本发明提供一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法，是一种利用微积分分段拟合，定量评价在微生物存在条件下氨基酸对植物生长的营养贡献的方法。本发明采用碳氮双标记技术结合微积分原理，在考虑到微生物影响的环境下研究氨基酸对植物生长的长期营养贡献，为研究有机营养提供了方法基础。本方法操作简单，培养环境易调控，采用同位素技术数据精确可靠，具有较高的精确度，可以研究多种植物的氨基酸营养贡献，为养分资源高效管理提供了理论与技术支撑。
1.一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法，通过以下步骤实现：
(1)土壤准备：采集试验点0-15cm表层土壤，过4mm筛，阴凉通风处自然风干后过2mm筛，装袋备用；
(2)植物种植：取上述制备好的土壤2000g于口径分别为17cm、12.5cm的塑料盆中，该塑料盆底部不含透水孔，在土体中均匀插入5-10根聚乙烯管，将已经发芽的玉米种子种植在塑料盆中心，待玉米长到2cm高时，挑选生长一致的玉米苗备用；
其特征在于，(3)第一次添加标记物：待挑选后的玉米苗再发芽1-2d后，选择三盆，向盆-1 13 15内每个聚乙烯管中添加含0.001-0.00001mmolL 、标记丰度为99.8％的 C，N-Glycine溶液20ml，每盆共加100-200ml，未加标记氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超纯水
(4)样品收集：在添加标记物的塑料盆中的玉米吸收4h后，尽快破坏性采样，将土壤与-1根系分离开来后，迅速用自来水冲洗根系，之后在超声波中清洗5min，用0.5molL 氯化钙冲洗三次，纯净水冲洗三次，最后放置于冻干机冷冻干燥后，称重，粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馏，最后用0.01molL-1硫酸滴定，测定植株不同部位的15N丰度值，采集植物样品的同时，将新鲜的土壤迅速收集起来，放入4℃冰箱中保存，待试验所有土壤样品收集完成后，测定土壤鲜样中水溶性氨基酸的含量；
(5)第二次添加标记物：第一次添加标记物及超纯水3d后，进行第二次添加标记物，向每个聚乙烯管中添加含0.001-0.00001mmolL-1的13C，15N-甘氨酸溶液20ml，每盆共加100-
200ml，共加三盆，未加标记氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超纯水100-200ml，添加标记物的塑料盆，待玉米苗吸收4h后，采用步骤(4)收集样品；
(6)每隔三天重复步骤(3)和(4)，共采集植物样品15-25次；
(7)确定植物吸收分子态氨基酸：以15N吸收量为横坐标，以13C吸收量为纵坐标，两者进行线性拟合，得到13Cexcess＝a15Nexcess-b，如果植物吸收的氨基酸均为分子态氨基酸，则a＝
2，根据实际试验得到a，与理论值2进行比较，就可以得到吸收的分子态氨基酸的比例；
Nrate=NTotal-NAsAfCSOILCb*T]]>
Nrate指的是土壤游离氨基酸的吸收速率，NTotal-N指的是每盆采集的植物样品的含氮量，As指的是在植物样品中由步骤(7)确定的植物吸收分子态氨基酸的氮量，Af标记物质的15N丰度，其中甘氨酸99 .8％；CSOIL指的是土壤中游离氨基酸的浓度；Cb指的是添加到土壤中的标记氨基酸浓度；T指的是植物吸收的时间；
(9)确定氨基酸在整个植物生长期营养贡献：由步骤(8)确定各采样时间点土壤中分子态氨基酸吸收速率后，以培养时间为横坐标，以吸收速率为纵坐标，采用微积分的方法确定氨基酸在整个植物生长期的营养贡献，吸收速率曲线与种植时间所形成的面积则为总的氨基酸吸收量；采用以下公式拟合分子态氨基酸的吸收总量：N吸收量(g)＝{(Nrate1+Nrate2)/2*72+(Nrate2+Nrate3)/2*72+,,,+(Nraten-1+Nraten)/2*72}*14/
指的是某次取样时分子态氨基酸的吸收速率，由步骤(8)确定，Nrate1则为第一次取样时分子态氨基酸的吸收速率；
