抗CD83抗体及其用途

摘要

本公开涉及与CD83结合的蛋白质及其在例如治疗、预防、诊断或预后方面的用途。

权利要求

1.一种分离的或重组的CD83结合蛋白，其包含特异性结合CD83的抗原结合结构域，其中所述结合蛋白包含（a）重链可变区（VH），所述重链可变区为如SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列；和（b）轻链可变区（VL），所述轻链可变区为如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的CD83结合蛋白，其中所述VL和VH处于单个多肽链中。

3.如权利要求2所述的CD83结合蛋白，其为：(i) 单链Fv片段（scFv）；或

(ii) 二聚体scFv（di-scFv）；或(iii) 连接至Fc或重链恒定结构域CH2和/或CH3的(i)或(ii)。

4.如权利要求1所述的CD83结合蛋白，其中所述VL和VH处于分离的多肽链中。

5.如权利要求4所述的CD83结合蛋白，其为：(i) 二抗体；或

(ii) 三抗体；或

(iii) 四抗体；或

(iv) Fab；或

(v) F(ab')2；或

(vi) Fv；或

(vii) 连接至Fc或者CH2和/或CH3的(i)至(vi)中的一种。

6.如权利要求5所述的CD83结合蛋白，其为抗体。

7.如权利要求6所述的CD83结合蛋白，其中所述抗体包含：如SEQ ID NO: 29所示的重链序列和如SEQ ID NO: 32所示的轻链序列。

8.如权利要求1所述的CD83结合蛋白，其为嵌合蛋白、去免疫化蛋白、人源化蛋白、同人源化蛋白质、人蛋白、灵长类化蛋白或复合蛋白。

9.如权利要求1所述的CD83结合蛋白，其缀合至化合物。

10.一种分离的或重组的核酸，其编码权利要求1至9中任一项所述的CD83结合蛋白。

11.如权利要求10所述的核酸，其包含如SEQ ID NO: 35、38、41或44中任一项所示的核苷酸序列。

12.一种表达构建体，其包含可操作连接至启动子的权利要求10所述的核酸。

13.表达权利要求1至9中任一项所述的CD83结合蛋白的分离的细胞，或者经基因修饰以表达权利要求1至9中任一项所述的CD83结合蛋白的重组细胞。

14.如权利要求13所述的细胞，其包含权利要求10所述的核酸，或者权利要求12所述的表达构建体。

15.一种组合物，其包含权利要求1至9中任一项所述的CD83结合蛋白以及药学上可接受的载体。

16.根据权利要求1至9中任一项所述的CD83结合蛋白在制备用于治疗或预防受试者中由涉及T细胞和/或树突状细胞的细胞免疫应答的机能障碍或不期望的功能引起的疾病或病症的药物中的用途。

17.根据权利要求1至9中任一项所述的CD83结合蛋白在制备用于下调同种异体移植物的免疫活性的药物中的用途。

18.根据权利要求1至9中任一项所述的CD83结合蛋白在制备用于治疗或预防过敏、哮喘、组织或器官移植排斥、重症肌无力、多发性硬化症、脉管炎、慢性炎性肠病、白赫铁列夫症、系统性红斑狼疮、银屑病、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病和AIDS的药物中的用途。

19.根据权利要求18所述的用途，其中组织或器官移植排斥由移植物抗宿主疾病引起。

20.根据权利要求18所述的用途，其中所述慢性炎性肠病是克罗恩病或溃疡性结肠炎。

说明书

抗CD83抗体及其用途

技术领域

[0001] 本公开涉及与CD83结合的蛋白质及其在例如治疗、预防、诊断或预后方面的用途。

背景技术

[0002] CD83

[0003] CD83是45kDa的I型膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。CD83是主要在成孰树突状细胞(DC)上表达的细胞表面标志物。CD83很少表达于未成熟的血液DC(BDC)和单核细胞衍生的DC(MoDC)上。由于其偏好表达于成孰DC上，所以CD83是引人注意的免疫治疗靶标。

[0004] 树突状细胞以及对先天性免疫应答和适应性免疫应答的控制

[0005] DC连接先天性免疫系统和同源(cognate)(适应性)免疫系统。先天性免疫是应答外来物质而进行非特异性免疫活化的主要促进剂。未成熟的DC在抗原内化的情况下进行特化，并遍布于外周组织中，从而允许连续的抗原性监控。DC因其驱动主要的T细胞应答的能力而被专业地称为抗原呈递细胞(APC)，其仅需要最少的抗原量即可起始免疫活化。

[0006] 未成熟的DC受来自感染性和外源材料的多种信号的协调，这些信号触发DC的分化和成熟(也称为活化)。虽然成熟的DC能够捕获抗原，但是该活化过程降低了这些细胞内化抗原的能力，反而上调细胞因子释放、活化标志物表达并处理抗原用于主要组织相容性复合物(MHC)展示。负载有经处理的抗原的成孰的DC可高效地招募T细胞、B细胞、粒细胞、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞和其他先天性免疫系统的细胞，从而放大对抗原的应答。

[0007] 一旦DC分化和活化就表达的分子协助连接先天性免疫和适应性免疫。成熟的DC上调趋化因子受体和粘附分子例如CD54的表达，促使 DC迁移至淋巴结，以提高与淋巴细胞的相互作用。共刺激分子例如CD80 和CD86的表达提供了T细胞活化和抗原特异性免疫应答起始所必需的共刺激信号。CD40的连接增强了共刺激分子的表达，并诱导IL-12释放，从而促进T细胞活化，然后已分化的T细胞协调适应性免疫应答的复杂相互作用。

[0008] 因为DC发挥对免疫应答的控制，所以活化的DC可视为在包括恶性疾病和自体免疫疾病在内的一些免疫疾病中进行干预的靶标。

[0009] 对本领域技术人员而言，靶向DC的化合物可调节免疫应答从现有技术显而易见。因此，结合DC的化合物例如因其治疗性、预防性、诊断性和预后性用途而令人期待。

[0010] 发明概述

[0011] 本公开基于发明人产生的特异性结合CD83的人抗体(3C12 mAb)。 3C12 mAb衍生自人scFv序列的噬菌体展示文库；所得的scFv噬菌体克隆重构为IgG1 mAb。

[0012] 3C12 mAb表现出在竞争性结合测定方面胜过其多克隆等同物 RA83，并且延迟移植有人PBMC异体移植物的SCID小鼠内的移植物抗宿主疾病(GVHD)的发作。

[0013] 为了提高3C12 mAb的疗效，发明人进行了轻链的亲和力成熟以提高3C12 mAb对CD83的亲和力。得到了相对于野生型scFv具有不同轻链可变区(VL)序列和增强的结合性质的四种新的3C12 scFv变体 (3C12.B、3C12.C、3C12.D和3C12.E)。这些亲和力成熟抗体包含VL的框架(FR)和互补决定区(CDR)中的替换。这些替换的效果是不可预测的。

[0014] 发明人还产生了能够诱导增强的效应子功能水平的3C12 mAb形式，其中去岩藻糖基化的3C12.C mAb具有比得上多克隆抗体RA83的效价。

[0015] 本公开广泛地涉及包含特异性结合CD83的抗原结合结构域的CD83 结合蛋白。

[0016] 在一个例子中，本公开提供了这样的CD83结合蛋白，其包含特异性结合CD83的抗原结合结构域，其中所述结合蛋白包含重链可变区 (VH)，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少 90％相同的序列。在一个例子中，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的框架区至少90％相同的序列。

[0017] 此外或作为另一选择，本公开提供了这样的CD83结合蛋白，其包含特异性结合CD83的抗原结合结构域，其中所述结合蛋白包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的三个互补决定区(CDR)。

[0018] 在一个例子中，VH CDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸31至35，VH CDR2包含SEQ ID NO:1的氨基酸50至59并且VH CDR3包含SEQ ID NO:1的氨基酸99至106。

[0019] 在一个例子中，VH CDR1包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列， VH CDR2包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列并且VH CDR3包含 SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。

[0020] 此外或作为另一选择，本公开提供了包含特异性结合CD83的抗原结合结构域的CD83结合蛋白，其中所述结合蛋白包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含：

[0021] (i)与SEQ ID NO:5、6、7、8或9中所示的氨基酸序列中的任一序列至少90％相同的序列；或

[0022] (ii)SEQ ID NO:5、6、7、8或9中所示氨基酸序列中的任一序列的三个互补决定区(CDR)；或

[0023] (iii)SEQ ID NO:10中所示的共有序列；或

[0024] (iv)三个CDR，其中CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:26、27或28中所示的共有序列。

[0025] 在一个例子中，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:5、6、7、 8或9所示氨基酸序列中的任一氨基酸序列的框架区至少90％相同的序列。

[0026] 在一个例子中，VL CDR1包含SEQ ID NO:5、6、7、8或9的氨基酸24至34，VL CDR2包含SEQ ID NO:5、6、7、8或9的氨基酸50至 56并且VL CDR3包含SEQ ID NO:5、6、7、8或9的氨基酸89至97。

[0027] 在一个例子中，VL CDR1包含SEQ ID NO:11、14、17、20或23中所示的氨基酸序列，VL CDR2包含SEQ ID NO:12、15、18、21或24中所示的氨基酸序列并且VL CDR3包含SEQ ID NO:13、16、19、22或25 中所示的氨基酸序列。

[0028] 在一个例子中，VL CDR1的氨基酸序列包含的第2位的丙氨酸(A) 或苏氨酸(T)，和/或第7位的赖氨酸(K)或丝氨酸(S)或精氨酸(R)，和/或第8位的天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)，和/或第9位的酪氨酸(Y) 或组氨酸(H)或色氨酸(W)，和/或第10位的苯丙氨酸(F)或亮氨酸 (L)。

[0029] 在一个例子中，VL CDR2的氨基酸序列包含第2位的苏氨酸(T)或丙氨酸(A)，和/或第4位的天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

[0030] 在一个例子中，VL CDR3的氨基酸序列包含第2位的谷氨酰胺(Q) 或赖氨酸(K)，和/或第3位的亮氨酸(L)或缬氨酸(V)或半胱氨酸 (C)，和/或第4位的甘氨酸(G)或天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)或丝氨酸(S)，和/或第5位的丙氨酸(A)或丝氨酸(S)或精氨酸(R)，和/或第6位的酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)或丙氨酸(A)，和/或第8 位的酪氨酸(Y)或亮氨酸(L)。

[0031] 在一个例子中，所述VH和所述VL是单个多肽链。例如，所述CD83 结合蛋白是：

[0032] (i)单链Fv片段(scFv)；或

[0033] (ii)二聚体scFv(di-scFv)；或

[0034] (iii)连接至Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3的(i)或(ii)；或

[0035] (iv)连接至与免疫效应细胞结合的蛋白质的(i)或(ii)。

[0036] 在另一例子中，所述VL和VH处于分离的多肽链中。例如，所述CD83 结合蛋白是：

[0037] (i)二抗体；或

[0038] (ii)三抗体；或

[0039] (iii)四抗体；或

[0040] (iv)Fab；或

[0041] (v)F(ab')2；或

[0042] (vi)Fv；或

[0043] (vii)连接至Fc或者CH2和/或CR3的(i)至(vi)中的一种；或

[0044] (viii)连接至与免疫效应细胞结合的蛋白质的(i)至(vi)中的一种。

[0045] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白包含竞争性抑制抗体结合 CD83的抗原结合结构域，所述抗体包含如SEQ ID NO:29所示的重链序列以及如SEQ ID NO:30所述的轻链序列。

[0046] 本公开的示例性的CD83结合蛋白质包含本公开的VH以及嵌合、去免疫化、人源化、人、同人源化(synhumanized)或灵长类轻链或VL。

[0047] 在本公开的一个示例性的形式中，所述CD83结合蛋白是抗体。所述抗体可包含：

[0048] (i)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:5所示的VL序列；或

[0049] (ii)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:6所示的VL序列；或

[0050] (iii)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:7所示的VL序列；或

[0051] (iv)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:8所示的VL序列；或

[0052] (v)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:9所示的VL序列；或

[0053] (vi)如SEQ ID NO:29所示的重链序列和如SEQ ID NO:30所示的轻链序列；或[0054] (vii)如SEQ ID NO:29所示的重链序列和如SEQ ID NO:31所示的轻链序列；或[0055] (viii)如SEQ ID NO:29所示的重链序列和如SEQ ID NO:32所示的轻链序列；或[0056] (ix)如SEQ ID NO:29所示的重链序列和如SEQ ID NO:33所示的轻链序列；或[0057] (x)如SEQ ID NO:29所示的重链序列和如SEQ ID NO:34所示的轻链序列。

[0058] 在一个例子中，所述抗体耗尽其所结合的细胞，例如，免疫细胞，如抗原呈递细胞(APC)(例如，树突状细胞(DC))和/或淋巴细胞(例如，T细胞)。

[0059] 对本领域技术人员而言，从本公开显而易见，示例性的CD83结合蛋白能够在不缀合至有毒化合物的情况下耗尽它们所结合的细胞。

[0060] 在一个例子中，所述CD83结合蛋白能够诱导效应子功能，例如，导致杀伤抗体所结合的细胞的效应子功能。示例性的效应子功能包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。

