一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法

摘要

本发明公开了一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法，该方法包括切取浙贝母的芯芽作为外植体、灭菌、成苗培养、诱导培养和膨大培养等步骤。本发明首次采用浙贝母芯芽为外植体，经培养成苗后诱导产生小鳞茎，可大大缩短浙贝母诱导产生小鳞茎的周期，在整个培养过程中，没有发生细胞脱分化和再分化，从而可大大降低遗传突变几率，可保证优良品质。本发明繁殖速度快、培养周期短，具有显著的经济效益和推广应用价值。

权利要求

1.一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)切取外植体：选取无病害的浙贝母鳞茎，剥开鳞片，从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽，得到外植体；

(2)灭菌：用自来水冲洗浙贝母的芯芽15min，放入超净工作台，用体积浓度70％～75％乙醇消毒15～20s，用无菌水冲洗3～6次，再放入体积浓度为0.1～0.2％的升汞中灭菌5～

15min，用无菌水冲洗3～6次，并用无菌滤纸吸干浙贝母的芯芽表面的水份；

(3)成苗培养：将灭菌后的浙贝母的芯芽接种于成苗培养基中培养，经培养后，芯芽抽茎成苗，高5～9cm；所述的成苗培养基由MS培养基，蔗糖30g/L和琼脂6g/L组成，pH为5.5～

6.5；成苗培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为25～30天；

(4)诱导培养：将成苗接种于诱导培养基中培养，经诱导培养后，苗叶腋处逐渐出现白色膨大，统计小鳞茎诱导率；诱导培养基由MS培养基，1.5mg/L的NAA，0.5mg/L的KT，30g/L的蔗糖和6g/L琼脂组成，pH为5.5～6.5；诱导培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～

3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为20～30天；

(5)膨大培养：从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎，接种到膨大培养基上进行培养，膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L，pH为5.5～6.5，培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为30～35天，统计小鳞茎膨大率，培养得到浙贝母小鳞茎。

说明书

一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及浙贝母组织培养与繁殖的方法，是一种诱导培养浙贝母小鳞茎的新方法。

背景技术

[0002] 浙贝母(Fritillaria thunbergii)是临床常用的大宗中药材之一，被列为“浙八味”之首，历版《中国药典》均有收载，具有清热散结，化痰止咳的功能。目前，在浙贝母生产上主要有狭叶种、宽叶种、多籽种及小三子4个栽培品种。其中以狭叶种浙贝母种植面积最广，并且于2007年通过新品种认定，定名为浙贝1号；宽叶种浙贝母于2014年被认定为浙贝2号。由于浙贝母种子采收后经种植到鳞茎生长到能用于生产需要5年，有性繁殖周期长，目前生产上采用鳞茎繁殖。但浙贝母无性繁殖系数一般为2，并且由于不能通过有性生殖过程阻断病毒的继代危害，病毒在鳞茎中不断累积，导致品种退化、产量和品质降低，鳞茎变小，商品性状受到较大影响，浙贝母休眠期长、用种量大、繁殖率低成为生产上的主要问题。组织培养可以显著提高浙贝母的繁殖率，且生长周期明显缩短。目前，浙贝母离体快繁主要有2种途径：一、器官间接发生途径：浙贝母通过外植体诱导愈伤组织，继而诱导再生苗是目前研究最多的一种快繁方式，但由于该方法需要经过细胞脱分化和再分化获得组培苗，该途径存在大量的遗传变异，不利于浙贝母优良品质的遗传。二、器官直接发生途径：该途径不经过愈伤组织，浙贝母外植体直接诱导出不定芽或小鳞茎，可避免细胞分化和再分化导致的遗传变异，对保持浙贝母种质优良性状具有积极作用，但是浙贝母通过该种途径实现快繁的技术缺乏研究，存在诸多不足。

发明内容

[0003] 发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种方法简单、可减少多次继代培养的过程、繁殖速度快、培养周期短、经济效益好的高效诱导浙贝母小鳞茎的方法。

[0004] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

[0005] 一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法，其特征在于，它包括以下步骤：

[0006] (1)切取外植体：选取无病害的浙贝母鳞茎，剥开鳞片，从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽，得到外植体；

[0007] (2)灭菌：用自来水冲洗浙贝母的芯芽，放入超净工作台，用体积浓度70％～75％乙醇消毒，用无菌水冲洗3～6次，再放入体积浓度为0.1～0.2％的升汞中灭菌，用无菌水冲洗3～6次，并用无菌滤纸吸干浙贝母的芯芽表面的水份；