步骤(2)所述的聚乙烯管为中空的且外壁上布满小孔的聚乙烯管。
2.根据权利要求1所述的一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法，其特征在于，步骤(4)中用球磨仪粉碎，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的15N丰度值。
一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法
技术领域
[0001] 本说明属于土壤科学领域，涉及一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法。
背景技术
[0002] 在过去几十年的植物营养研究中，无机氮营养得到了深入且广泛的研究，而有机氮营养的研究却相对缺乏。然而，无机氮尤其是化学氮肥的广泛应用，在提高了作物产量的同时，也带来了农产品品质下降、环境污染、植物抗病性差、农药残留等一系列问题。随着有机农业和有机食品的不断发展，植物有机营养越来越得到大家的重视。近年来的研究发现，植物不仅能够吸收铵态氮、硝态氮这样的无机分子，还可以吸收氨基酸、多肽、血红蛋白、核酸等简单或复杂有机物质，而无需将这些有机物质分解为无机氮后才可以被植物吸收利用。氨基酸是土壤中含量较为丰富的且生物有效性较高的有机氮，因此有机氮营养也多针对氨基酸进行研究。
[0003] 然而，氨基酸在自然环境下对植物的营养贡献仍然难以准确估计。土壤中氨基酸周转速率较快，一般几小时内就可以周转一次，且一直处于动态变化中，因此采用传统方法难以进行准确计算。同位素标记是研究有机氮营养的重要方法，然而单一标记难以区分植物吸收分子态氨基酸还是经微生物分解后的含氮的其他化合物。双标记技术是指采用13C、15N标记的氨基酸，植物吸收分子态氨基酸后，其植物体内的13C、15N呈现一定的线性相关性，根据线性关系就可以推算植物吸收的分子态氨基酸的数量。此方法为定量研究氨基酸的生物有效性提供了重要基础，但其也存在重要的缺陷：1)微生物分解标记氨基酸后，13C仍可能以其他方式进入植物体，这就混淆了分子态氨基酸的吸收；2)植物根系吸收的13C会通过呼吸作用排出体外，影响了计算的准确性；3)标记物质会被微生物快速分解，难以进行长期的试验。总而言之，双标记技术只适合短期培养试验，难以长期评估自然状态下的氨基酸生物有效性。
发明内容
[0004] 为克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法，是一种利用微积分分段拟合，定量评价在微生物存在条件下氨基酸对植物生长的营养贡献的方法。通过以下步骤实现：
[0005] (1)土壤准备：采集试验点0-15cm表层土壤，取回后过4mm筛，剔除明显的石块及根系，阴凉通风处自然风干后过2mm筛，装袋备用；
[0006] (2)植物种植：取上述制备好的土壤2000g于高、口径分别为17cm、12.5cm的塑料盆中，该塑料盆底部不含透水孔，在土体中均匀插入5-10根中空的且外壁上布满小孔的聚乙烯管，将已经发芽的玉米种子种植在塑料盆中心，待玉米长到2cm高时，挑选生长一致的玉米苗；
[0007] 塑料盆底部无透水孔，可以避免后期添加标记物流失，插入聚乙烯管可以使得土体通气性更好，根系生长均匀，且有利于添加的标记物质快速在整个土体中均匀扩散；
[0008] (3)第一次添加标记物：待挑选后的玉米苗再发芽1-2d后，选三盆，向每个聚乙烯管中添加含0.001-0.00001mmolL-1、标记丰度为99.8％的13C，15N-Glycine(甘氨酸)溶液20ml，每盆共加100-200ml，未加标记氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超纯水
100-200ml；