[0061] 在一个例子中，所述CD83结合蛋白能够诱导ADCC。

[0062] 在一个例子中，所述CD83结合蛋白包含能够诱导效应子功能的抗体Fc区。例如，所述效应子功能是Fc介导的效应子功能。在一个例子中，所述Fc区是IgG1 Fc区或IgG3 Fc区或杂合的IgG1/IgG2Fc区。

[0063] 在一个例子中，所述CD83结合蛋白能够诱导与野生型人IgG1和/ 或人IgG3 Fc区相似(例如，没有显著差异或在约10％以内)或相同的效应子功能水平。

[0064] 在一个例子中，所述CD83结合蛋白能够诱导增强的效应子功能水平。

[0065] 在一个例子中，由所述CD83结合蛋白诱导的效应子功能水平相对于包含野生型IgG1 Fc区的CD83结合蛋白的效应子功能水平增强。

[0066] 在一个例子中，所述CD83结合蛋白是去岩藻糖基化的，并且包含去岩藻糖基化的Fc区。

[0067] 在另一例子中，所述CD83结合蛋白具有比由未经改变以降低蛋白的岩藻糖基化水平的人或CHO细胞所产生的抗体更低的岩藻糖基化水平。根据该例子，更低的岩藻糖基化水平将被理解成意为，在包含所述 CD83结合蛋白的组合物中，岩藻糖基化的CD83结合蛋白(例如，糖基基团附接至包含岩藻糖的抗体Asn297处)百分率比由未经改变以降低蛋白的岩藻糖基化水平的人或CHO细胞所产生更低。

[0068] 例如，所述CD83结合蛋白是这样的去岩藻糖基化的抗体，其包含含有如SEQ ID NO:1所示的(或由SEQ ID NO:35中示出的核苷酸序列所编码的)氨基酸序列的VH，以及含有如SEQ ID NO:5、6、7、8或9 中任一项所示的(或由如SEQ ID NO:36、37、38、39或40中任一项所示的核苷酸序列编码的)氨基酸序列的VL。

[0069] 在一个例子中，所述CD83结合蛋白包含含有如SEQ ID NO:1所示的(或如SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列所编码的)氨基酸序列的VH，以及含有如SEQ ID NO:5、6、7、8或9中任一项所示的(或由如SEQ ID NO:36、37、38、39或40中任一项所示的核苷酸序列编码的)氨基酸序列的VL，并且由不表达可检测水平(或表达降低水平)的α-l,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)或经N-糖基化过程抑制剂例如几夫碱(kifunensine) 处理的哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)表达。

[0070] 在一个例子中，所述CD83结合蛋白包含含有一个或多个增强由该抗体诱导的效应子功能的氨基酸序列替换的Fc区。例如，与不包含所述替换的Fc区相比，所述一个或多个氨基酸序列替换提高所述Fc区对Fcγ受体(FcγR)的亲和力。例如，与不包含所述替换的Fc区相比，所述一个或多个氨基酸替换提高所述Fc区对选自由FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc 和FcγRIIIa组成的组的FcγR的亲和力。

[0071] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白是裸抗体或其抗原结合片段。

[0072] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白是全长抗体。

[0073] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白以5×10-7M或更低的平衡解离常数(KD)与CD83结合，例如4.5×10-7M或更低，例如4×10-7M 或更低，例如3.5×10-7M或更低，例如3×10-7M或更低，例如2.5×10-7 M或更低，例如2×10-7M或更低，例如1.5×10-7M或更低，例如1-7 -8 -8 -8
×10  M或更低，例如9.5×10 M或更低，例如9×10 M或更低，例如8.5× 10 M或更低，例如8×10-8M或更低，例如7.5×10-8M或更低，例如 7×10-8M或更低，例如6.5×10-8M或更低，例如6×10-8M或更低，例如5.5×10-8M或更低，例如5×10-8M或更低，例如4.5×10-8M或更低，例如4×10-8M或更低，例如3.5×10-8M或更低，例如3×10-8M 或更低，例如2.5×10-8M或更低，例如2×10-8M或更低，例如1.5×10-8 M或更低，例如1×10-8M或更低，例如9.5×10-9M或更低，例如9×10-9 M或更低，例如8.5×10-9M或更低，例如8×10-9M或更低，例如7.5×10-9M或更低，例如7×10-9M或更低，例如6.5×10-9M或更低，例如 6×10-9M或更低，例如5.5×10-
9M或更低，例如5×10-9M。

[0074] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白以约6×10-9M或更低例如 6.1×10-9M的KD与CD83结合。在一个例子中，所述KD介于约5.5×10-9 M至约6.5×10-9M之间，例如，为约6×-910 M。

[0075] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白以5×106M-1s-1或更低的结合速率(Kon)与CD83结合，例如4.5×106M-1s-1或更低，例如4×106 M-1s-1或更低，例如3.5×106M-1s-1或更低，例如3×106M-1s-1或更低，例如2.5×106M-1s-1或更低，例如2×106M-1s-1或更低，例如1.56 -1 -1 6 -1 -1 5 -1 -1 5 -1 -1
×10 M s 或更低，例如1×10M s 或更低，例如9.5×10M s 或更低，例如9×10M s
或更低，例如8.5×105M-1s-1或更低，例如8×105M-1s-1或更低，例如7.5×105M-1s-1或更低，例如7×105M-1s-1或更低，例如 6.5×105M-1s-1或更低，例如6×105M-1s-1或更低，例如5.5×
105M-1s-1或更低，例如5×105M-1s-1或更低，例如4.5×105M-1s-1或更低，例如4 ×105M-1s-1或
5 -1 -1 5 -1 -1 5 -1 -1
更低，例如3.5×10M s 或更低，例如3×10M s 或更低，例如2.5×10M s 或更低，例如
2×105M-1s-1或更低，例如1.5×105 M-1s-1或更低，例如1×105M-1s-1。

[0076] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白以约1.5×106M-1s-1或更低的Kon与CD83结合。在一个例子中，KD介于约1.2×106M-1s-1至1.6×106 M-1s-1之间，例如约1.3×106M-1s-1。

[0077] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白以1.5×10-1s-1或更低的解离速率(Koff)从CD83解离，例如1×10-1s-1或更低，例如9.5×10-2s-1或更低，例如9×10-2s-1或更低，例如8.5×10-2s-1或更低，例如8×10-2 s-1或更低，例如7.5×10-2s-1或更低，例如7×10-2s-1或更低，例如6.5× 10-2s-1或更低，例如6×10-2s-1或更低，例如5.5×10-2s-1或更低，例如 5×10-2s-1或更低，例如4.5×10-2s-1或更低，例如4×10-2s-1或更低，例如3.5×10-2s-1或更低，例如3×10-2s-1或更低，例如2.5×10-2s-1或更低，例如2×10-2s-1或更低，例如1.5×10-2s-1或更低，例如1×10-2s-1或更低，例如9.5×10-3s-1或更低，例如9×10-3s-1或更低，例如8.5×10-3 s-1或更低，例如8×10-3s-1或更低，例如7.5×10-3s-1或更低，例如7×10-3 s-1。

[0078] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白以约8×10-3s-1或更低的 Koff从CD83解离。在一个例子中，所述KD介于约7×10-3s-1至约9×10-3 s-1之间，例如，为约8×10-3s-1。

[0079] 本公开还包括本公开的抗体的片段、变体和衍生物。

[0080] 在一个例子中，本公开提供了这样的药物组合物，其包含根据本公开的CD83结合蛋白以及合适的载体，例如药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。

[0081] 本公开还提供了编码本公开的CD83结合蛋白的分离的或重组的核酸。

[0082] 在编码本公开的CD83结合蛋白的上下文中描述了示例性的核酸序列，并且将这些序列将加上必要的修改应用于本公开当前的例子。

[0083] 在一个例子中，本公开的核酸包含如SEQ ID NO:35至46中任一项所示的核苷酸序列。

[0084] 本公开还提供了能够在中度至高度严格的杂交条件下与本公开的核酸杂交的核酸。

[0085] 本公开还包括本公开的分离的核酸的片段、同源物和衍生物。

[0086] 本公开还提供了包含本公开的分离的或重组的核酸以及一个或多个附加核苷酸序列例如可操作连接至该核酸的启动子的基因构建体。

[0087] 在一个例子中，所述基因构建体是包含表达载体和本公开的分离的或重组的核酸的表达构建体，其中所述分离的或重组的核酸可操作连接至所述表达载体中的一个或多个调控核酸。

[0088] 在一个例子中，本公开的基因构建体包含可操作连接至启动子的编码多肽(例如，包含VH)的核酸以及可操作连接至启动子的编码另一多肽(例如，包含VL)的核酸。

[0089] 在另一个例子中，所述基因构建体是双顺反子基因构建体，例如，包含以5'至3'顺序可操作连接的下列组件：

[0090] (i)启动子；

[0091] (ii)编码第一多肽的核酸；

[0092] (iii)内部核糖体进入位点；以及

[0093] (iv)编码第二多肽的核酸。

[0094] 例如，所述第一多肽包含VH并且所述第二多肽包含VL，或者所述第一多肽包含VL并且所述第二多肽包含VH。

[0095] 本公开还预期了分离的基因构建体，其中一个编码第一多肽(例如，包含VH)并且其中另一个编码第二多肽(例如，包含VL)。例如，本公开还提供了包含以下的组合物：

[0096] (i)包含可操作连接至启动子的编码多肽(例如，包含VH)的核酸的第一基因构建体；以及

[0097] (ii)包含可操作连接至启动子的编码多肽(例如，包含VL)的核酸的第二基因构建体。

[0098] 本公开还提供了包含根据本公开的基因构建体的细胞。

[0099] 在一个例子中，本公开提供表达本公开的CD83结合蛋白的分离的细胞，或者经基因修饰以表达本发明的CD83结合蛋白的重组细胞。

[0100] 在一个例子中，所述细胞包含本公开的基因构建体，或者：

[0101] (i)包含可操作连接至启动子的编码多肽(例如，包含VH)的核酸的第一基因构建体；以及

[0102] (ii)包含可操作连接至启动子的编码多肽(例如，包含VL)的核酸的第二基因构建体，

[0103] 其中所述第一多肽和第二多肽形成本公开的抗体或抗原结合片段。

[0104] 可将所述基因构建体整合至细胞中或保持为附加体。

[0105] 本公开的细胞的例子包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

[0106] 本公开还提供了用于产生本公开的CD83结合蛋白的方法，所述方法包括将本公开的基因构建体维持在足以产生CD83结合蛋白的条件下。

[0107] 在一个例子中，用于产生本公开的CD83结合蛋白的方法包括，在足以产生并任选分泌所述CD83结合蛋白的条件下培养本公开的细胞。

[0108] 在一个例子中，用于产生本公开的CD83结合蛋白的方法还包括分离所述CD83结合蛋白。

[0109] 本公开还提供了产生重组的CD83结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

[0110] (i)培养包含根据本公开的表达载体的细胞，以使在所述宿主细胞中表达所述重组的免疫球蛋白或抗体；以及

[0111] (ii)分离所述重组的CD83结合蛋白。

[0112] 在一个例子中，用于产生本公开的CD83结合蛋白的方法还包括用药学可接受载体来配制所述CD83结合蛋白。

[0113] 本公开还提供了治疗性或预防性地治疗受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括将本公开的CD83结合蛋白施用至所述受试者从而治疗或预防所述疾病或病症的步骤。

[0114] 在一个例子中，所述受试者是哺乳动物。

[0115] 在一个例子中，所述哺乳动物是人。

[0116] 在一个例子中，所述哺乳动物需要治疗或预防。

[0117] 在一个例子中，有需要的哺乳动物罹患疾病或病症。

[0118] 在一个例子中，有需要的哺乳动物处于发展疾病或病症或者复发疾病或病症的风险中。

[0119] 本公开还提供了本公开的CD83结合蛋白或本公开的组合物在医学中的用途。

[0120] 此外或作为另一选择，本公开提供了本公开的CD83结合蛋白在制造用于治疗受试者中的疾病或病症的药物的用途。

[0121] 本公开还提供了本公开的CD83结合蛋白用于治疗受试者中的疾病或病症的用途。

[0122] 在一个例子中，所述疾病或病症是CD83介导的疾病或病症。

[0123] 在一个例子中，所述疾病或病症是自体免疫疾病或病症，或者炎性疾病或病症。例如，所述疾病或病症为重症肌无力、多发性硬化症、脉管炎、慢性炎性肠疾病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、HLA B27相关的自体免疫疾病例如白赫铁列夫症和系统性红斑狼疮、皮肤病例如银屑病、类风湿性关节炎和胰岛素依赖性糖尿病。

[0124] 在一个例子中，所述疾病或病症由受试者中的涉及抗原呈递细胞 (APC)(例如，树突状细胞(DC))和/或淋巴细胞(例如，T细胞)的免疫系统或细胞应答的机能障碍或不期望的功能导致。

[0125] 在另一个例子中，所述疾病或病症是组织或器官移植物排斥。例如，组织或器官移植排斥作为移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病的结果而发生。

[0126] 在另一个例子中，所述疾病或病症是干细胞移植物排斥，例如，造血干细胞移植(HSCT)或脐带血移植(UCBT)。例如，干细胞移植排斥作为移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病的结果而发生。所述HSCT 可例如直接来自骨髓，或来自从骨髓动员细胞(例如，通过施用G-CSF) 后的外周血。

