一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，涉及如下步骤：重组表达需比较比活性的起始酶及其突变体；超声、化学裂解或冻融裂解宿主细胞，离心上清液用0.22μm滤膜过滤后的滤液为样品；用纯化后起始酶或某个突变体为免疫原，免疫哺乳动物所得抗血清为多抗；用聚乙二醇促进免疫复合物形成，测定样品和多抗反应混合物在310到410nm间某波长下光密度与630到800nm间某波长下光密度之差为检测信号，用前述免疫原为参考品建立选择性测定样品中起始酶及其突变体蛋白量的免疫比浊法；用此免疫比浊法均相测定样品中起始酶或其突变体的蛋白量，据样品中酶活性换算成比活性用于排序或计算相对值进行比较。此方法效率高且不依赖于融合标签表达酶及其突变体。
1.一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，其特征在于：
(一)拟定量比较比活性的酶及其突变体合称目标酶；其中，所述酶为起始酶，其余突变体来自该起始酶的定点突变、随机单位点突变或随机多位点突变，且目标酶在原核或真核宿主细胞中能直接可溶性活性表达，或与增溶标签后融合后在原核宿主细胞中能可溶活性表达；
(二)通过如下的步骤，均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性：
(1)制备针对目标酶的多抗：选需要定量比较比活性的起始酶或某个突变体，重组表达后纯化到70％以上纯度作为免疫原；选体重在0.2kg以上哺乳动物，哺乳动物选自兔子、豚鼠和羊，用所选免疫原对该哺乳动物进行多次免疫；首次免疫用弗氏完全佐剂，此后用弗氏不完全佐剂，相邻两次免疫的间隔长于1周但短于4周，合计免疫3次以上；免疫次数达到要求后，收集被免疫哺乳动物的血清作为抗血清，用0.22μm滤膜过滤的滤液为所需多抗；
(2)重组表达目标酶：以可溶性活性表达为前提选择重组表达所需宿主细胞和表达载体；难以在原核宿主细胞中直接可溶活性表达的真核酶蛋白，用增溶标签在原核宿主细胞内进行融合表达；所有目标酶用相同宿主细胞和表达载体进行重组表达，优化条件使表达效率满足如下要求：(a)如宿主细胞中没有与目标酶催化活性相同的可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的百分含量即丰度不低于1％；
(b)如宿主细胞中有与目标酶催化活性相同的可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的丰度不低于相同催化活性可溶性内源性酶的20倍；
(c)如宿主细胞中有与目标酶催化活性相同的部分可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的丰度不低于相同催化活性内源性酶可溶部分的
(3)制备未纯化目标酶的样品：目标酶诱导表达后收集宿主细胞用超声处理、化学裂解或冻融裂解，将裂解液离心得上清液，再用0.22μm滤膜过滤后的滤液为样品；
(4)建立免疫比浊法选择性测定样品中目标酶蛋白量：以免疫原或其它某个目标酶为参考品；在总体积为0.050到3.0ml的中性的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液中，将多抗与参考品混匀且参考品在反应体系最终浓度在1.0～30.0mg/L，并在混合后的反应体系加入分子量
2,000到1,0000道尔顿的聚乙二醇达到30g/L以上；室温反应5.0到30min后测定310到410nm间某个波长的消光值及630到800nm间某个波长下的消光值，以前者消光值减去后者消光值为响应信号即纵坐标，以反应体系所含参考品最终浓度为横坐标作图得参考品的响应曲线；用参考品终浓度的一次或二次多项式拟合响应曲线，对应最好拟合函数为响应函数；以响应信号达到拟合响应曲线所得回归估计标准差三倍对应参考品最终浓度或响应信号为检测下限，与用响应函数预测的响应信号相差不超过回归估计标准差两倍的最大响应信号或其对应参考品最终浓度为定量上限；
(5)测定样品中目标酶活性：用目标酶的底物，常规测定未纯化目标酶样品中目标酶活性；用相同的活性单位定义，换算成样品中目标酶活性浓度；
(6)测定样品中目标酶蛋白量：用样品代替参考品与前述多抗反应，以免疫比浊法选择性测定样品中目标酶蛋白量；调整加样量，使所得响应信号比检测下限高30％以上而低于定量上限对应的响应信号；用响应函数换算成样品中的目标酶蛋白浓度；
(7)计算样品中目标酶比活性：据前述所测样品中目标酶活性浓度除以免疫比浊法选择性测定所得样品中的目标酶蛋白浓度，得到样品中的目标酶比活性；