[0009] (4)样品收集：添加0.001-0.00001mmolL-1标记丰度为99.8％的13C，15N-Glycine溶液的塑料盆，玉米吸收4h后，尽快破坏性采样，将土壤与根系分离开来后，迅速用自来水冲洗根系，之后在超声波中清洗5min，用0.5molL-1氯化钙冲洗三次，纯净水冲洗三次，最后放置于冻干机冷冻干燥后，称重，用球磨仪粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馏，最后用0.01mol L-1硫酸滴定，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的15N丰度值，采集植物样品的同时，将新鲜的土壤迅速收集起来，放入4℃冰箱中保存，待试验所有土壤样品收集完成后，测定土壤鲜样中水溶性氨基酸的含量；
[0010] (5)第二次添加标记物：第一次添加标记物及超纯水3d后，进行第二次添加标记物，向每个聚乙烯管中添加含0.001-0.00001mmolL-1的13C，15N-Glycine溶液20ml，每盆共加100-200ml，共加三盆，未加标记氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超纯水100-
200ml，添加标记物的塑料盆，玉米吸收4h后，采用步骤4收集样品；
[0011] (6)每隔三天重复步骤(3)和(4)，共采集植物样品15-25次；
[0012] (7)确定植物吸收分子态氨基酸的方法：
[0013] 以15N吸收量为横坐标，以13C吸收量为纵坐标，两者进行线性拟合，得到13Cexcess＝a15Nexcess-b，如果植物吸收的氨基酸均为分子态氨基酸，则a＝2，根据实际试验得到a，与理论值2进行比较，就可以得到吸收的分子态氨基酸的比例。
[0014] (8)确定土壤中分子态氨基酸吸收速率的方法：
[0015]
[0016] Nrate指的是土壤游离氨基酸的吸收速率；NTotal-N指的是每盆采集的植物样品的含氮量；As指的是在植物样品中由步骤(7)确定的植物吸收分子态氨基酸的氮量；Af标记物质的15N丰度(甘氨酸99.8％)；CSOIL指的是土壤中游离氨基酸的浓度；Cb指的是添加到土壤中的标记氨基酸浓度；T指的是植物吸收的时间；
[0017] (9)确定氨基酸在整个植物生长期营养贡献的方法
[0018] 由步骤(8)确定各采样时间点土壤中分子态氨基酸吸收速率后，以培养时间为横坐标，以吸收速率为纵坐标，采用微积分的方法确定氨基酸在整个植物生长期的营养贡献，吸收速率曲线与种植时间所形成的面积则为总的氨基酸吸收量；
[0019] 采用此公式拟合分子态氨基酸的吸收总量：
[0020] N吸收量(g)＝{(Nrate 1+Nrate 2)/2*72+(Nrate 2+Nrate 3)/2*72+,,,+(Nrate n-1+Nrate n)/2*72}*14/1000000
[0021] Nrate指的是某次取样时分子态氨基酸的吸收速率，由步骤(8)确定，Nrate 1则为第一次取样时分子态氨基酸的吸收速率。
[0022] 本发明采用碳氮双标记技术结合微积分原理，在考虑到微生物影响的环境下研究氨基酸对植物生长的长期营养贡献，为研究有机营养提供了方法基础。本方法操作简单，培养环境易调控，采用同位素技术数据精确可靠，具有相当的精确度，可以研究多种植物的氨基酸营养贡献，为养分资源高效管理提供了理论与技术支撑。
附图说明
[0023] 图1是玉米15N含量与13C含量的相关关系。
[0024] 图2是植物吸收分子态氨基酸速率随时间的变化规律。
具体实施方式
[0025] 本发明结合实施例做进一步的说明。
[0026] 实施例1
[0027] (1)土壤准备：采集浙江大学紫金港西区0-15cm表层土壤，取回后过4mm筛，剔除明显的石块及根系，阴凉通风处自然风干后过2mm筛，装袋备用；
[0028] (2)植物种植：取上述制备好的土壤2000g于高、口径分别为17cm、12.5cm的塑料盆中，该塑料盆底部不含透水孔，在土体中均匀插入5根中空的且外壁上布满小孔的聚乙烯管，将已经发芽的玉米种子种植在塑料盆中心，待玉米长到2cm高时(此时玉米已经发芽4-8天)，挑选生长一致的玉米苗；
[0029] 塑料盆底部无透水孔，可以避免后期添加标记物流失，插入聚乙烯管可以使得土体通气性更好，根系生长均匀，且有利于添加的标记物质快速在整个土体中均匀扩散；