[0127] 在一个例子中，所述方法包括将有效量的所述CD83结合蛋白(例如，治疗有效量的所述CD83结合蛋白)施用至供体和/或接受者。可在移植之前或之后使移植物与有效量的所述CD83结合蛋白离体或体内接触。

[0128] 本公开还提供了用于下调异体移植物的免疫活性的方法，所述方法包括使移植物与本公开的CD83结合蛋白或组合物接触。

[0129] 在一个例子中，所述异体移植物是造血干细胞移植物。

[0130] 在一个例子中，使移植物与本公开的CD83结合蛋白或组合物离体接触。

[0131] 在另一例子或附加的例子中，在移植移植物之前和/或同时和/或之后对移植物的接受者施用本公开的CD83结合蛋白或组合物。

附图说明

[0132] 图1：3C12 IgG1的表达和纯化的分析

[0133] (A)将未经还原(NR)和经2-巯基乙醇还原(R)的培养物上清液样品(i、iii)以及5μg亲和纯化的材料(ii、iv)在4％至12％的SDS-PAGE 上分离，并用考马斯蓝R250染色。(B)蛋白质的分析型尺寸排阻色谱 (SEC)-纯化的重组3C12抗体处于280nm(上图)和215nm(中图)，并且凝胶过滤标准处于215nm(下图)。样品未示出可检测的聚集，并且示出预期的分子量145kDa。

[0134] 图2：纯化的3C12抗人CD83 IgG的功能分析

[0135] (A)25μg·mL-1的3C12 IgG1结合CD83+细胞系KM-H2和L428，以及用人CD83转染的FDCP1细胞(FDCP1TF)。在未转染的FDCP1细胞 (CD83-)上未见到3C12和同种型IgG1对照之间的差异。MFI＝平均荧光强度。(B)相对于赫赛汀(阴性对照)，3C12 IgG1以5:1的效应子与靶细胞比率经CD16依赖的机制诱导了显著的KM-H2细胞系的裂解。通过双向方差分析来确定统计学显著性。误差棒表示五次重复的平均值标准差(SEM)。

[0136] 图3：3C12识别与其他CD83抗体重叠的构象表位

[0137] (A)用于检测5μg(i)变性的重组人CD83ECD-His或(ii)天然的重组人CD83ECD-His的CD83抗体的蛋白质印迹。非变性的CD83在12％凝胶上表现为三条拖尾的条带(30kDa、22kDa、19kDa)，这是同二聚化和对三个潜在的N-连接糖基化基序的糖基化的变异性所致。
单独的抗人IgG IRD800二抗用作阴性对照。(插入的表格)。同时添加CD83抗体至KM-H2细胞的影响以及所导致的3C12和其他抗体在平均荧光强度上的变化报道为百分率降低。

[0138] 图4：3C12 mAb提高异种GVHD模型中的SCID小鼠的体内存活。

[0139] 在第0天将CD83抗体或同种型匹配的对照施用至移植了人PBMC 的SCID小鼠后的动物存活。括号中示出了每个组群所使用的动物数量，并且用星号标出显著性差异(p<0.05)。(A)与同种型对照(抗人Her2； Herceptin IgG)相比的3C12 IgG的剂量优化。(B)
0.125mg剂量的3C12 IgG与兔多克隆RA83抗体或非特异性兔IgG(RAneg)的比较。所展示的数据汇集自5个独立的实验，每个实验包含每个组群的最少五只动物。 (C)施用1mg剂量的CD83抗体以及组合剂量的3C12和RA83治疗。

[0140] 图5：用几夫碱对3C12的糖修饰导致低岩藻糖IgG

[0141] (A)在2μg·mL-1几夫碱存在下3C12的产生(3C12.kif；上图)抑制岩藻糖的添加，而如通过MALDI TOF/TOF质谱所确定，岩藻糖是糖在对照3C12转染(3C12.WT；下图)内存在的大组分。对在每个主信号中通常产生的结构进行了注释，并以图示的方式表示为岩藻糖(三角形)、 GlcNAC(方块)、甘露糖(深灰色圆圈)和半乳糖(浅灰色圆圈)。(B) 3C12.WT和3C12.Kif具有标准的IgG分子量(未还原(NR)的为150kDa，以及还原(R)后观察到50kDa、
25kDa带)，以及(C)与相对于同种型对照(MFI＝335，灰色填充)的3C12.WT(MFI＝2581，叠加+
在灰色线上的黑色线)相比，几夫碱处理不改变3C12.kif IgG(MFI＝2573，灰色线)与CD83细胞系KM-H2的结合活性。

[0142] 图6：从VL改组的文库选择对人CD83具有提高的亲和力的scFv

[0143] (A)每轮用指定浓度的hCD83ECD-His染色展示VL改组的3C12 scFv 的酵母菌，并将其分选至高亲和力收集门P2和用于比较的较低严格的门 P3中。在门内展示了分选至P2和P3中的总细胞的百分率。第3轮分选包括选自具有较慢的解离速率的克隆。(B)比对3C12与亲和力提高的 VL变体而推断的VL氨基酸序列的框架区(FR)和互补决定区(CDR)。 (C)表达野生型3C12(3C12.WT)的单克隆酵母菌与表达亲和力提高的3C12变体(3C12.B至E)的单克隆酵母菌结合0.2nM hCD83ECD-His的比较。

[0144] 图7：表征重构的3C12VL改组的变体Fab

[0145] (A)BiaCore示踪显示在恒定注射Fab 3分钟(180s；缔合期)然后注射缓冲剂10分钟(600s；解离期)期间3C12.WT(上图)和3C12.C (下图)Fab片段与固定的CD83ECD-FC的结合。在指定的浓度系列内制备Fab的两倍稀释度。(B)与CD83+细胞系KM-H2结合的3C12.WT(圆圈)、3C12.C(方块)和IgG同种型对照(三角形)的稀释系列。

[0146] 图8：糖修饰和亲和力成熟增强CD83mAb的体外活性

[0147] 3C12.WT、3C12.C和3C12.kif的体外比较性效价。(A)CD83转染的 BB88细胞在用抗体和NK细胞(5:1效应子与靶细胞比率)于37℃下孵育4小时后的特异性裂解。赫赛汀＝人IgG1κ同种型对照。(B)在双向 MLR中(i)3C12变体和(ii)与RA83比较的抗增殖效果。所示的数据是五次重复的平均值±SEM，表示2至4个独立实验。

[0148] 图9：CD83亮血液树突状细胞由工程化的抗CD83 mAb体外靶向

[0149] 用5μg·mL-1 3C12.C、人IgG1κ同种型对照或无抗体处理培养PBMC 超过三天后对血液DC的影响，(i)活的(7AAD-)，活化的血液DC定义为共表达CMRF-44和CD83的谱系-HLA-DR+(HLA-DR门控，未示出) 细胞(＝总DC)。(ii)活化的DC门内的数量是总DC的百分率。各实验条件进行三次重复，并且展示的结果表示4个独立实验。

[0150] 图10：CD83抗原的密度与GFP表达水平以及体外ADCC效价有关

[0151] 表征具有不同CD83表达水平的BB88转染子；BB88-CD83-TF.5K (5,400MPC)、BB88-CD83TF.3K(3,600MPC)或BB88-CD83TF.2K (<2,300MPC)。(A)GFP的表达水平(左)以及通过BB88转染子上的 HB15a检测的CD83(右)。(B)在铬释放测定中由BB88转染子上的(i) 3C12.C、(ii)3C12.Kif或(iii)3C12.C.Kif在5:1的效应子与靶细胞的比率下诱导的ADCC。
数据展示为五次重复的平均值±SEM，并且所展示的结果表示2个独立实验。

[0152] 图11：3C12.C在体内具有与RA83等同的效价

[0153] 在异种人PBMC移植并在第0天施用0.125mg CD83抗体或同种型匹配抗体对照后SCID小鼠的存活。所展示的数据汇集自使用不同的人 PBMC供体的两个实验(各组群中使用的动物的总数展示于组群描述后的括号中)。用星号标出了显著性差异(p<0.05)。

[0154] 序列表

[0155]

[0156]

[0157]

[0158] 发明详述

[0159] 概述

[0160] 在整个本说明书中，除非另有特定指明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组的引用应当视为涵盖一个和多个(即，一个或多个)这些步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组。因此，除非上下文另有说明，否则本文所用的单数形式“一个”“一种”和“该”包括复数的方面。例如，对“一个”的引用包括单个以及两个或更多个；对“一种”的引用包括单种以及两种或更多种；对“该”的引用包括单个以及两个或更多个，等等。

[0161] 除非另有特定指明，否则本文描述的本公开的每个例子都可在加上必要的修改后应用到每个以及所有其他例子。

[0162] 本领域技术人员应领会，容易对本文的公开内容进行除了具体描述的那些之外的变型和修改。应理解，本公开包括所有这样的变型和修改。本公开还单独或一并包括在本说明书中引用的或描述的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合，或者所述步骤或特征中的任何两个或更多个。

[0163] 本公开不应由本文所描述的具体例子来限制范围，这些例子仅仅用于示例性的目的。如本文所述，功能等同的产物、组合物和方法清楚地落在本公开的范围内。

[0164] 除非另有指明，否则本公开在不进行过度实验的情况下使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液中肽合成、固相肽合成和免疫学的常规技术来进行。这样的方法在例如以下文献中有描述：Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories,New York,第二版(1989)，所有第I、II和 III卷；Benny K.C.Lo,Antibody Engineering:Methods and Protocols,(2004) Humana出版社，第248卷；DNA Cloning:A Practical Approach,第I和II 卷(D.N.Glover编，1985),IRL出版社,Oxford，全文；Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(M.J.Gait,编,1984)IRL出版社,Oxford, 全文，并且特别是其中由以下人员所著的文章：Gait，第l至22页；Atkinson 等，第35至81页；Sproat等，第83至115页；以及Wu等，第135至 
151页；Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach(B.D.Hames&S. J.Higgins编，1985)IRL出版社,Oxford,全文；Immobilized Cells and Enzymes:A Practical Approach(1986)IRL出版社,Oxford,全文；Perbal,B., A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methods In Enzymology(S. Colowick and N.Kaplan编,Academic出版社,Inc.),全系列；J.F.Ramalho Ortigao,"The Chemistry of Peptide Synthesis"In:
Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website(Interactiva,
Germany)；Sakakibara Biochem.Biophys.Res.Commun.73:336-342,1976；Merrifield J.Am. Chem.Soc.85:2149-2154,1963；Barany和Merrifield(1979)in The Peptides(Gross,E.和Meienhofer,J.编),第2卷，第1至284页，Academic 出版社,New 
York.12.Wunsch,E.编，(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(Miiler,E.编),第15卷, 第4版,第1和2部分,Thieme,Stuttgart；
Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；
Bodanszky,M.& Bodanszky,A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag, Heidelberg；Bodanszky Int.J.Peptide Protein Res.25:449-474,1985； Handbook of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C. Blackwell编，1986,Blackwell Scientific Publications)；以及Animal Cell Culture:Practical 
Approach,第3版(John R.W.Masters编,2000),ISBN 0199637970,全文。

[0165] 术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解成意为“X和Y”或“X或Y”，并且应视为提供对这两种含义或对任一含义的明确支持。

[0166] 在整个本说明书中，词语“包含”或其不同变化形式应理解为表示包含所述要素、整数或步骤，或者要素的组、整数的组或步骤的组，但不排除其他要素、整数或步骤，或者要素的组、整数的组或步骤的组。

[0167] 选择的定义

[0168] CD83是单次跨膜I型膜蛋白，并且是免疫球蛋白超家族的成员。已经发现了编码不同亚型的三个人转录物变体。出于命名并且非限制的目的，在SEQ ID NO:47(NP_004224.1；亚型a)、SEQ ID NO:48 (NP_001035370.1；亚型b)和SEQ ID NO:49(NP_001238830.1；亚型 c)中示出了人CD83(hCD83)亚型的氨基酸序列。因此，在一个例子中，人CD83的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:47、48或49中所示的氨基酸序列。CD83的同源物可在黑猩猩(Pan troglodytes)(XP_518248.2)、猕猴(Macaca mulatta)(XP_001093591.1)、家犬(Canis lupus familiaris) (XP_852647.1)、牛(Bos Taurus)(NP_001040055.1)、小家鼠(Mus musculus)(NP_033986.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus) (NP_001101880.1)和鸡(Gallus gallus)(XP_418929.1)中找到。本公开的示例性CD83结合蛋白与包括其重组形式(rhCD83)在内的hCD83 结合或特异性结合。

[0169] 术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”旨在意为由于其衍生起源或来源没有与在其天然状态下伴随它的天然结合组分相结合的蛋白质或多肽；其基本不含相同来源的其他蛋白质。可通过使用本领域已知的蛋白纯化技术进行分离，从而使得蛋白质基本不含天然结合的组分，或者使其为基本经纯化的。“基本经纯化的”意为蛋白质基本不含污染剂，例如，至少约70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或 99％不含污染剂。