(8)比较未纯化目标酶比活性：对目标酶比活性排序比较，或以起始酶或某个突变体为比较对象，将其余目标酶比活性除以比较对象的比活性得到相对比活性，再进行比较。
2.据权利要求1所述一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，其适合高通量快速比较目标酶所构成库中各成分的比活性识别阳性突变体；其应用过程还有如下特征：(一)所选裂解宿主细胞的操作过程，对目标酶活性影响小于10％；
(二)来自原核或真菌的目标酶，在原核宿主细胞中重组表达；
(三)来自高等真核细胞的目标酶，分子量小于30,000道尔顿时直接在原核宿主细胞中表达，如分子量更大则用增溶标签在原核宿主中融合重组表达，或用昆虫细胞重组表达；
(四)制备针对目标酶的多抗时，能对免疫原产生免疫反应的动物都可用；冻存后的多抗，临用前用中性磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液复溶，离心去沉淀，再用0.22μm滤膜过滤所得滤液就得到适合使用的多抗试剂；
(五)免疫比浊测定目标酶蛋白含量时缓冲液pH在6.0到8.0之间；适用的缓冲液选自磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷-HCl、HEPES和硼酸-硼砂、甘氨酸-氢氧化钠。
一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法
技术领域
[0001] 本发明属于酶生物技术领域，涉及酶比活性的测定和定量比较，适用于筛选酶突变体库、快速确认阳性突变体、快速测定比活性进行比较研究酶序列结构和活性关系。
背景技术
[0002] 酶是重要的生物技术产品，其应用都需酶比活性尽可能高，否则应用成本很高甚至不能应用，如免疫分析标记酶比活性太低则因其灵敏度太低而不能用。为提高酶比活性需要进行酶分子工程，即通过合理设计改变酶蛋白的氨基酸序列，或者随机改变酶蛋白的氨基酸序列，在进行重组表达后测定比活性进行筛选实现定向进化。不论用哪种策略进行酶分子工程，或者研究酶的氨基酸序列和活性的关系，都需快速测定大量酶突变体的比活性进行定量比较。传统方法测定酶及其突变体比活性时需重组表达后逐个纯化再测定蛋白量和活性计算比活性，其效率低且成本高；对于难以纯化的酶及其突变体，其花费和时间更难承受。
[0003] 通过receiver-operator-curve(ROC)分析考察用特定的酶活性指标定性识别阳性突变体的曲线下面积(area-under-curve，AUC)，是衡量识别可靠性的定量指标。测定诱导表达后细胞裂解液中酶活性很容易，但目标酶蛋白诱导表达丰度变异大，用于识别比活性提高1倍阳性突变体的AUC通常不超过0.82。测定细胞裂解液中总蛋白浓度计算表观比活性，用于识别比活性提高1倍阳性突变体的AUC也很难超过0.90。理论上，选择性测定细胞裂解液中目标酶的蛋白量或针对相同参考品的相对量计算出其(相对)比活性用于比较，只要测定活性和目标酶蛋白量的精度足够高，用于识别比活性提高1倍阳性突变体的AUC有望超过0.98。
[0004] 免疫学方法能选择性测定混合物中特定蛋白含量。为低成本和高效率，需快速测定每个突变体数个单克隆的细胞裂解液中目标酶蛋白量计算比活性进行比较识别阳性突变体，这就要求精度高且效率高的均相免疫分析方法。免疫比浊法就属于均相分析方法，其用多抗作为试剂故成本低；所测信号对反应体系中目标酶的浓度接近线性响应，保障了数据换算的精度高。但免疫比浊法测定范围窄且灵敏度较低。优化诱导表达过程提高目标酶在细胞中表达丰度、调整加样量重新测定，有望用免疫比浊法测定细胞裂解液中目标酶蛋白量；用非线性响应曲线拟合计算目标酶蛋白量也能拓宽测量范围。酶蛋白多抗易于制备。所以，用免疫比浊法测定细胞裂解液中目标酶蛋白量，有望解决识别阳性突变体的问题且通用。
发明内容
[0005] 1.一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，其特征在于：
[0006] (一)拟定量比较比活性的酶及其突变体合称目标酶；其中，所述酶为起始酶，其余突变体来自该起始酶的定点突变、随机单位点突变或随机多位点突变，且目标酶在原核或真核宿主细胞中能直接可溶性活性表达，或与增溶标签后融合后在原核能可溶性活性表达；
[0007] (二)通过如下的步骤，均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性：
