为CHO细胞或293F细胞。

[0052] 所述重组载体包括重链区域表达载体pRTL1-HC和轻链区域表达载体pRTL1-LC，重组载体的载体骨架为pRTL载体。

[0053] 所述重组载体的测序引物，正向测序引物序列如SEQ ID NO：15所示，反向测序引物如SEQ ID NO：16所示。

[0054] 所述重组载体可分别编码抗体的重链和轻链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0055] 所述抗体片段选自IgG、Fab、Fv或ScFv-Fc。

[0056] 所述pRTL载体骨架包含CMV enhancor/hFerL promter复合启动子和IL2信号肽，启动子和信号肽不限于一种，可选自hFerL、hEF1-HTLV、u6、H1、GAP或CaMV，信号肽可选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2、Igkappa或hGHRH。

[0057] 所述pRTL1-HC表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的，pRTL1-LC表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的。

[0058] 所述重组载体的构建方法如下：

[0059] (1)pRTL1-HC改造设计

[0060] a.将含有Fd区域的pFabZip1克隆载体GenBank：AY190524中2364bp到2666bp的序列，与pFUSE-hFc2-adapt-ScFv载体GenBank：FJ716123上的CH1、CH2、CH3恒定区序列融合得到融合片段Fd-CH1-CH2-CH3；在融合片段的Fd端上加EoRI酶切位点，CH3端上加NheI酶切位点，人工合成该部分元件序列如SEQ ID NO：13所示；

[0061] b.如SEQ ID NO：13所示的元件序列和改造载体pFUSE-hFc2-adapt-ScFv分别经EcoRI和NheI双酶切后连接，完成表达完整的具有铰链区的IgG重链质粒的构建，命名为pRTL载体；

[0062] c.以抗HER2抗体的VH序列为模板，从EcoRI处设计正向引物a如SEQ ID NO：5所示，再设计反向引物b如SEQ ID NO：6所示，扩增VH序列；正向引物c如SEQ ID NO：7所示，CH3尾加XbaI切点设计的反向引物d如SEQ ID NO：8所示，一同扩增Fd-CH1-CH2-CH3融合序列；通过重叠延伸PCR将VH和Fd-CH1-CH2-CH3进行融合得VH-Fd-CH1-CH2-CH3；

[0063] d.用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和XbaI双酶切的VH-Fd-CH1-CH2-CH3融合产物和经EcoRI和NheI双酶切的pRTL载体，其中XbaI和NheI为同尾酶，经连接后，这两个酶切位点消失，得到pRTL1-HC载体；

[0064] (2)pRTL1-LC改造设计

[0065] a.将pMThIgG1-V表达载体GenBank：AM408495中562bp到885bp的CL区域序列如SEQ ID NO：14所示，通过人工合成得到具有EcoRI、BsiWI和NheI酶切位点的CL区域片段；

[0066] b.将人工合成的CL区域序列经EcoRI和NheI双酶切后连接到经同样EcoRI和NheI双酶切的pFUSE-hFc2-adapt-ScFv骨架载体上，完成表达抗体轻链的质粒的构建，命名为pRTL’载体；

[0067] c.以抗HER2抗体的VL序列为模板，以EcoRI处设计正向引物e序列如SEQ ID NO：9所示和从CL的端序列设计带有BsiWI酶切位点的反向引物f如SEQ ID NO：10所示为引物，PCR扩增VL序列；

[0068] d.用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和BsiWI双酶切的步骤c中纯化的PCR产物和pRTL’载体，得到pRTL1-LC载体；

[0069] (3)以pRTL1-HC和pRTL1-LC重组载体在共转染宿主细胞，表达完整的IgG抗体。

[0070] 所述重链区域表达载体用EcoRI和NheI双酶切并与所需的VH连接，转化获得质粒，转染真核细胞即可表达抗体的IgG重链；所述轻链区域表达载体用EcoRI和BsiWI双酶切并与所需的VL连接，转化获得质粒，转染真核细胞表达抗体的轻链；所述重组系统在共转染宿主细胞后表达抗体。

[0071] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，所用酶如无特别说明均为NEB公司产品，人工合成的序列如无特殊说明均由北京京维智生物科技有限公司合成。