[0170] 术语“重组”应理解为意为人工基因重组的产物。因此，在包含抗原结合结构域的重组蛋白质的上下文中，该术语不涵盖天然存在于受试者体内并且是在B细胞成熟期间发生的天然重组的产物的抗体。但是，如果将这样的抗体分离，则其被视为包含抗原结合结构域的分离的蛋白质。类似地，如果使用了重组方法来分离和表达编码该蛋白质的核酸，则所得的蛋白质是包含抗原结合结构域的重组蛋白质。重组蛋白质还涵盖当其处于细胞、组织或受试者中时(例如，蛋白质表达于其中)，通过人工重组的方法表达的蛋白质。

[0171] 术语“CD83结合蛋白”应视为包括能够以本文所描述和/或所要求的方式与CD83结合的单个多肽链(即，由肽键连接的一系列连续氨基酸) 或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(例如，多肽链复合物或蛋白质)。例如，可使用合适的化学键或二硫键来共价连接一系列多肽链。非共价键的例子包括氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用。

[0172] 术语“多肽”或“多肽链”应从前面的段落来理解，意为由肽键连接的一系列连续氨基酸。

[0173] 本文所用术语“抗原结合结构域”应视为意为抗体的能够特异性与抗原结合的区域，即，VH或VL，或包含VH和VL二者的Fv。抗原结合结构域不需要处于完整抗体的环境中，例如，其可为分离形式(例如，结构域抗体)或为其他形式(例如，scFv)。

[0174] 出于本公开的目的，术语“抗体”包括能够借助包含于Fv内的抗原结合结构域来与一个或一些紧密相关抗原(例如，CD83)特异性结合的蛋白质。该术语包括四链抗体(例如，两条轻(L)链和两条重(H)链)、重组的或修饰的抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植物抗体、灵长类化的抗体、去免疫化的抗体、同人源化的抗体、半抗体、双特异性抗体)。抗体一般包含恒定结构域，其可布置成恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。抗体的示例性形式包含四-链结构作为它们的基本单位。全长抗体包含共价连接的两条重链(每条～50kDa至70kDa) 以及两条轻链(每条～23kDa)。轻链一般包含可变区(如果存在的话) 和恒定结构域，并且在哺乳动物中是κ轻链或λ轻链。重链一般包含可变区和一个或两个恒定结构域，所述恒定结构域通过铰链区与额外的恒定结构域连接。哺乳动物的重链是以下类型中的一种：α、δ、ε、γ或μ。每条轻链也共价地连接一条重链。例如，两条重链以及重链和轻链通过链间二硫键以及通过非共价相互作用维持在一起。链间二硫键的数量可在不同类型的抗体中不同。每条链具有N端的可变区(VH或VL，其中每条为～110个氨基酸长)以及C末端的一个或多个恒定结构域。轻链的恒定结构域(CL，其为～110个氨基酸长)与重链的第一恒定结构域(CH1，其为330至440个氨基酸长)对齐，并通过二硫键结合至第一恒定结构域。轻链可变区与重链可变区对齐。抗体重链可包括2个或更多个额外的CH结构域(例如，CH2、CH3等)，并且在CH1和CH2恒定结构域之间可包含铰链区。抗体可为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一个例子中，所述抗体是鼠科(小鼠或大鼠)抗体，或灵长类(例如，人)抗体。在一个例子中，所述抗体被人源化、同人源化、嵌合、 CDR移植或去免疫化。

[0175] 术语“裸抗体”是指没有缀合至另一化合物例如有毒化合物或放射性标记的抗体。

[0176] 本文所用的“可变区”是指如本文所定义的抗体的轻链和/或重链的能够与抗原特异性结合的部分，并且包含互补决定区(CDR)(即，CDR1、 CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列。例如，可变区可包含与三个CDR一起的三个或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3以及FR4)。VH是指重链的可变区。VL是指轻链的可变区。

[0177] 本文所用术语“互补决定区”(同CDR，即，CDR1、CDR2和CDR3) 是指其存在是对特异性抗原结合的主要贡献因素的抗体可变区的氨基酸残基。每个可变区结构域(VH或VL)通常具有三个CDR区，鉴定为CDR1、 CDR2和CDR3。在一个例子中，分配至CDR和FR的氨基酸的位置根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991(本文中也称为“Kabat编号系统”)来定义。在另一个例子中，分配至CDR和FR的氨基酸位置根据增强的Chothia编号方案(http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)来定义。根据Kabat的编号系统，VH FR和CDR定位如下：残基1至30(FR1)、 31至35(CDR1)、36至49(FR2)、50至65(CDR2)、66至94(FR3)、 95至102(CDR3)以及103至113(FR4)。根据Kabat的编号系统，VL FR和CDR的定位如下：残基1至23(FRl)、24至34(CDR1)、35至 49(FR2)、50至56(CDR2)、57至88(FR3)、89至97(CDR3)以及 98至107(FR4)。本公开不限于由Kabat编号系统定义的FR和CDR，而是包括所有编号系统，包括标准编号系统，或者Chothia和Lesk J.Mol. Biol.196:901-917,1987；Chothia等，Nature 
342:877-883,1989；和/或 Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273:927-948,1997的编号系统；
Honnegher 和Plükthun J.Mol.Biol.309:657-670,2001的编号系统；或Giudicelli等， Nucleic Acids Res.25:206-211 1997中描述的IMGT系统。在一个例子中，根据Kabat编号系统来定义CDR。可选地，根据Kabat编号系统的重链 CDR2不包含本文列出的五个C端氨基酸，或由另一个天然存在的氨基酸取代的这些氨基酸中的任一个或多个。此外或作为另一选择，轻链 CDR1不包含本文列出的四个N端氨基酸，或由另一个天然存在的氨基酸取代的这些氨基酸中的任一个或多个。关于这点，Padlan等，FASEB J., 9:133-139,1995提出，重链CDR2的五个C端氨基酸和/或轻链CDR1 的四个N端氨基酸一般不涉及抗原结合。

[0178] “框架区”(FR)是除了CDR残基以外的那些可变区残基。

[0179] 本文所用术语“Fv”应视为意为任何这样的蛋白质，无论其由多个多肽还是由单个多肽构成，其中VL和VH结合，并形成具有能够与抗原特异性结合的抗原结合结构域的复合物。形成抗原结合结构域的VH和VL可处于单个多肽链中或处于不同多肽链中。此外，本公开的Fv(以及本公开的任何蛋白质)可具有多个抗原结合结构域，这些抗原结合结构域可结合或可不结合相同抗原。该术语应理解为涵盖由抗体直接衍生的片段以及与使用重组方法产生的这样的片段相对应的蛋白质。在一些例子中，VH不与重链恒定结构域(CH)1连接，和/或VL不与轻链恒定结构域(CL)连接。包含多肽或蛋白质的示例性Fv包括：Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、scFv、二抗体、三抗体、四抗体或更高级的复合物，或者与恒定区或其结构域(例如CH2结构域或CH3结构域)连接的上述物质中的任一种，例如，微型抗体。

[0180] “Fab片段”由一价的免疫球蛋白抗原结合片段组成，并且可通过用木瓜酶消化完整抗体从而得到由完整轻链和部分重链组成的片段来产生，或者使用重组方法来产生。

[0181] 抗体的“Fab'片段”可通过用胃蛋白酶处理完整抗体然后进行还原从而得到由完整轻链和包含VH和单个恒定结构域的部分重链组成的分子来得到。每个抗体经这种方法处理得到两个Fab'片段。Fab'片段还可通过重组方法来产生。

[0182] 抗体的“F(ab')2片段”由通过两个二硫键维持在一起的两个Fab'片段的二聚物组成，并且通过用酶胃蛋白酶处理完整的抗体分子而不进行后续的还原来得到。

[0183] “Fab2”片段是包含使用例如亮氨酸拉链或CH3结构域连接的两个Fab 片段的重组片段。

[0184] “单链Fv”或“scFv”是包含抗体的可变区片段(Fv)的重组分子，其中轻链的可变区和重链的可变区由合适的柔性多肽接头共价连接。

[0185] 在提及CD83结合蛋白或其抗原结合结构域与抗原的相互作用时，本文所用术语“结合”意为，依赖于所述抗原上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在的相互作用。例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而非一般性的蛋白质。在包含标记的“A”和抗体的反应中，如果抗体与表位“A”结合，则包含表位“A”(或游离的未标记的“A”)的分子的存在将降低与抗体结合的标记的“A”的量。

[0186] 本文所用术语“特异性结合”或“特异地结合”应视为意为，跟它与其他抗原或细胞结合相比，本公开的蛋白质以更大的持续时间和/或更大亲和力更频繁更快速地与特定的抗原或表达该抗原的细胞结合。例如，跟其与其他抗原结合相比，与抗原特异性结合的蛋白质以更大的亲和力、亲合力更容易地和/或以更大的持续时间结合该抗原。例如，跟它与其他免疫球蛋白超家族配体或由多反应性天然抗体(即，由已知结合人体内天然发现的多种抗原的天然存在的抗体)共同识别的抗原结合相比，蛋白质以大得多的亲和力与CD83(例如，hCD83)结合。通过阅读该定义还应理解，例如，与第一抗原特异性结合的蛋白质可特异性结合或不特异性结合第二抗原。同样地，“特异性结合”不必要求排他性结合或不可检测地与另一抗原结合，其意为术语“选择性结合”。在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白“特异性结合”抗原意为，蛋白质以以下平衡常数 (KD)结合抗原：100nM或更低，例如50nM或更低，例如20nM或更低，例如15nM或更低或者10nM或更低或者5nM或更低或者1nM 或更低或者500pM或更低或者400pM或更低或者300pM或更低或者 200pM或更低或者100pM或更低。

[0187] 本文所用术语“表位”(同“抗原决定簇”)应理解成意为CD83的由包含抗体的抗原结合结构域的蛋白质结合的区域。该术语不必限制于蛋白质所接触的特定的残基或结构。例如，该术语包含跨越被蛋白质接触的氨基酸的区域和/或该区外的至少5至10个或者2至5个或者1至3个氨基酸。在一些例子中，所述表位是线性系列氨基酸。当CD83是折叠的时，表位还可包含一系彼此邻近分布的不连续的氨基酸，即，“构象表位”。本领域技术人员还应知晓，术语“表位”不限于肽或多肽。例如，术语“表位”包括对化学活性表面分子的分组，例如，糖侧链、磷酰基侧链或磺酰基侧链，并且，在某些例子中，其可具有特定的三维结构特征和/ 或特定的电荷特征。可将表位或者包含该表位的肽或多肽施用至动物以生成针对该表位的抗体。

[0188] 术语“竞争性抑制”应理解成意为本公开的CD83结合蛋白降低或阻止所列举的抗体与CD83的结合，例如与hCD83的结合。这可能是由于蛋白质(或抗原结合结构域)结合与该抗体所结合的表位相同的表位或重叠的表位。从前文中应显而易见，蛋白质不需要完全抑制抗体的结合，而是其仅需要降低统计学显著性的量，例如，降低至少约10％或20％或 30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％。用于确定结合的竞争性抑制的方法是本领域已知的和/或在本文中有描述。例如，在存在或不存在蛋白质的情况下，将抗体暴露于CD83。如果在存在该蛋白质的情况下比在不存在该蛋白质的情况下更少的抗体结合，则该蛋白质被视为竞争性抑制该抗体的结合。在一个例子中，结合的竞争性抑制由CD83 上的蛋白质的抗原结合结构域与抗体的抗原结合结构域重叠所致。

[0189] 在两个表位的上下文中，“重叠”意为，两个表位共享充分数量的氨基酸残基，从而允许结合一个表位的本公开的结合蛋白竞争性抑制结合另一个表位的所列举的CD83的抗体的结合。例如，“重叠的”表位共享至少1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或 15或16或17或18或19或20个氨基酸。

[0190] 本文所用的“CD83相关病症或疾病”是指由CD83或表达CD83的细胞引起的或者与其相关的任何病症或疾病。本领域技术人员应容易地基于本文的公开内容和/或通过进行诊断CD83相关病症或疾病的测定来确定这样的病症或疾病。关于这点，在一些例子中，所述病症或疾病是炎性病症或疾病，或者自体免疫病症或疾病。本文包括对示例性的病症和疾病的描述。

[0191] 本文所用术语“预防”包括施用本公开的蛋白质从而阻止或阻碍病症或疾病的至少一种症状的发展。该术语还涵盖治疗处于缓解期的受试者以预防或阻碍复发。例如，在缓解期期间治疗罹患复发-缓解型多发性硬化症的受试者从而预防复发。

[0192] 本文所用术语“治疗”包括施用本文描述的蛋白质从而减轻或消除指定病症或疾病的至少一种症状。

[0193] 本文所用术语“受试者”应视为意为任何动物，例如，哺乳动物。在一个例子中，所述哺乳动物是人或非人灵长类。在一个例子中，所述哺乳动物是人。

[0194] 本文中对“样品”的提及应理解为对来源于受试者的任何样品的提及，例如但不限于，体液(例如，血液或血液级分例如血清或血浆、泪、尿、滑液或脑脊液)、细胞材料(例如，组织抽吸物)、组织活检样本或手术样本。在一些例子中，“样品”是血清、血浆、PBMC或血沉棕黄层级分中的一种或多种。

[0195] 本文所用术语“诊断(diagnosis)”及其变化形式，例如但不限于“诊断 (diagnose、diagnosed或diagnosing)”，包括对临床状态的任何初始诊断或对复发疾病的任何诊断。