[0008] (3)成苗培养：将灭菌后的浙贝母的芯芽接种于成苗培养基中培养，经培养后，芯芽抽茎成苗，高5～9cm；

[0009] (4)诱导培养：将成苗接种于诱导培养基中培养，经诱导培养后，苗大部分叶腋处逐渐出现白色膨大，统计小鳞茎诱导率；

[0010] (5)膨大培养：从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎，接种到膨大培养基上进行培养，膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L，pH为5.5～6.5，培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为30～35天，统计小鳞茎膨大率，培养得到浙贝母小鳞茎。

[0011] 作为优选方案，以上所述的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法，步骤(2)灭菌过程为：用自来水冲洗浙贝母的芯芽15min，放入超净工作台，用体积浓度70％～75％乙醇消毒15～
20s，用无菌水冲洗3～6次，再放入体积浓度为0.1～0.2％的升汞中灭菌5～15min，用无菌水冲洗3～6次，并用无菌滤纸吸干浙贝母的芯芽表面的水份。

[0012] 作为优选方案，以上所述的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法，步骤(3)所述的成苗培养基由MS培养基，蔗糖30g/L和琼脂6g/L组成，pH为5.5～6.5；成苗培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为25～30天。

[0013] 作为优选方案，以上所述的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法，步骤(4)所述的诱导培养：将成苗接种于诱导培养基中培养，诱导培养基由MS培养基，1.5mg/L的NAA，0.5mg/L的KT，30g/L的蔗糖和6g/L琼脂组成，pH为5.5～6.5；诱导培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为20～30天。

[0014] 作为优选方案，以上所述的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法，步骤(5)所述的膨大培养：从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎，接种到膨大培养基上进行培养，膨大培养基由MS培养基，60g/L蔗糖和6g/L琼脂组成，pH为5.5～6.5；膨大培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为30～35天。

[0015] 本发明所述浙贝母鳞茎的打破休眠处理方法为：将鳞茎采收后用常规方法进行清洗、消毒处理后，用河沙包埋，放于2～4℃冰箱中40～50天。

[0016] 本发明通过大量实验，依据愈伤组织诱导，芽增殖率，平均增殖芽数等因素筛选成苗培养基和诱导培养基的组成，并通过大量实验，依据小鳞茎膨大率筛选膨大培养，筛选不同培养基，如A.MS+1.0mg/L 2.4-D+1.0mg/L NAA；B.MS+1.5mg/LNAA+0.5mg/L KT；C.MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，并添加不同含量的蔗糖和琼脂进行优选。实验结果表明：本发明成苗培养基(MS培养基，蔗糖30g/L和琼脂6g/L组成，pH为5.5～6.5)时浙贝母芯芽能快速发育成小苗，芯芽抽茎成高5～9cm。另外实验结果表明：本发明以诱导培养基(MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L)诱导培养时，80～90％的分叶腋处均能直接膨大形成小鳞茎，可大大缩短浙贝母诱导产生小鳞茎的周期，取得非常好的技术效果。另外实验结果表明：本发明以MS培养基，60g/L蔗糖和6g/L琼脂组成的膨大培养基进行膨大培养；小鳞茎膨大率为80～90％，取得了非常好的技术效果。

[0017] 另外本发明通过大量实验筛选了成苗培养条件、诱导培养条件和膨大培养条件，优选得到的最佳成苗培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为25～30天。最佳的诱导培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～
3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为20～30天。最佳的膨大培养条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间10～14h，培养时间为30～35天。采用本发明优选得到的成苗培养条件、诱导培养条件和膨大培养条件，可以取得高的成苗率，可实现80～90％的分叶腋处均能直接膨大形成小鳞茎，可大大缩短浙贝母诱导产生小鳞茎的周期。可实现80～
90％小鳞茎膨大率为，能取得非常好的技术效果。

[0018] 本发明提供的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法和现有技术相比，具有以下创新点：

[0019] 1.与常规鳞片组培生产小鳞茎的技术相比，本发明以浙贝母芯芽为外植体，通过大量实验研究筛选成苗培养，筛选结果表明浙贝母芯芽在培养基(MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L)中能快速发育成小苗，芯芽抽茎成高5～9cm的苗；并且本发明通过大量实验筛选诱导培养基的组成成分，将小苗接种到优选的诱导培养基(MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L)中，大部分叶腋处均能直接膨大形成小鳞茎，从而可大大缩短浙贝母诱导产生小鳞茎的周期，在整个培养过程中，没有发生细胞脱分化和再分化，从而可降低遗传突变几率，可保证浙贝母快繁育苗优良性状的遗传，培育得到的浙贝母鳞茎的品种优良。

[0020] 2.现有技术在浙贝母传统组培技术生产过程中，诱导产生的愈伤组织和不定芽还要经过至少2次继代培养才能产生小鳞茎，为单芽诱导培养产生小鳞茎，培养周期长，需要大量人力物力，成本高。而在本发明中以芯芽为外植体诱导产生小鳞茎，可大大减少多次继代培养的过程，并且每个芯芽可诱导产生多个鳞茎，再生率高，可快速生产小鳞茎，显著缩短培养周期，提高培养效率，经济效益更好。