[0072] 实施例1

[0073] 一、HER2抗体序列真核表达载体的构建

[0074] 以HER2-HC质粒为模板，以引物a和引物b进行PCR扩增。其中，引物a序列如SEQ ID NO：5所示，其中GAATTC为EcoRI识别位点；引物b序列如SEQ ID NO：6所示，其中GCTAGC为NheI识别位点。在一灭菌的0.2ml PCR管中，依次加入12μl无菌水、7μl的2×Taq master mix酶(康为世纪公司)，0.2μl的引物a(终浓度2pmol)、0.2μl的引物b(终浓度2pmol)、10ng的质粒溶液(浓度为582ng/μl)，用无菌水补足至总体积20μl，将离心管至于PCR仪中。在PCR反应体系中，PCR反应的温度变化过程为：先升温至94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持20秒，降温至60℃，保持20分钟，升温至72℃，保持40秒，最后于72℃保持10分钟，结束扩增反应。经PCR扩增，得到两端分别带有EcoRI和NheI的限制性内切酶酶切的插入片段，然后用PCR纯化试剂盒(QIAGEN,Cat.No.28004)按照说明书进行PCR产物的纯化。利用DNA含量测定仪NanoDrop 2000c测定DNA的浓度。将纯化的PCR产物和pRTL1-HC载体分别进行酶切反应。PCR产物的酶切体系为：PCR产物：1μg；10×buffer4：2μl；EcoRI-HF：1μl；NheI-HF：1μl；BSA：0.2μl；补足ddH2O至20μl；pRTL1-HC载体的酶切体系为：
pRTL1-HC载体：1μg；10×buffer4：2μl；EcoRI-HF：1μl；NheI-HF：1μl；BSA：0.2μl；补足ddH2O至20μl。37℃酶切3h。1％的琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒(QIAGEN,Cat.No.28706)按照说明书进行切胶回收酶切后的产物。利用DNA含量测定仪NanoDrop 2000c测定DNA的浓度。回收DNA产物用T4 DNA连接酶连接到用EcoRI和NheI限制性内切酶酶切的pRTL1-HC载体骨架上。连接体系中插入片段DNA与载体的摩尔比最好为7:1。连接体系为：插入片段DNA：
123ng；酶切后的pRTL1-HC载体100ng；10×T4 DNA ligase buffer：2μl；T4 DNA连接酶：1μl；补足ddH2O至20μl，16℃连接3h。

[0075] 以HER2-LC质粒为模板，以引物e和引物f进行PCR扩增VL基因。其中，引物e序列如SEQ IDNO：7所示，其中GAATTC为EcoRI识别位点；引物f序列如SEQ ID NO：8所示，其中CGTACG为BsiWI识别位点。在一灭菌的0.2ml PCR管中，依次加入12μl无菌水、7μl的2×Taq master mix酶(康为世纪公司)，0.2μl的引物e(终浓度2pmol)、0.2μl的引物f(终浓度2pmol)、10ng的质粒溶液(浓度为667ng/μl)，用无菌水补足至总体积20μl，将离心管至于PCR仪中。在PCR反应体系中，PCR反应的温度变化过程为：先升温至94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持20秒，降温至60℃，保持20分钟，升温至72℃，保持40秒，最后于72℃保持10分钟，结束扩增反应。经PCR扩增，得到两端分别带有EcoRI和BsiWI的限制性内切酶酶切的插入片段，然后用PCR纯化试剂盒(QIAGEN,Cat.No.28004)按照说明书进行PCR产物的纯化。利用DNA含量测定仪NanoDrop 2000c测定DNA的浓度。将纯化的PCR产物和pRTL1-LC载体分别进行酶切反应。PCR产物的酶切体系为：PCR产物：1μg；10×buffer4：2μl；EcoRI-HF：1μl；BsiWI：1μl；BSA：0.2μl；补足ddH2O至20μl；pRTL1-HC载体的酶切体系为：pRTL1-HC载体：1μg；10×buffer4：2μl；EcoRI-HF：1μl；BsiWI：1μl；BSA：0.2μl；
补足ddH2O至20μl。37℃酶切3h。1％的琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒(QIAGEN,Cat.No.28706)按照说明书进行切胶回收酶切后的产物。利用DNA含量测定仪NanoDrop 
2000c测定DNA的浓度。回收DNA产物用T4 DNA连接酶连接到用EcoRI和BsiWI限制性内切酶酶切的pRTL1-LC载体骨架上。连接体系中插入片段DNA与载体的摩尔比最好为7:1。连接体系为：插入片段DNA：123ng；酶切后的pRTL1-LC载体100ng；10×T4 DNA ligase buffer：2μl；T4 DNA连接酶：1μl；补足ddH2O至20μl。16℃连接3h。