[0196] 本文所用的“预后”及其变化形式是指很可能的疾病结果或病程，包括恢复或复发的机会或者治疗的结果。

[0197] 术语“表达构建体”应当以其最广的环境来看待，并且包括包含可操作地与本文描述的一个或多个核酸连接的一个或多个启动子的核酸。

[0198] 术语“表达载体”是指除包含表达构建体外还能够维持和/或复制处于可表达形式中的核酸的核酸。例如，表达载体可包括质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、病毒的子基因组或基因组片段。合适载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。

[0199] 本文所用术语“启动子”应当以其最广环境来看待，并且包含基因组基因的转录调控序列，包括精确起始转录所需的TATA盒或起始元件，含有或不含附加的调控元件(例如，上游活化序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，这些附加调控元件响应例如发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性的方式来改变核酸表达的。在存在启动子的环境中，术语“启动子”还用于描述重组核酸、合成核酸或融合核酸，或其衍生物，启动子赋予、活化或增强与其可操作连接的核酸的表达。示例性的启动子可包含一个或多个特异性调控元件的额外拷贝，以进一步增强表达和/ 或改变所述核酸的空间表达和/或时间表达。

[0200] 本文所用术语“可操作连接”意为相对于核酸布置启动子以使核酸的表达受该启动子的控制。可通过例如内部核糖体进入位点来将启动子可操作连接至多个核酸。

[0201] 包含抗原结合结构域的蛋白质

[0202] 抗体

[0203] 基于文库的方法

[0204] 本公开还涵盖对抗体或包含其抗原结合结构域(例如，包含其可变区)的蛋白质的文库的筛选，以鉴定本公开的CD83结合蛋白。例如，可对包含本公开的VH和多个VL区的文库进行筛选以鉴定本公开的CD83 结合蛋白。

[0205] 本公开预期的文库的例子包括天然文库(来自未激发的受试者)、免疫文库(来自经抗原免疫的受试者)或合成文库。通过常规技术(例如，如在Sambrook和Russell编，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版，第1至3卷，Cold Spring Harbor Laboratory出版社,2001中公开的) 克隆编码抗体或其区(例如，可变区)的核酸，并使用本领域已知的方法将所述核酸用于编码和展示蛋白质。用于产生蛋白质文库的另一些技术在例如US6300064(例如，Morphosys AG的HuCAL文库)、US5885793、 US6204023、US6291158或US6248516中有描述。

[0206] 根据本公开的CD83结合蛋白可为可溶的分泌蛋白质，或者可作为融合蛋白展示于细胞或颗粒(例如，噬菌体或其他病毒、核糖体或孢子) 的表面上。多种展示文库形式是本领域已知。例如，所述文库是体外展示文库(例如，核糖体展示文库、共价展示文库或mRNA展示文库，例如，如US7270969中所描述的)。在另一例子中，所述展示文库是噬菌体展示文库，其中将包含抗体的抗原结合结构域的蛋白质表达于噬菌体上，例如，如US6300064、US5885793、US6204023、US6291158或US6248516 中所描述的。其他噬菌体展示方法是本领域已知的，并且是本公开预期的。类似地，本公开预期了细胞展示的方法，例如，细菌展示文库，例如，如US5516637中描述的；酵母菌展示文库，例如，如US6423538中描述的；或哺乳动物展示文库。

[0207] 用于筛选展示文库的方法是本领域已知。在一个例子中，使用亲和纯化来筛选本公开的展示文库，例如，如Scopes(In:Protein purification: principles and practice,第三版,Springer Verlag,1994)中描述的。亲和纯化的方法通常涉及使由文库展示的包含抗原结合结构域的蛋白质与靶抗原 (例如CD83)接触，以及在洗涤后，洗脱仍然结合抗原的那些结构域。

[0208] 如果期望的话，容易地将通过筛选鉴定的任何可变区或scFv改造成完全抗体。用于将可变区或scFv改造或重构成完全抗体的示例性方法在例如以下文献中有描述：Jones等，J.Immunol.Methods 354:85-90,2010；或Jostock等，J.Immunol.Methods,289:65-80,2004。作为另一选择或此外，使用标准的克隆方法，例如，如在以下文献中描述的：Ausubel等，(In:Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience,ISBN 047 
150338,1987)，和/或(Sambrook等，(In:Molecular Cloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York, 第三版2001)。

[0209] 在一个例子中，本公开提供了通过筛选展示文库例如噬菌体展示文库(例如，如US6300064和/或US5885793中描述的)来产生或分离本公开的CD83结合蛋白的方法。例如，本发明人通过针对人CD83的重组细胞外结构域进行三轮选择来生物淘选人scFv免疫球蛋白基因文库从而分离了scFv。一旦分离后，即可使用本领域已知的方法来克隆和表达本发明的CD83结合蛋白，并将其任选重构为例如IgG1抗体。

[0210] 在一个例子中，本公开提供了产生CD83结合蛋白的方法，所述方法包括：

[0211] (i)针对结合CD83的细胞外结构域(例如，重组人CD83的细胞外结构域)的结合蛋白来筛选CD83结合蛋白制备物或文库；以及

[0212] (ii)分离对CD83的细胞外结构域具有期望的结合亲和力的CD83结合蛋白。

[0213] 在一个例子中，筛选CD83结合蛋白制备物。CD83制备物可通过例如用CD83抗原免疫动物以产生与CD83的细胞外结构域反应的抗体来制成。

[0214] 在另一例子中，筛选CD83结合蛋白文库。所述文库可为噬菌体文库，例如，scFv噬菌体文库或Fab噬菌体文库。

[0215] 在一个例子中，所述方法包括产生这样的噬菌体颗粒群体，在其表面展示对靶CD83表位或抗原具有结合特异性范围的结合分子群体。这样的噬菌体颗粒含有包含编码结合蛋白的核酸的噬菌粒基因组。可分离并克隆该核酸，并将其表达于重组系统中，以产生本发明的CD83结合蛋白。

[0216] 去免疫化、嵌合、人源化、同人源化、灵长类化、人和复合CD83结合蛋白

[0217] 本公开的CD83结合蛋白可为CDR移植的蛋白，其包含移植到来自人抗体的FR上或插入其中的来自非人物种(例如，小鼠或大鼠或非人灵长类)的抗体的CDR，或者其包含移植到来自另一抗体类型的FR上或插入其中的来自一种抗体类型(例如，人抗体的一种类型)的抗体的CDR。该术语还涵盖包含例如一个或多个CDR移植的可变区以及一个或多个例如人可变区、嵌合可变区、同人源化可变区或灵长类化可变区的复合蛋白质。

[0218] 本公开的CD83结合蛋白可为人源化蛋白质。

[0219] 术语“人源化蛋白质”应理解成是指包含人样可变区的蛋白质，所述人样可变区包含移植到来自非人抗体的FR或插入其中的来自人种(例如，小鼠或大鼠或非人灵长类)的抗体的CDR(该类型的抗体液称为“CDR 移植的抗体”)。人源化蛋白质还包括这样的蛋白质，其中人蛋白质的一个或多个残基由一个或多个氨基酸替换所修饰，和/或人蛋白质的一个或多个FR残基被相应的非人残基替换。人源化蛋白质还可包含既没在人抗体中发现也没在非人抗体中发现的残基。蛋白质的任何额外的区(例如， Fc区)一般是人的区。可使用本领域已知的方法来进行人源化，例如，如在US5225539、US6054297、US7566771或US5585089中所描述的。术语“人源化蛋白质”还涵盖超人源化的蛋白质，例如，如在US7732578 中描述的。该术语还涵盖包含例如一个或多个人源化的可变区以及一个或多个例如人可变区、嵌合可变区、同人源化可变区或灵长类化可变区的复合蛋白质。

[0220] 在一个例子中，人源化的CD83结合蛋白包含本文公开的轻链序列中的27d至34位、50至55位以及89至96位之间的区；以及本文公开的重链序列中的31至35b位、50至58位以及
95至101位之间的区(根据Kabat编号系统来编号)。关于这点，Padlan等，FASEB J.,9:133-
139, 1995提供了证据证明这些区是最有可能结合或接触抗原的区。

[0221] 本公开的CD83结合蛋白可为人蛋白质。本文所用术语“人蛋白质”是指具有在人中发现的可变抗体区以及任选恒定抗体区的蛋白质，例如，在人的种系细胞或体细胞中发现，或来自使用这样的区产生的文库。“人”抗体可包含不由人序列编码的氨基酸残基，例如，通过随机突变或体外定点突变(特别是包含保守替换的突变或者蛋白质的少数残基中，例如，在蛋白质的1、2、3、4或5个残基中)的突变所引入的突变。这些“人抗体”不必需要作为人的免疫应答的结果而生成，相反，它们可使用重组方法(例如，筛选噬菌体展示文库)和/或通过包含编码人抗体恒定区和 /或可变区的核酸的转基因动物(例如，小鼠)和/或使用导向选择(例如，如在US5565332中描述的)来生成。该术语还涵盖这样的抗体的亲和力成熟的形式。对于本公开的目的，人蛋白质还应视为包括这样的蛋白质，所述蛋白质包含来自人抗体的FR或包含来自人FR的共有序列的序列的 FR，并且其中CDR中的一个或多个是随机或半随机的，例如，如在 US6300064和/或US6248516中描述的。

[0222] 示例性的人CD83结合蛋白是包含以下可变区对的抗体：

[0223] (i)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:5所示的VL序列；或

[0224] (ii)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:6所示的VL序列；

[0225] (iii)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:7所示的VL序列；或

[0226] (iv)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:8所示的VL序列；或

[0227] (v)如SEQ ID NO:1所示的VH序列和如SEQ ID NO:9所示的VL序列。

[0228] 在一个例子中，VL序列缺乏C端的赖氨酸残基。可例如在产生或纯化CD83结合蛋白期间或通过重组工程化编码CD83结合蛋白的VL的核酸来去除本公开的CD83结合蛋白的VL序列的C端赖氨酸。因此，CD83 结合蛋白可包括VL的C端赖氨酸残基都被去除的群体、VL的C端赖氨酸残基未被去除的群体，或者包含具有VL的C端赖氨酸残基的蛋白质与没有VL的C端赖氨酸残基的蛋白质的混合物的群体。在一些例子中，所述蛋白质群体还可包括具有两个VL并且其中一个VL的C端赖氨酸残基被去除的蛋白质。类似地，蛋白质组合物可包含相同或相似的具有或没有VL C端赖氨酸残基的蛋白质群体的混合物。

[0229] 可选地，使VH连接至重链恒定区，例如，IgG1重链恒定区。在一个例子中，所述重链恒定区缺乏c端赖氨酸残基。

[0230] 可选地，使VL连接至轻链恒定区。

[0231] 本公开的CD83结合蛋白可为同人源化蛋白质。术语“同人源化蛋白质”是指通过US20080095767中描述的方法制备的蛋白质。同人源化 CD83结合蛋白包含抗体的可变区，其中所述可变区包含来自新世界灵长类抗体可变区的FR的可变区以及来自非新世界灵长类抗体可变区的 CDR。例如，同人源化CD83结合蛋白包含抗体的可变区，其中所述可变区包含来自新世界灵长类抗体可变区的FR的可变区以及来自小鼠或大鼠抗体的CDR。在一个例子中，所述同人源化的CD83结合蛋白是其中可变区中的一个或两个被同人源化的CD83结合抗体。该术语还涵盖包含例如一个或多个同人源化的可变区以及一个或多个例如人可变区或人源化可变区或嵌合可变区的复合蛋白质。

[0232] 本公开的CD83结合蛋白可为灵长类化蛋白质。“灵长类化蛋白质”包含来自在免疫非人灵长类(例如，食蟹猴猕猴)后生成的抗体的可变区。可选地，可将非人灵长类抗体的可变区连接至人恒定区以产生灵长类化的抗体。用于产生灵长类化的抗体的示例性方法在US6113898中有描述。该术语还涵盖包含例如一个或多个灵长类化的可变区以及一个或多个例如人可变区、人源化可变区或嵌合可变区的复合蛋白质。

[0233] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白是嵌合蛋白质。术语“嵌合蛋白质”是指这样的蛋白质，其中抗原结合结构域来自特定物种(例如，鼠科，如小鼠或大鼠)，或者属于特定抗体种类或亚类，同时蛋白质的其余部分来自来源于另一物种(例如，人或非人灵长类)的蛋白质或者属于另一抗体种类或亚类。在一个例子中，嵌合蛋白质是包含来自非人抗体(例如，鼠科抗体)的VH和/或VL的嵌合抗体，并且抗体的其余区来自人抗体。这样的嵌合蛋白质的产生是本领域已知的，并且可通过标准方法(如在例如US6331415；US5807715；US4816567和US4816397中描述的)来实现。该术语还涵盖包含例如一个或多个嵌合的可变区以及一个或多个例如人可变区或人源化可变区或嵌合可变区的复合蛋白质。

[0234] 本公开还预期了去免疫化CD83结合蛋白，例如，如在WO2000/34317  和US20070292416中描述的。去免疫化抗体和蛋白质去除(即，突变) 了一个或多个表位，例如B细胞表位或T细胞表位，从而降低受试者将针对该抗体或蛋白质提高免疫应答的可能性。
例如，分析本公开的CD83 结合蛋白以鉴定一个或多个B细胞表位或T细胞表位，并且突变所述表位内的一个或多个氨基酸残基，从而降低CD83结合蛋白的免疫原性。