[0008] (1)制备针对目标酶的多抗：选需要定量比较比活性的起始酶或某个突变体，重组表达后纯化到70％以上纯度作为免疫原；选体重在0.2kg以上哺乳动物，包括但不限于兔子、豚鼠和羊，用所选免疫原对该哺乳动物进行多次免疫；首次免疫用弗氏完全佐剂，此后用弗氏不完全佐剂，相邻两次免疫的间隔长于1周天但短于4周，合计免疫3次以上；免疫次数达到要求后，收集被免疫哺乳动物的血清作为抗血清，用0.22μm滤膜过滤的滤液为所需多抗；
[0009] (2)重组表达目标酶：以可溶性活性表达为前提选择重组表达所需宿主细胞和表达载体；难以在原核直接可溶活性表达的真核酶蛋白，用增溶标签在原核宿主细胞内进行融合表达；所有目标酶用相同宿主细胞和表达载体进行重组表达，优化条件使表达效率满足如下要求：
[0010] (a)如宿主细胞中没有与目标酶催化活性相同的可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的百分含量即丰度不低于1％；
[0011] (b)如宿主细胞中有与目标酶催化活性相同的可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的丰度不低于相同催化活性可溶性内源性酶的20倍；
[0012] (c)如宿主细胞中有与目标酶催化活性相同的部分可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的丰度不低于相同催化活性内源性酶可溶部分的20倍；
[0013] (3)制备未纯化目标酶的样品：目标酶诱导表达后收集宿主细胞用超声处理、化学裂解或冻融裂解，将裂解液离心得上清液，再用0.22μm滤膜过滤后的滤液为样品；
[0014] (4)建立免疫比浊法选择性测定样品中目标酶蛋白量：以免疫原或其它某个目标酶为参考品；在总体积为0.050到3.0ml的中性的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液中，将多抗与参考品混匀且参考品在反应体系最终浓度在1.0～30.0mg/L，并在混合后的反应体系加入分子量2,000到1,0000道尔顿的聚乙二醇达到30g/L以上；室温反应5.0到30min后测定310到410nm间某个波长的消光值及630到800nm间某个波长下的消光值，以前者消光值减去后者消光值为响应信号即纵坐标，以反应体系所含参考品最终浓度为横坐标作图得参考品的响应曲线；用参考品终浓度的一次或二次多项式拟合响应曲线，对应最好拟合函数为响应函数；以响应信号达到拟合响应曲线所得回归估计标准差三倍对应参考品最终浓度或响应信号为检测下限，与用响应函数预测的响应信号相差不超过回归估计标准差两倍的最大响应信号或其对应参考品最终浓度为定量上限；
[0015] (5)测定样品中目标酶活性：用目标酶的底物，常规测定未纯化目标酶样品中目标酶活性；用相同的活性单位定义，换算成样品中目标酶活性浓度；
[0016] (6)测定样品中目标酶蛋白量：用样品代替参考品与前述多抗反应，以免疫比浊法选择性测定样品中目标酶蛋白量；调整加样量，使所得响应信号比检测下限高30％以上而低于定量上限对应的响应信号；用响应函数换算成样品中的目标酶蛋白浓度；
[0017] (7)计算样品中目标酶比活性：据前述所测样品中目标酶活性浓度除以免疫比浊法选择性测定所得样品中的目标酶蛋白浓度，得到样品中的目标酶比活性；
[0018] (8)比较未纯化目标酶比活性：对目标酶比活性排序比较，或以起始酶或某个突变体为比较对象，将其余目标酶比活性除以比较对象的比活性得到相对比活性，再进行比较。
[0019] 2、据权利要求1所述一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，其适合高通量快速比较目标酶所构成库中各成分的比活性识别阳性突变体；其应用过程还有如下特征：
[0020] (一)此方法应用不依赖于但也不排除用融合标签对目标酶进行重组表达；
[0021] (二)所选裂解宿主细胞的操作过程，对目标酶活性影响小于10％；
[0022] (三)来自原核或真菌的目标酶，首选在原核宿主细胞中重组表达；
[0023] (四)来自高等真核细胞的目标酶，分子量小于30,000道尔顿时直接在原核宿主细胞中表达，如分子量更大则用增溶标签在原核宿主中融合重组表达，或用昆虫细胞重组表达；
[0024] (五)制备针对目标酶的多抗时，能对免疫原产生免疫反应的动物含骆驼、猪都可用；冻存后的多抗，临用前用中性磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液复溶，离心去沉淀，再用0.22μm滤膜过滤所得滤液就得到适合使用的多抗试剂；