具体实施方式

[0021] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例1：一种诱导培养浙贝母小鳞茎的方法

[0022] (1)切取外植体：选取无病害的浙贝母鳞茎，剥开鳞片，从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽；

[0023] (2)灭菌：用自来水冲洗15min后，放入超净工作台，用75％酒精消毒20s，用无菌水冲洗3次，再放入浓度为0.1％的升汞中灭菌15min，用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面的水份；

[0024] (3)成苗培养：将灭菌后的外植体接种于成苗培养基中培养，成苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH为5.5，培养条件为：温度22℃，光照强度2000Lux，光照时间10h，培养时间为30天。经培养后，芯芽抽茎成苗，高5～9cm；

[0025] (4)诱导培养：将成苗接种于诱导培养基中培养，诱导培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH为5.5，培养条件为：温度24℃，光照强度2000Lux，光照时间10h。经诱导培养后，苗90％叶腋处逐渐出现白色膨大，培养30天；

[0026] (5)膨大培养：从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎，接种到膨大培养基上进行培养，膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L，pH为5.5，培养条件为：温度25℃，置于暗处培养，培养时间为30天，小鳞茎膨大率为88％。

[0027] 实施例2：一种诱导培养浙贝母小鳞茎的新方法

[0028] (1)切取外植体：选取无病害的浙贝母鳞茎，剥开鳞片，从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽；

[0029] (2)灭菌：用自来水冲洗15min后，放入超净工作台，用70％酒精消毒20s，用无菌水冲洗5次，再放入浓度为0.15％的升汞中灭菌15min，用无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干外植体表面的水份；

[0030] (3)成苗培养：将灭菌后的外植体接种于成苗培养基中培养，成苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH为6.5，培养条件为：温度25℃，光照强度2500Lux，光照时间14h，培养时间为25天。经培养后，芯芽抽茎成苗，高5～9cm；

[0031] (4)诱导培养：将成苗接种于诱导培养基中培养，诱导培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH为6.5，培养条件为：温度26℃，光照强度2500Lux，光照时间14h。经诱导培养后，苗89％叶腋处逐渐出现白色膨大，培养30天。

[0032] (5)膨大培养：从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎，接种到膨大培养基上，膨大培养基为MS+蔗糖60/L+琼脂6/L，pH为6.5，培养条件为：温度24℃，置于暗处培养，培养时间为35天，小鳞茎膨大率为89％。

[0033] 实施例3：一种诱导培养浙贝母小鳞茎的新方法

[0034] (1)切取外植体：选取无病害的浙贝母鳞茎，剥开鳞片，从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽；

[0035] (2)灭菌：用自来水冲洗15min后，放入超净工作台，用75％酒精消毒20s，用无菌水冲洗4次，再放入浓度为0.1％的升汞中灭菌10min，用无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸干外植体表面的水份；

[0036] (3)成苗培养：将灭菌后的外植体接种于成苗培养基中培养，成苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH为6.5，培养条件为：温度24℃，光照强度3000Lux，光照时间14h，培养时间为30天。经培养后，芯芽抽茎成苗，高5～9cm；

[0037] (4)诱导培养：将成苗接种于诱导培养基中培养，诱导培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH为6.5，培养条件为：温度26℃，光照强度2500Lux，光照时间14h。经诱导培养后，苗90％叶腋处逐渐出现白色膨大，培养30天；

[0038] (5)膨大培养：从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎，接种到膨大培养基上，膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L，pH为6.5，培养条件为：温度25℃，置于暗处培养，培养时间为35天，小鳞茎膨大率为90％。

[0039] 实施例4：一种诱导培养浙贝母小鳞茎的新方法

[0040] (1)切取外植体：选取无病害的浙贝母鳞茎，剥开鳞片，从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽；

[0041] (2)灭菌：用自来水冲洗15min后，放入超净工作台，用75％酒精消毒15s，用无菌水冲洗5次，再放入浓度为0.2％的升汞中灭菌5min，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面的水份；

[0042] (3)成苗培养：将灭菌后的外植体接种于成苗培养基中培养，成苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH为5.5，培养条件为：温度22℃，光照强度3000Lux，光照时间10h，培养时间为40天。经培养后，芯芽抽茎成苗，高5～9cm；

[0043] (4)诱导培养：将成苗接种于诱导培养基中培养，诱导培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH为5.5，培养条件为：温度25℃，光照强度3000Lux，光照时间10h。经诱导培养后，苗88％叶腋处逐渐出现白色膨大，培养30天；

[0044] (5)膨大培养：从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎，接种到膨大培养基上，膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L，pH为6.5，培养条件为：温度22℃，置于暗处培养，培养时间为35天，小鳞茎膨大率为90％。

[0045] 以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。