[0030] (3)第一次添加标记物：待挑选后的玉米再发芽1-2d后，选择其中3个塑料盆添加标记物，向盆内每个聚乙烯管中添加含0.0001mmolL-1的13C，15N-Glycine溶液20ml，每盆共加100ml，其它塑料盆采用相同方法添加超纯水100ml，用于以后的添加试验；
[0031] (4)样品收集：添加标记物的塑料盆中的玉米吸收4h后，尽快破坏性采样，将土壤与根系分离开来后，迅速用自来水冲洗根系，之后在超声波中清洗5min，用0.5molL-1氯化钙冲洗三次，纯净水冲洗三次，最后放置于冻干机冷冻干燥后，称重，用球磨仪粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馏，最后用0.01mol L-1硫酸滴定，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的15N丰度值，采集植物样品的同时，将新鲜的土壤迅速收集起来，放入4℃冰箱中保存，待试验所有土壤样品收集完成后，测定鲜样中水溶性氨基酸的含量；
[0032] (5)第二次添加标记物：在第一次添加标记物及超纯水3d后，进行第二次添加标记物，从步骤(3)余下的塑料盆中选择3盆，采用移液枪向每个聚乙烯管中添加含0.0001mmolL-1的13C，15N-Glycine溶液20ml，每盆共加100ml，未加标记物的其它塑料盆采用相同方法添加超纯水100ml，添加标记物的塑料盆，玉米吸收4h后，采用步骤(4)方法收集样品；
[0033] (6)每隔三天重复步骤(3)和(4)，共采集植物样品15次；
[0034] (7)确定植物吸收分子态氨基酸：
[0035] 以15N吸收量为横坐标，以13C吸收量为纵坐标，两者进行线性拟合，得到13Cexcess＝a15Nexcess-b，如果植物吸收的氨基酸均为分子态氨基酸，则a＝2，根据实际试验得到a，与理论值2进行比较，就可以得到吸收的分子态氨基酸的比例；
[0036] (8)确定土壤中分子态氨基酸吸收速率：
[0037]
[0038] Nrate指的是土壤游离氨基酸的吸收速率；NTotal-N指的是每盆采集的植物样品的含氮量；As指的是在植物样品中由步骤(7)确定的植物吸收分子态氨基酸的氮量；Af标记物质的15N丰度(甘氨酸99.8％)；CSOIL指的是土壤中游离氨基酸的浓度；Cb指的是添加到土壤中的标记氨基酸浓度；T指的是植物吸收的时间；
[0039] (9)确定氨基酸在整个植物生长期营养贡献：
[0040] 由步骤(8)确定各采样时间点土壤中分子态氨基酸吸收速率后，以培养时间为横坐标，以吸收速率为纵坐标，采用微积分的方法确定氨基酸在整个植物生长期的营养贡献，吸收速率曲线与种植时间所形成的面积则为总的氨基酸吸收量；
[0041] 采用此公式拟合分子态氨基酸的吸收总量：
[0042] N吸收量(g)＝{(Nrate 1+Nrate 2)/2*72+(Nrate 2+Nrate 3)/2*72+,,,+(Nrate n-1+Nrate n)/2*72}*14/1000000
[0043] Nrate指的是某次取样时分子态氨基酸的吸收速率，由步骤(8)确定，Nrate 1则为第一次取样时分子态氨基酸的吸收速率。
[0044] 结果参见图1，以培养18d为例，说明分子态氨基酸的计算方法，玉米15N含量与13C含量的拟合曲线为13Cexcess＝0.402715Nexcess-8.37，13C，15N-Glycine中的13C/15N＝2，而在植15
物体中其比值为0.40，且呈显著相关，因此计算分子态氨基酸的吸收量占总 N吸收量的
20％。
[0045] 参见图2，根据微积分的方法，培养时间与吸收速率所夹面积即为氨基酸总的吸收量，故采用数学拟合的方法：
[0046] N吸收量(g)＝{(Nrate 1+Nrate 2)/2*72+(Nrate 2+Nrate 3)/2*72+,,,+(Nrate 14+Nrate 15)/2*72}*14/1000000
[0047] 计算得生长42d的玉米吸收的分子态氨基酸量为0.104g，植物体内总氮含量为0.72g，分子态氨基酸的营养贡献为14.4％，表明氨基酸也可以作为植物生长的重要氮源。