[0025] (六)免疫比浊测定目标酶蛋白含量时缓冲液pH在6.0到8.0之间；适用的缓冲液包括但不限于磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷-HCl、HEPES和硼酸-硼砂、甘氨酸-氢氧化钠。
[0026] 应用实施例
[0027] 所用材料、试剂和设备
[0028] 绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(PAAS)载体pET28A、表达等见文献[Liu H，et al.Analytical Sciences，2015；31(5)：421-427]。测定活性缓冲液为1.0M Tris-HCl pH 9.0，含底物4-硝基苯基磷酸酯2.0mM；用405nm吸收监测PAAS反应，计算启动反应8.0min到
15min之间的吸收变化初速度换算成活性；每分钟释放1.0微摩尔的对硝基酚酶活性为一个单位(U)。PAAS用Ni2+-NTA-琼脂糖纯化两遍后比活高于34kU/g，按已报道最大比活性算纯度＞80％。
[0029] 用MAPADA UV 1600PC分光光度计、Biotek ELX 800酶标仪和Eon酶标仪测定吸收。定点突变获得PAAS突变体M72D和G138S；与野生型PAAS用相同表达载体。三种目标酶诱导表达后用Ni2+-NTA-琼脂糖纯化一次，PAAS、G138S和M72D对应最大比活性分别为18、5.6和
3.2kU/g；重复诱导表达纯化三批，三种目标酶比活性变异系数小于15％。
[0030] 应用实施例1：兔抗PAAS多抗的制备
[0031] 1.在无菌条件下，取0.40mg纯化PAAS加弗氏完全免疫佐剂，用20mM pH7.4的磷酸钠缓冲液稀释到0.80ml；用5.0ml容量的塑料注射器将上述混合物反复多次混匀进行乳化，直到注射器中的混合物象白色的泡沫状混合物而在竖直状态下粘壁而不流动；在无菌条件下，将注射器内乳化后的免疫原，在新西兰大白兔背部的皮下多点注射，尽量全部注射；免疫原在乳化完全后，在30分钟内注射；首次注射免疫原的时间称为免疫过程的第一天；
[0032] 2.到第15天，在无菌条件下，取0.20mg纯化PAAS加弗氏不完全免疫佐剂，参照前述操作用磷酸钠缓冲液稀释后在注射器内乳化；皮下多点注射免疫原；此为第二次免疫；
[0033] 3.到第25天，参照第二次免疫，取0.20mg纯化PAAS加弗氏不完全免疫佐剂，乳化后皮下多点注射；此过程共重复进行三次，即累计免疫5次；
[0034] 4.到第45天，用0.35％戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉大白兔；颈动脉插管取不抗凝的全血于无菌烧瓶；将全血在37℃放置2小时，4℃放置过夜；无菌离心管4000rpm离心5min收集上清，再度无菌离心管10000rpm离心15min收集上清为抗血清(避免收集表层漂浮状成分)；50℃处理30min，0.22μm滤膜过滤，分装成0.10ml，冻干；-20℃～-80℃下保存。
[0035] 应用实施例2：PAAS及其突变体的诱导表达及未纯化目标酶样品制备[0036] 1.取转化了PAAS及其突变体三种的表达载体，分别转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，涂布在含卡那霉素的平板上挑选单克隆；在48孔板上每孔加入含卡那霉素的TB培养基0.50ml，将每个目标酶的每个单克隆尽可能全部转移到对应的微孔中；37℃用180rpm培养放大12小时；加IPTG到1.0mM，在16℃用110rpm诱导表达20小时；
[0037] 2.用1.50ml Ependorf离心管，加入微孔板上对应的菌液0.40ml；8000rpm离心10分钟收集细胞；用20mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲液洗涤细胞一次并用此缓冲液重悬到0.50ml；用SONICS Uibra Cell(Sonics&Materials，INC.，53Church Hill Rd.，Newtown，CT，USA)超声处理3.0min(30％幅度，超声4s暂停5s；循环进行)，10000rpm离心15分钟，取
0.40ml上清用0.22μm滤膜过滤得到未纯化目标酶样品。
[0038] 应用实施例3：高通量测定目标酶活性、样品中总蛋白浓度、样品中目标酶蛋白浓度