[0235] 对本领域技术人员而言，应从前述公开内容显而易见的是，“复合”蛋白质包含一种形式的VH(例如，人VH)和另一种形式的VL(例如，人源化VL)。本公开明确地涵盖VH和VL的形式的所有组合。

[0236] 包含抗原结合结构域的其他CD83结合蛋白

[0237] 本公开还预期了包含抗体的可变区或抗原结合结构域的其他CD83 结合蛋白，例如：

[0238] (i)单一结构域抗体，其为包含抗体的全部或部分的VH或VL的单个多肽链，例如，如在US6248516中描述的；

[0239] (ii)双抗体、三抗体和四抗体，例如，如在US5844094和/或 US2008152586中描述的；

[0240] (iii)scFv，例如，如在US5260203中描述的；

[0241] (iv)微型抗体，例如，如在US5837821中描述的；

[0242] (v)“匙和孔”双特异性蛋白，例如，如在US5731168中描述的；

[0243] (vi)异源缀合蛋白质，例如，如在US4676980中描述的；

[0244] (vii)使用化学交联剂产生的异源缀合蛋白质，例如，如在US4676980 中描述的；

[0245] (viii)Fab'-SH片段，例如，如在Shalaby等，J.Exp.Med.,175:217-225, 1992中描述的；或

[0246] (ix)Fab3，例如，如在EP19930302894中描述的。

[0247] 恒定结构域融合物

[0248] 本公开涵盖包含抗体的抗原结合结构域和恒定区或Fc或其结构域 (例如，CH2和/或CH3结构域)的CD83结合蛋白。对本领域技术人员而言，合适的恒定区和/或结构域应是显而易见的，和/或容易从公共可用数据库得到这样的多肽的序列。Kabat等还提供了对一些合适的恒定区/ 结构域的描述。

[0249] 恒定区和/或其结构域可用于提供生物活性，例如，二聚化、延长血清半衰期(例如，通过结合FcRn)、抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)、补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。

[0250] 本公开还预期了包含突变体恒定区或结构域的CD83结合蛋白，如在US7217797；US7217798；或US20090041770(具有增加的半衰期) 或US7355008(提高的ADCC)中描述的。

[0251] 可在产生或纯化CD83结合蛋白期间或通过重组工程化编码CD83 结合蛋白重链的核酸来去除本公开的包含恒定区或Fc的CD83结合蛋白的重链恒定区的C端赖氨酸。因此，CD83结合蛋白可包括重链恒定区的C端赖氨酸残基都被去除的群体、重链恒定区的C端赖氨酸残基未被去除的群体，或者包含具有与没有重链恒定区的C端赖氨酸残基的蛋白质的混合物的群体。在一些例子中，所述蛋白质群体还可包括具有两个重链恒定区并且其中一个重链恒定区的C端赖氨酸残基被去除的蛋白质。类似地，蛋白质组合物可包含相同或相似的具有或没有重链恒定区的C端赖氨酸残基的蛋白质群体的混合物。

[0252] 增强效应子功能

[0253] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白可诱导效应子功能或增强的效应子功能。

[0254] 在本公开的上下文中，“效应子功能”是指由结合抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的细胞或蛋白质介导的导致杀伤细胞的生物学活性。由抗体诱导的效应子功能的例子包括：补体依赖的细胞毒性(CDC)；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性((ADCC)；抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)；以及B细胞活化。

[0255] “抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指由具有识别所结合的抗体的Fc区的Fc受体的效应细胞(例如，天然杀伤(“NK”)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)来裂解抗体覆盖的靶细胞。为了评价感兴趣分子的ADCC活性，进行了体外ADCC测定。用于这样的测定的可用效应细胞包括外周血单核细胞(“PBMC”)和NK细胞。

[0256] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白以使其能够诱导效应子功能例如ADCC和/或CDC的方式结合细胞表面上的CD83。

[0257] 例如，CD83结合蛋白保持结合细胞表面上的CD83的时间足以诱导效应子功能例如ADCC和/或CDC。

[0258] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白能够诱导增强的效应子功能，例如，借助修饰的Fc区或借助包含能够结合免疫效应细胞的区来进行。例如，效应子功能的水平相对于由人IgG1或IgG3 Fc区诱导的水平升高。由本公开的CD83结合蛋白诱导的增强的效应子功能可导致增强的治疗性效果或预防性效果，例如，通过杀伤或耗尽引起病症的细胞来进行，所述细胞例如在例如炎性和/或自体免疫病症或疾病中调节异常或不期望的应答的抗原呈递细胞(APC)(例如，树突状细胞(DC))和/ 或淋巴细胞(例如，T细胞)。在一个例子中，增强的效应子功能防止T 细胞的同种异体刺激，例如，通过杀伤或耗尽刺激同种异体T细胞的 CD83+细胞。

[0259] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白的Fc区被修饰成能够诱导比未修饰的Fc区提高的效应子功能水平。这样的修饰可为氨基酸水平的和/或二级结构水平的和/或三级结构水平的和/或针对Fc区的糖基化。

[0260] 本领域技术人员应领会，可通过一些方法中的任何方法来证明更大的效应子功能，例如，更大的效应水平、更持久的效应或更快的效应速率。

[0261] 在一个例子中，所述Fc区包含提高其诱导增强的效应子功能的能力的一个或多个氨基酸修饰。在一个例子中，所述Fc区以更大的亲和力结合一个或多个FcγR，例如FcγRIII。在一个例子中，所述Fc区包含在选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸替换：第230、233、234、 235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、 324、325、326、328、330、332和335位，根据Kabat的EU指数编号。在一个例子中，所述Fc区包含以下氨基酸替换S239D/I332E，根据Kabat 的EU指数编号。该Fc区与野生型Fc区相比在对FcγRIIIa的亲和力方面具有约14倍的升高，并且与野生型Fc区相比具有约3.3倍升高的诱导 ADCC的能力。在一个例子中，所述Fc区包含以下氨基酸替换 S239D/A330L/I332E，根据Kabat的EU指数编号。该Fc区与野生型Fc 区相比在对FcγRIIIa的亲和力方面具有约138倍的升高，并且与野生型Fc区相比具有约323升高的诱导ADCC的能力。

[0262] 其他增加Fc区诱导效应子功能的能力的氨基酸替换是本领域已知的和/或例如在US6737056或US7317091中有描述。

[0263] 在一个例子中，改变了Fc区的糖基化从而增加其诱导增强的效应子功能的能力。关于这点，由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支化的双触角寡糖，其一般通过N-连接来附接至Fc区的CH2结构域的 Asn297。所述寡糖可包括多种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接至双触角寡糖结构“主干”中GlcNAc的岩藻糖。在一些例子中，根据本公开的Fc区包含缺乏附接 (直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构，即，该Fc区是“去岩藻糖基化的”或“无岩藻糖基化的”。这样的变体可具有提高的诱导 ADCC的能力。用于产生去岩藻糖基化抗体的方法包括，在不能表达α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的细胞系中表达抗体或其抗原结合片段 (例如，如在Yumane-Ohnuki等，Biotechnol.Bioengineer.87:614-622, 2004中描述的)，在表达针对FUT8的小干扰RNA的细胞中表达抗体或其抗原结合片段(例如，如在Mori等，Biotechnol.Bioengineer.,88:
901-908, 2004中描述的)，在不能表达鸟苷二磷酸(GDP)-甘露糖4,6-脱水酶 (GMD)的细胞中表达抗体或其抗原结合片段(例如，如在Kanda等， J.Biotechnol.,130:300-310,2007中描述的)。本公开还预期了具有降低的去岩藻糖基化水平的抗体或其抗原结合片段的用途，所述抗体或其抗原结合片段例如使用改造成表达β—(l,4)-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶III (GnT-III)的细胞系产生(例如，如在Umāna等，Nat.Biotechnol.17: 176-180,1999中描述的)。

[0264] 在一个例子中，根据本公开的抗体是去岩藻糖基化的。例如，在不表达FUT8或经N-多糖过程抑制剂例如几夫碱处理的细胞(例如，哺乳动物细胞，如CHO细胞)中产生抗体。

[0265] 其他方法包括使用天然产生的能够诱导增强的Fc介导的效应子功能的抗体的细胞系(例如，用于产生病毒疫苗的鸭胚胎来源的干细胞， US20100062489；鸟 细胞中产生的重组蛋白质，US20100226912)。

[0266] 本公开的CD83结合蛋白还包括具有两段式寡糖的那些，例如，其中附接至Fc区的双触角寡糖被GlcNAc分成两段。这样的免疫球蛋白可具有降低的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。这样的抗体或其抗原结合片段的例子例如在US6602684和US20050123546中有描述。

[0267] 还预期了寡糖中的至少一个半乳糖残基附接至Fc区的CD83结合蛋白。这样的免疫球蛋白可具有提高的CDC功能。这样的免疫球蛋白例如在WO1997/30087和WO1999/22764中有描述。

[0268] CD83结合蛋白还可包含能够诱导增强的CDC水平的Fc区。例如， IgG1和IgG3的杂合体产生具有增强的CDC活性的抗体(Natsume等， Cancer Res.68:3863-3872,2008)。

[0269] 此外或作为另一选择，CD83结合蛋白可与结合免疫效应细胞(例如，借助结合CD3或CD16)的蛋白质(例如，抗体可变区)融合或缀合。

[0270] 用于确定效应子功能的方法是本领域已知的。在一个例子中，使用51Cr释放测定、铕释放测定或35S释放测定来评估ADCC活性水平。在这些测定的每一种中，在存在所列举化合物中的一种或多种并且处于足以让细胞摄取该化合物的条件下，培养表达CD83的细胞一段时间。在35S释放测定的情况下，可在存在35S标记的甲硫氨酸和/或半胱氨酸的条件下将细胞培养足以使标记的氨基酸并入新合成的蛋白质的时间。然后在存在或不存在该蛋白质并且在存在免疫效应细胞(例如PBMC和/或 NK细胞)的情况下培养细胞。然后，检测细胞培51 35
养基中 Cr、铕和/或 S的量，并且与不存在免疫球蛋白的情况相比存在蛋白质的情况下的升高表示该结合分子/结合剂具有效应子功能。公开用于评估由免疫球蛋白诱导的ADCC水平的测定的示例性出版物包括：Hellstrom等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 83:7059-7063,
1986和Bruggemann等，J.Exp.Med.166: 1351-1361,1987。

[0271] 用评估由免疫球蛋白诱导的ADCC水平的其他测定包括：用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.CA,USA) 或CytoTox 非放射性细胞毒性测定(Promega,WI,USA)。

[0272] 作为另一选择或此外，通过确定其对一个或多个FcγR的亲和力来评估CD83结合蛋白的效应子功能，如在US7317091中描述的。

[0273] 还可进行Clq结合测定来确认所述CD83结合蛋白能够结合Clq，并且可诱导CDC。为了评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如， Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202:163,1996)。

[0274] 在另一例子中，所述CD83结合蛋白包含增加蛋白质的半衰期的一个或多个氨基酸替换。例如，所述CD83结合蛋白包含含有增加恒定区对新生Fc区(FcRn)的亲和力的一个或多个氨基酸替换的恒定区。例如，在较低的pH(例如，约pH 6.0)下，所述恒定区具有升高的对FcRn的亲和力，从而有助于内体中Fc/FcRn的结合。在一个例子中，与它在约 pH 7.4下的亲和力相比，所述恒定区在约pH 6下具有升高的对FcRn的亲和力，这有助于在细胞在循环后将Fc重释放至血液中。这些氨基酸替换可用于通过降低从血液的清除来延长CD83结合蛋白的半衰期。

[0275] 示例性的氨基酸替换包括根据EU编号系统的T250Q和/或M428L 或T252A、T254S和T266F或M252Y、S254T和T256E或H433K和N434F。此外或作为另一选择的氨基酸替换在例如US20070135620或US7083784 中有描述。

[0276] 突变体CD83结合蛋白

[0277] 本公开还提供了具有与本文公开的序列至少80％同一性的CD83结合蛋白或编码该CD83结合蛋白的核酸。在一个例子中，本公开的CD83 结合蛋白或核酸包含与本文公开的序列至少约80％或81％或82％或83％或84％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％相同的序列，其中所述蛋白质特异性地结合CD83。

[0278] 此外或作为另一选择，所述CD83结合蛋白包含与根据任何例子的本文描述的VH或VL的CDR至少约30％或35％或40％或45％或50％或 55％或60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的CDR(例如，三个CDR)，其中所述蛋白质能够特异性地结合CD83。关于这点，本发明人已产生了在它们的CDR内具有多样性序列的许多抗体。本文描述了用于确定蛋白CD83的结合的方法。

[0279] 例如，发明人已经鉴定了这样的一组CD83结合蛋白，它们的轻链 CDR1共享至少约60％的同一性，例如，根据Kabat编号系统，它们的轻链CDR1共享至少约65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％或 96％或97％或98％或99％的同一性。

[0280] 发明人还鉴定了这样的一组CD83结合蛋白，它们的轻链CDR2共享70％的同一性，例如，根据Kabat编号系统，它们的轻链CDR2共享至少75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％的同一性。