[0076] 二、重组质粒转化至大肠杆菌XLI-Blue后质粒扩增鉴定结果

[0077] 分别将连接产物用化学转化的方法转化至大肠杆菌XLI-Blue感受态细胞中(endA1 supE44 thi-1 hsdR17 recA1 gyrA96 relA1 lac[F′proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)])，在含有25μg/ml Zeocin抗生素的低盐LB固体培养基上培养14h。挑取几个单菌落于25μg/ml Zeocin抗生素的低盐LB液体培养基中培养过夜，同时利用测序引物进行菌落PCR鉴定，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，证明目的基因成功插入真核表达载体。

[0078] 重组质粒DNA测序结果，如图1和图2所示，重组质粒中插入片段的序列与原序列完全一致，达到100％的吻合度，可以证明本发明成功将抗HER2抗体序列插入真核表达载体，且插入方向正确。

[0079] 三、质粒共转染表达和表达后纯化

[0080] 将测序正确的阳性克隆大量摇菌，按照QIAGEN plasmid Midi Kit说明书中提质粒，用0.22μm的滤膜过滤后共转染至状态良好的CHO细胞中，30μg的pRTL1-HC与30μg的pRTL1-LC质粒通过转染试剂共转染到30ml的1×106cell/ml的CHO细胞后表达抗体，2天后更换新鲜培养基继续培养5天，将培养组分经4000rpm，22℃离心10分钟，收集培养上清。利用30kDa孔径的超滤管(Millipore)用PBS替换培养基成分以及浓缩组分，再用protein G+A agarose(G-bioscience)凝胶进行纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳，5％浓缩胶80V电压，12％分离胶120V电压)分析验证，测得抗体浓度。抗体表达量为4mg/L。

[0081] 由图3可知，抗HER2抗体成功表达，非还原条件下，二硫键未被破坏，抗体的轻重链不能打开，加入DTT可打开二硫键成线性结构，抗体重链大小55KDa，轻链大小26KDa。在图3中，1：蛋白质标志物；2：未加DTT还原剂的抗HER2抗体；3：加DTT还原剂的抗HER2抗体。

[0082] 实施例2

[0083] 一、抗CD3抗体序列真核表达载体的构建

[0084] 人工合成含有酶切位点的抗CD3抗体序列的VH以及VL基因序列，注意不要使编码氨基酸的密码子移码。VH序列如SEQ ID NO：17所示；VL序列如SEQ ID NO：18所示。

[0085] 利用EcoRI和NheI限制性内切酶酶切抗CD3的VH序列，通过T4 DNA连接酶连接到用EcoRI和NheI限制性内切酶酶切的pRTL1-HC载体骨架上。连接体系中插入片段DNA与载体的摩尔比最好为7:1。连接体系为：插入片段DNA：123ng；酶切后的pRTL1-HC载体100ng；10×T4 DNA ligase buffer：2μl；T4 DNA连接酶：1μl；补足ddH2O至20μl，16℃连接3h。

[0086] 利用EcoRI和BsiWI限制性内切酶酶切抗CD3的VL序列，通过T4 DNA连接酶连接到用EcoRI和BsiWI限制性内切酶酶切的pRTL1-LC载体骨架上。连接体系中插入片段DNA与载体的摩尔比最好为7:1。连接体系为：插入片段DNA：123ng；酶切后的pRTL1-LC载体100ng；10×T4 DNA ligase buffer：2μl；T4 DNA连接酶：1μl；补足ddH2O至20μl。16℃连接3h。

[0087] 二、重组质粒转化至大肠杆菌XLI-Blue后质粒扩增鉴定结果

[0088] 参照实施例1中步骤二。

[0089] 重组质粒DNA测序结果，如图1和图2所示，重组质粒中插入片段的序列与原序列完全一致，达到100％的吻合度，可以证明本发明成功将抗CD3抗体序列插入真核表达载体，且插入方向正确。

[0090] 三、质粒共转染表达和表达后纯化

[0091] 参照实施例1中步骤三。

[0092] 由图4可知，抗CD3抗体成功表达，非还原条件下，二硫键未被破坏，抗体的轻重链不能打开，加入DTT可打开二硫键成线性结构，抗体重链大小55KDa，轻链大小26KDa。在图4中，1：蛋白质标志物；2：未加DTT还原剂的抗CD3抗体；3：加DTT还原剂的抗CD3抗体。