[0039] 1.测定未纯化目标酶活性：未纯化目标酶样品用20mM Tris-HCl pH 8.0稀释5倍；取溶解在测定活性所用1.0M Tris-HCl pH 9.0缓冲液中的底物溶液0.18ml到96孔板的微孔中，加入稀释后的未纯化目标酶样品20μl，在其林贝尔QB9001振荡器上快速震荡混匀3.0分钟，转移到酶标仪，动力学模式连续监测405nm吸收；分析8.0～15.0分钟的数据得到初速度，按照11.5(mM·cm)-1的消光系数换算成样品中目标酶活性浓度(附图1到附图3)；
[0040] 2.Bradford法测总蛋白浓度：按文献配制试剂(Bradford MM.1976.Analytical Biochemistry 72：248-254)；取1.0mL Bradford试剂加20μl样品，混匀后室温反应10分钟，用分光光度计测定595nm吸收；以牛血清清蛋白为参考品制作响应曲线；据响应曲线换算成样品中的总蛋白浓度；所得未纯化目标酶样品中总蛋白浓度的分布见附图4到附图6；
[0041] 3.免疫比浊法(ITA)测定未纯化目标酶样品中的目标酶蛋白量：用20mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液溶解聚乙二醇6000到40g/L，用0.22μm滤膜过滤作为反应缓冲液；以此反应缓冲液溶解冻干的抗血清并用此缓冲液稀释到蛋白浓度为3.3g/L，再用0.22μm滤膜过滤得到多抗试剂；每孔加入20μl样品或参考品到96孔板的微孔中，再加入多抗试剂180μl；在其林贝尔QB9001振荡器上室温快速震荡混匀10.0分钟，在Biotek EON酶标仪上测定340nm和700nm消光值，以340nm消光值减去700nm消光值为检测信号；以纯化后比活性为32单位每毫克的PAAS为参考品制作免疫比浊法测定目标酶的响应曲线，用二次多项式拟合(见附图7)；
据响应曲线计算样品中的目标酶蛋白浓度(附图8到附图10)；
[0042] 4.三种未纯化目标酶的样品，ITA测定酶蛋白浓度占总蛋白浓度比值即丰度约10％；
[0043] 5.对M72D和G138S未纯化样品，以总蛋白浓度计算表观比活性、以ITA的酶蛋白浓度计算比活性；PAAS和G138S、G138S和M72D分别成对比较活性浓度分布见附图11和12；PAAS和G138S、G138S和M72D分别成对比较表观比活性分布见附图13和14；PAAS和G138S、G138S和M72D分别成对比较用ITA测定比活性分布见附图15和16；
[0044] 6.纯化后G138S比活性仅约M72D的1.7倍；对未纯化样品中酶活性浓度、表观比活性、ITA测定比活性三种指标，用ROC分析识别G138S和M72D之间的高比活性者见附图17；用活性浓度识别高比活性者的曲线下面积AUC不超过0.80，以总蛋白计算的表观比活性比较则AUC不超过0.87，而以ITA测定的目标酶蛋白量计算的比活性进行比较则AUC超过0.99；可见基于ITA测定比活性能用于可靠比较未纯化目标酶的比活性，识别比活性提高1倍的阳性突变体；纯化后PAAS比活性约为G138S的3倍，用任一指标分析的AUC都大于0.99。
[0045] 附图的说明
[0046] 附图1.M72D未纯化样品中的酶活性浓度分布(n＝72)
[0047] 附图2.G138S未纯化样品中的酶活性浓度分布(n＝72)
[0048] 附图3.PPAS未纯化样品中的酶活性浓度分布(n＝72)
[0049] 附图4.M72D未纯化样品中的总蛋白浓度分布(n＝72)
[0050] 附图5.G138S未纯化样品中的总蛋白浓度分布(n＝72)
[0051] 附图6.PPAS未纯化样品中的总蛋白浓度分布(n＝72)
[0052] 附图7.以纯化PAAS为参考品免疫比浊法测定目标酶蛋白量的响应曲线及响应函数
[0053] 附图8.用ITA测定G138S未纯化样品中的酶蛋白浓度分布(n＝72)
[0054] 附图9.用ITA测定M72D未纯化样品中的酶蛋白浓度分布(n＝72)
[0055] 附图10.用ITA测定PPAS未纯化样品中的酶蛋白浓度分布(n＝72)
[0056] 附图11.G138S和M72D成对比较未纯化样品中的酶活性浓度分布(n＝72)[0057] 附图12.PAAS和G138S成对比较未纯化样品中的酶活性浓度分布(n＝72)[0058] 附图13.G138S和M72D成对比较未纯化样品中的表观比活性分布(n＝72)[0059] 附图14.PAAS和G138S成对比较未纯化样品中的表观比活性分布(n＝72)[0060] 附图15.G138S和M72D成对比较未纯化样品中用ITA测定比活性分布(n＝72)[0061] 附图16.PAAS和G138S成对比较未纯化样品中用ITA测定比活性分布(n＝72)[0062] 附图17.用三种指标识别G138S和M72D中高比活性者的ROC曲线分析(n＝72)。