[0281] 发明人还鉴定了这样的一组CD83结合蛋白，它们的轻链CDR3共享30％的同一性，例如，根据Kabat编号系统，它们的轻链CDR3共享至少35％或40％或45％或50％或55％或60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％的同一性。

[0282] 如本文所述，可缺失轻链CDR1的四个N端氨基酸，或者可用另一个天然存在的氨基酸替换这些氨基酸中的一个或多个(Padlan等，FASEB J.,9:133-139,1995)。因此，本公开的CD83结合蛋白包含与本文公开的轻链CDR1序列具有至少约70％同一性的CDR1。

[0283] 在另一例子中，本公开的核酸包含与本文公开的序列至少约80％或 85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的并且编码能够特异性结合CD83的CD83结合蛋白的序列。本公开还涵盖编码本公开的CD83结合蛋白的核酸，所述核酸因遗传密码的简并性而与本文示例的序列不同。

[0284] 核酸或多肽的％同一性通过GAP(Needleman和Wunsch.Mol.Biol. 48,443-453,1970)分析(GCG程序)来确定，其中缺口创造罚分＝5，并且缺口延伸罚分＝0.3。检索序列为至少50个残基长，并且缺口分析将两个序列在至少50个残基的区域内对齐。例如，检索序列为至少100个残基长，并且缺口分析将两个序列在至少100个残基的区域内对齐。例如，将两个序列在它们的全长内对齐。

[0285] 如上文所述，本公开还预期了在严格杂交条件下与本文描述的编码 CD83结合蛋白的核酸(例如，编码抗体3C12、3C12.B、3C12.C、3C12.D 或3C12.E的VH或VL的核酸)杂交的核酸。在本文中，“中度严格”定义为在范围介于45℃至65℃的温度下在2×SSC缓冲剂、0.1％(w/v)SDS 中或者同等条件下进行杂交和/或洗涤。在本文中，“高度严格”定义为在至少65℃的温度下并且在0.1×SSC缓冲剂、0.1％(w/v)SDS中或低盐浓度下或者同等条件下进行杂交和/或洗涤。本文提及的特定的严格水平涵盖使用本领域技术人员已知的除了SSC外的洗涤/杂交溶液的同等条件。例如，用于计算双链核酸的解链温度(也称为熔化温度，或Tm)的方法是本领域已知。与核酸的Tm相似(例如，5℃以内或10℃以内)或相等的温度被视为高度严格性。高度严格性被视为处于所计算的核酸的Tm 的10℃至20℃以内，或10℃至15℃以内。

[0286] 本公开还预期了与本文记载的序列相比包含一个或多个保守氨基酸替换的本公开的CD83结合蛋白的突变体形式。在一些例子中，所述CD83 结合蛋白包含10个或更少的保守氨基酸替换，例如，9或8或7或6或 5或4或3或2或1个保守氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是用具有相似的侧链和/或疏水性和/或亲水性的氨基酸残基来替换氨基酸残基的替换。

[0287] 具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已经定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。疏水指数在例如Kyte和Doolittle J.Mol.Biol, 157:105-132,1982中有描述，并且亲水指数在例如US4554101中有描述。

[0288] 本公开还预期了非保守氨基酸变化。例如，特别感兴趣的是用另一带电的氨基酸替换带电氨基酸，以及用中性氨基酸或带正电的氨基酸替换带电氨基酸。在一些例子中，所述CD83结合蛋白包含10个或更少的保守氨基酸替换，例如，9或8或7或6或5或4或3或2或1个非保守氨基酸替换。

[0289] 在一个例子中，所述突变发生于本公开的CD83结合蛋白的抗原结合结构域的FR内。在另一例子中，所述突变发生于本公开的CD83结合蛋白的CDR内。

[0290] 用于产生CD83结合蛋白的突变体形式的示例性方法包括：

[0291] ·DNA的诱变(Thie等，Methods Mol.Biol.525:309-322,2009)或 RNA(Kopsidas等，Immunol.Lett.107:163-168,2006；Kopsidas等，BMC Biotechnology,7:18,2007；以及WO 1999/058661)；

[0292] ·将编码所述多肽的核酸引入突变体细胞，例如，XL-1Red、 XL-mutS和XL-mutS-Kanr细菌细胞(Stratagene)；

[0293] ·DNA改组，例如，如在Stemmer,Nature 370:389-91,1994中公开的；以及

[0294] ·定点诱变，例如，如在Dieffenbach(编)和Dveksler(编)(In:PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NY,1995) 中描述的。

[0295] 对本领域技术人员而言，用于确定本公开的突变体CD83结合蛋白的生物学活性(例如，抗原结合)的示例性方法应是显而易见的，和/或在本文中有描述。例如，本文描述了用于确定抗原结合、结合的竞争性抑制、亲和力、缔合、解离和治疗效力的方法。

[0296] 示例性的CD83结合蛋白

[0297] 表1和2中描述了由发明人产生的包含示例性可变区的CD83结合蛋白及其编码核酸。

[0298] 表1：示例性的CD83结合蛋白和编码核酸的序列

[0299]

[0300] 表2：示例性CD83结合蛋白的VL中的氨基酸替换(相对于SEQ ID NO:5)

[0301]

[0302] 用于产生蛋白质的方法

[0303] 重组表达

[0304] 如本文所述，将编码本公开的CD83结合蛋白和/或其一个或多个多肽的核酸引入表达构建体，使其可操作连接至启动子，从而有助于其表达。用于产生表达构建体(例如，克隆至表达构建体/载体中)的方法是本领域已知的，和/或在以下文献中描述的：Ausubel等，(In:Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience,ISBN 047 150338, 1987)，和(Sambrook等，(In:Molecular Cloning:Molecular Cloning:A 
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York,第三版 2001)以及US7270969。

[0305] 在一个例子中，在细菌细胞中表达本公开的CD83结合蛋白。适于在细菌细胞(例如，选自由以下组成的组的细菌细胞：大肠杆菌、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)、沙门氏菌 (Salmonella sp.)、杆菌(Bacillus sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.) 中表达的典型的启动子包括但不限于例如以下启动子：lacz、Ipp、温度敏感的L启动子或R启动子、T7、T3、SP6，或者半人工启动子，例如， IPTG可诱导的tac启动子或lacUV5启动子。

[0306] 在另一例子中，在酵母菌细胞中表达所述CD83结合蛋白。适于在酵母菌细胞(例如，毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒酵母(S.pombe))中表达的典型启动子包括但不限于来自以下基因的启动子：基因ADH1、GAL1、GAL4、CUP1、PHO5、 nmt、RPR1或TEFL。

[0307] 在另一例子中，在昆虫细胞中表达所述CD83结合蛋白。适于在昆虫细胞中或昆虫中表达的典型启动子包括但不限于：OPEI2启动子、分离自家蚕(Bombyx muri)的昆虫肌动蛋白启动子、果蝇(Drosophila sp.) dsh启动子(Marsh等，Hum.Mol.Genet.9:,13-25,2000)。

[0308] 还可在植物细胞中表达本公开的CD83结合蛋白。用于在植物细胞中表达肽的启动子是本领域已知，并且包括但不限于大麦(Hordeum vulgare)淀粉酶基因启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、胭脂碱合酶(NOS)基因启动子和生长素可诱导植物启动子P1和P2。

[0309] 在一个例子中，在哺乳动物细胞细胞中或哺乳动物内表达本公开的 CD83结合蛋白。适于在哺乳动物细胞中表达的典型启动子包括例如选自由以下组成的组的启动子：逆转录病毒LTR元件、SV40早期启动子、 SV40晚期启动子、CMV IE(巨细胞病毒立即早期)启动子、EF1启动子(来自人延伸因子1)、EM7启动子、UbC启动子(来自人泛素C)。可用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括：由SV40转化的猴肾CV1系 (COS-7)；人胚胎肾系(HEK-293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；非洲绿色猴肾细胞(VERO-76)；或骨髓瘤细胞 (例如，NS/0细胞)。

[0310] 用于表达本公开的CD83结合蛋白的示例性细胞是CHO细胞、骨髓瘤细胞或HEK细胞。所述细胞还包含有助于修饰的抗体表达的一个或多个基因突变和/或缺失。一个非限制性例子是缺失编码对所表达的免疫球蛋白或抗体进行岩藻糖基化所需的酶的基因。例如，所缺失的基因编码 FUT8。FUT8缺失的细胞市售源是Biowa(PotelligentTM细胞)。例如，用于表达去岩藻糖基化免疫球蛋白或抗体的细胞是FUT8缺失的CHO细胞，例如Biowa的PotelligentTM细胞。

[0311] 表达构建体/载体的其他元件是本领域已知，并且包括例如，增强子、转录终止子、多腺苷酸化序列、编码可选择或可检测标志物的核酸编码和复制起始点。

[0312] 在一个例子中，表达构建体是双顺反子表达构建体。“双顺反子”意为能够由不同的核酸区编码两个不同的多肽的单个核酸分子，例如，能够编码包含多肽的VH和包含作为不同多肽的多肽的VL的单一的核酸。一般而言，编码每个不同多肽的区由内部核糖体进入位点(IRES)隔开，并且IRES的5'区不包含转录终止序列。示例性的IRES在例如 US20090247455中有描述。

[0313] 在产生合适的表达构建体后，使用本领域已知的任何方法将其引入合适的细胞中。示例性的方法包括，显微注射、由DEAE-右旋糖酐介导的转染、由脂质体(例如通过使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/ 或cellfectin(Gibco,MD,USA))介导的转染、PEG介导DNA摄入、电穿孔以及微粒轰击(例如，通过使用DNA覆盖的钨颗粒或金颗粒 (Agracetus Inc.,WI,USA))等。

[0314] 然后在本领域已知的条件下培养用于产生本公开的CD83结合蛋白的细胞，以产生本公开的CD83结合蛋白。

[0315] 本公开还预期了无细胞表达系统，例如，TNT T7和TNT T3系统 (Promega)、pEXP1-DEST和pEXP2-DEST载体(Invitrogen)。

[0316] 蛋白质纯化

[0317] 在产生/表达本公开的CD83结合蛋白后，可使用本领域已知的方法对其进行纯化。这样的纯化使本公开的蛋白质基本不含非特异性的蛋白质、酸、脂质、碳水化合物等。在一个例子中，所述蛋白质将处于这样的制备物中，其中该制备物中的多于约90％(例如，95％、
98％或99％) 的蛋白质是本公开的CD83结合蛋白。

[0318] 采用肽纯化的标准方法以得到分离的本公开的CD83结合蛋白，所述方法包括但不限于多种高压(或高效)液相色谱(HPLC)和非HPLC 多肽分离方案，例如，尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、混合模式色谱、相分离法、电泳分离、沉淀法、盐溶/盐析法、免疫色谱和/或其他方法。

[0319] 在一个例子中，亲和纯化可用于分离包含标记的融合蛋白。用于使用亲和色谱来分离蛋白质的方法是本领域已知的，并且在例如Scopes(In: Protein purification:principles and practice,第三版,Springer Verlag,1994) 中有描述。例如，将结合标记(这可为多组氨酸标记的情况，例如，镍 -NTA)的抗体或化合物固定于固体支持物上。然后使包含蛋白质的样品与固定化的抗体或化合物接触一段时间，并处于足以发生结合的条件下。在洗涤以去除任何未结合的或非特异性结合的蛋白质后，洗脱蛋白质。

[0320] 在CD83结合蛋白包含抗体的Fc区的情况下，可使用蛋白A或蛋白 G或其修饰形式来进行亲和纯化。可使用蛋白A来分离包含人γ1、γ2或γ4重链Fc区的纯化蛋白质。建议将蛋白G用于所有的小鼠Fc同种型或用于人γ3。

[0321] 缀合物

[0322] 在一个例子中，将本公开的CD83结合蛋白缀合至化合物。例如，所述化合物选自由以下组成的组：放射性同位素、可检测标记、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、增加受试者中CD83结合蛋白的半衰期的化合物，及其混合物。

[0323] 可使所述化合物直接或间接结合至CD83结合蛋白(例如，在间接结合的情况下可包含接头)。化合物的例子包括，放射性同位素(例如，碘-131、钇-90或铟-111)、可检测标记(例如，荧光团或荧光纳米晶体)、治疗性化合物(例如，化疗剂或抗炎性剂)、胶体(例如，金)、毒素(例如，蓖麻毒素或破伤风类毒素)、核酸、肽(例如，血清白蛋白结合肽)、蛋白质(例如，包含抗体的抗原结合结构域的蛋白质，或血清白蛋白)、增加受试者中的CD83结合蛋白的半衰期的化合物(例如，聚乙二醇或具有该活性的其他水溶性聚合物)，及其混合物。可缀合至本公开的CD83 结合蛋白的示例性化合物以及用于这种缀合的方法是本领域已知，并且在例如US2010221262中有描述。

[0324] 表3中列出了可缀合至本公开的CD83结合蛋白的一些示例性的化合物。

[0325] 表3：可用于缀合的化合物

[0326]

[0327]

[0328] 筛选测定

[0329] 容易地针对生物学活性来筛选本公开的CD83结合蛋白，例如，如下文所述。

[0330] 结合测定

[0331] 一种测定形式是抗原结合测定，例如，如在Scopes(In:Protein purification:principles and practice,第三版,Springer Verlag,1994)中描述的。这样的方法一般涉及标记所述CD83结合蛋白，并使其与固定化的抗原接触。在洗涤以去除非特异性结合的蛋白质后，检测标记的量，并且作为结果，检测结合的蛋白质。当然，可固定所述CD83结合蛋白，并标记抗原。还可使用淘选型测定，例如，如在本文中描述或示例的。作为另一选择或此外，可使用表面等离子共振测定。

[0332] 在一个例子中，用包含CD83的表位的多肽进行结合测定。通过此方式，选择结合CD83的特定区的CD83结合蛋白。

[0333] 体内测定

[0334] 还可评估本公开的CD83结合蛋白在病症(例如，CD83介导的病症) 的动物模型内的治疗效力。例如，将所述CD83结合蛋白施用至炎性肠疾病或结肠炎模型(例如，右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎或结肠炎的CD45Rb过继转移模型(例如，Kanai等，Inflamm.Bowel Dis.12: 89-99,2006)。在另一例子中，将CD83结合蛋白施用至多发性硬化症模型，例如，EAE模型，其中用髓鞘蛋白或由此衍生的肽(例如，MOG、 MBP或PLP)免疫小鼠或大鼠，并针对该蛋白质生成免疫应答，从而诱导多发性硬化症模型。示例性的EAE模型在例如Tsunoda和Fujinami,J. Neuropathol.Exp.Neurol.55:673-686,1996中有回顾。此外或作为另一选择，可在关节炎模型中测试所述CD83结合蛋白，例如小鼠的SKG菌株 
(Sakaguchi等,Nature 426:454-460,1995)、大鼠II型骨胶原关节炎模型、小鼠II型骨胶原关节炎模型或抗原诱导的关节炎模型(Bendele J. Musculoskel.Neuron.Interact.1:
377-385,2001)和/或炎性气道疾病模型 (例如，OVA激发或蟑螂抗原激发)。

[0335] 此外或作为另一选择，可在移植物抗宿主应答模型中评估本公开的 CD83结合蛋白的治疗效力，例如，其中将来自一个动物的脾细胞注射至同种异体动物(例如，MHC或HLA不匹配的动物)中。在一个例子中，在亚致命总体照射以诱导需要人DC的致命性人CD4+T细胞介导的移植物抗宿主应答后，通过例如腹膜内注射，将人外周血单核细胞(PBMC) 移植到异种SCID小鼠模型内。可将用本公开的CD83结合蛋白的治疗施用至小鼠，例如，通过在PBMC移植的那天(第0天)腹膜内注射来施用，并针对GVDH的临床表现来对小鼠评分。

[0336] 竞争性结合测定

[0337] 对于本领域技术人员而言，用于确定竞争性抑制本公开的抗体的结合的CD83结合蛋白的测定应是显而易见的。例如，将本公开的抗体缀合至可检测标记，例如，荧光标记或放射性标记。然后将标记的抗体与受试CD83结合蛋白混合，并使其与CD83或包含其表位的肽接触。然后确定标记的抗体的水平，并且将其与当在不存在所述CD83结合蛋白的情况下使标记的抗体与CD83或包含其表位的肽接触时确定的水平进行比较。如果与不存在所述CD83结合蛋白的情况相比，在存在所述CD83 结合蛋白的情况下标记的抗体的水平降低，则所述CD83结合蛋白竞争性地抑制该抗体的结合。

[0338] 任选地，将所述CD83结合蛋白缀合至与该抗体不同的标记。这使得能够检测所述CD83结合蛋白结合CD83或带有表位的肽的水平。

[0339] 在另一例子中，在使CD83或肽与本文描述的抗体接触之前，使所述CD83结合蛋白结合CD83或包含其表位的肽。与不存在所述CD83结合蛋白的情况相比，在存在所述CD83结合蛋白的情况下结合的抗体的量降低表示所述CD83结合蛋白竞争性地抑制该抗体与CD83的结合。还可使用标记的CD83结合蛋白并且首先使所述抗体结合CD83或肽来进行相互测定。在这种情况下，与不存在抗体的情况相比，在存在抗体的情况下结合CD83或肽的标记的CD83结合蛋白的量降低表示所述CD83结合蛋白竞争性地抑制该抗体与CD83的结合。

[0340] 表位作图测定

[0341] 在另一例子中，对由本文描述的蛋白质结合的表位进行作图。对本领域技术人员而言，表位作图方法应是显而易见的。例如，产生跨越CD83 序列或其包含感兴趣的表位的区的一系列重叠肽，例如包含10至15个氨基酸的肽。然后使所述CD83结合蛋白与每种肽或其组合接触，并确定所述CD83结合蛋白所结合的肽。这使得能够确定包含所述CD83结合蛋白所结合的表位的肽。如果该蛋白质结合多种非连续的肽，则该蛋白质可结合构象表位。

[0342] 作为另一选择或此外，突变CD83内的氨基酸残基，例如通过丙氨酸扫描诱变来突变，并确定降低或阻止蛋白质结合的突变。降低或阻止所述CD83结合蛋白结合的任何突变都很可能处于蛋白质所结合的表位内。

[0343] 另一种方法涉及使CD83或其区与本公开的固定化的CD83结合蛋白结合，并用蛋白酶消化所得的复合物。然后分离并分析保持与固定化的蛋白质结合的肽，例如使用质谱仪来分析，从而确定它们的序列。

[0344] 另一种方法涉及将CD83或其区中的氢转换成氘原子，并使所得的蛋白质与本公开的固定化的CD83结合蛋白结合。然后，将氘原子转换回氢，分离CD83或其区，用酶消化，并分析，例如使用质谱仪分析，以鉴定包含氘的那些区，这些氘通过结合本文描述的CD83结合蛋白而受到保护免于被转化。

[0345] 半衰期测定

[0346] 本公开涵盖的一些CD83结合蛋白具有延长的半衰期，例如，与未经修饰的CD83结合蛋白相比经修饰以延长它们的半衰期。对于本领域技术人员而言，用于确定具有延长的半衰期的CD83结合蛋白的方法是显而易见的。例如，评估CD83结合蛋白结合新生Fc受体(FcRn)的能力。关于这点，增加的FcRn的结合亲和力增加了所述CD83结合蛋白的血清半衰期(参见例如，Kim等，Eur.J.Immunol.,24:2429,1994)。

[0347] 还可通过药代动力学研究来测量本公开CD83结合蛋白的半衰期，例如，根据Kim等，Eur.J.of Immunol.24:542,1994描述的方法。根据该方法，将放射性标记的CD83结合蛋白经静脉内注射至小鼠中，并定期测量其作为时间的函数的血浆浓度，例如在注射后第3分钟至72小时进行测量。由此得到的清除曲线应当是两相性的，即，α相和β相。为了确定所述CD83结合蛋白的体内半衰期，计算β相中的清除速率，并将其与野生型或未经修饰的CD83结合蛋白的清除速率进行比较。

[0348] 稳定性测定

[0349] 可通过多种测定来评估本公开的CD83结合蛋白的稳定性。例如，将所述CD83结合蛋白暴露于一定条件下，例如加热或酸或者于室温下储存一段时间(例如，1个月)。然后，可通过确定浊度(在暴露于所述条件下后浊度的升高表示不稳定)、尺寸排阻色谱、非还原性凝胶电泳或本文描述的结合或中和研究来评估所述CD83结合蛋白的聚集。

[0350] 药物组合物和治疗方法

[0351] 本公开的CD83结合蛋白或编码该CD83结合蛋白的核酸或表达该 CD83结合蛋白的细胞(同活性成分)可用于肠胃外施用、局部(topical) 施用、口服施用、或局部(local)施用、气溶胶施用、或经皮施用，用于预防性治疗或用于治疗性治疗。

[0352] 待施用的CD83结合蛋白或编码该CD83结合蛋白的核酸或表达该 CD83结合蛋白的细胞的配制将根据所选择的施用途径和制剂(例如，溶液剂、乳剂、胶囊剂)而不同。待施用的包含CD83结合蛋白或编码该 CD83结合蛋白的核酸或表达该CD83结合蛋白的细胞的合适药物组合物可制备于生理学可接受载体中。还可使用CD83结合蛋白的混合物。对于溶液剂或乳剂而言，合适的载体包括例如，水性溶液或醇/水溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物可包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格液或固定油。多种合适的水性载体是本领域技术人员已知的，包括水、缓冲水、缓冲盐水、多元醇 (例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)、右旋糖溶液和甘氨酸。静脉内媒介物可包括多种添加剂、保存剂，或流体、营养素或电解质补充物(一般参见Remington's Pharmaceutical Science，第16版，Mack编，1980)。所述组合物可任选按需要包含可药学可接受辅料物质以接近生理学条件，例如pH调节剂和缓冲剂和毒性调节剂，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。可根据本领域已知的冻干和重构技术冻干本公开的CD83结合蛋白用于保存，并在使用之前重构于合适的载体中。

[0353] 所选择的介质中活性成分的最优浓度可根据本领域技术人员公知的方法依经验来确定，并且所述最优浓度取决于所期望的最终药物制剂。

[0354] 本公开的CD83结合蛋白的施用的剂量范围是大到足以产生期望效果的剂量范围。例如，所述组合物包含治疗有效量或预防有效量的所述CD83结合蛋白或编码该CD83结合蛋白的核酸或表达该CD83结合蛋白的细胞。

[0355] 本文所用术语“有效量”应被视为意为足以诱导/提高或抑制/降低/阻止受试者中的CD83活性的所述CD83结合蛋白、核酸或细胞的量。本领域技术人员应知晓，这样的量将根据例如所述CD83结合蛋白、核酸或细胞和/或具体的受试者和/或被治疗的病症的类型或严重程度而不同。因此，该术语不应被解读为将本公开限制于特定的量，例如，CD83结合蛋白、核酸或细胞的重量或数量。

[0356] 本文所用术语“治疗有效量”应被视为意为足以降低或抑制病症的一种或更多种症状的CD83结合蛋白、核酸或细胞的量。

[0357] 本文所用术语“预防有效量”应被视为意为足以防止或抑制病症的一种或更多种可检测症状或延迟所述症状起始的CD83结合蛋白、核酸或细胞的量。

[0358] 所述剂量不应大到引起不良的副作用，例如，高粘滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。一般而言，所述剂量将根据患者的年龄、病症、性别和疾病程度而不同，并且可由本领域技术人员来确定。所述剂量可由处于任何并发症事件中的单个的医生来调节。剂量可在约0.1mg/kg至约300mg/kg变化，例如约0.2mg/kg至约200mg/kg，例如约0.5mg/kg 至约20mg/kg，每日施用一剂或多剂，持续一天或数天。

[0359] 在一个例子中，经皮下或经静脉内施用所述CD83结合蛋白。

[0360] 在一些例子中，以高于后续剂量(维持剂量)的初始(或负载)剂量来施用所述CD83结合蛋白或其他活性成分。例如，以介于约1mg/kg 至约30mg/kg的初始剂量施用所述结合分子。然后以介于约0.0001mg/kg 至约1mg/kg的维持剂量来施用所述结合分子。可每7天至35天施用维持剂量，例如，每14或21或28天。

[0361] 在一些例子中，使用剂量增加方案，其中以比后续剂量中使用的更低的剂量来初始施用CD83结合蛋白或其他活性成分。该剂量方案可用于受试者开始时遭受不良事件的情况。

[0362] 在受试者没有对治疗进行充分应答的情况下，可一周施用多剂。作为另一选择或此外，可施用越来越高剂量。

[0363] 可通过合适的途径将本公开的一种或更多种CD83结合蛋白施用至个体，单独施用或与另一药物或药剂组合(在其之前、同时或之后)施用。例如，本公开的CD83结合蛋白还可用于与蛋白质组合，例如，TNF 拮抗剂、抗-IL-12/23抗体、消炎剂、皮质类固醇、甲氨蝶呤或止痛剂。本公开的CD83结合蛋白可用作单独施用的组合物，与抗生素和/或抗微生物剂联合给药。

[0364] 本领域技术人员应领会，可通过施用本公开的表达构建体或表达本公开的CD83结合蛋白的细胞来将本公开的CD83结合蛋白引入受试者中。可使用多种方法在体内将编码所述抗体的核酸引入靶细胞。例如，可在靶位点注射裸核酸，或可将其封装至脂质体中，或可通过病毒载体的方式来引入。

[0365] CD83检测测定

[0366] 可用本公开的CD83结合蛋白(例如如本文描述的缀合至可检测标记的CD83结合蛋白)来进行以下测定。用本文描述的测定的CD83的检测可用于对病症进行诊断或预后。

[0367] 免疫测定法是用于诊断受试者中的病症或检测样品中的CD83的一种示例性测定形式。本公开预期了任何形式的免疫测定，包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光连接的免疫吸附测定(FLISA)、竞争性测定、放射免疫测定、横向流动免疫测定、穿流免疫测定、电致化学发光测定、基于比浊的测定、基于浊度的测定和基于荧光活化的细胞分选(FACS)的测定。

[0368] 一种合适的免疫测定的形式是例如，ELISA或FLISA。

[0369] 在一种形式中，这样的测定涉及将本公开的CD83结合蛋白固定于固体基质上，例如，固定于聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或量杆、膜、或玻璃支持物(例如，载玻片)上。然后使受试样品与所述CD83结合蛋白直接接触，并且样品中的CD83被结合或捕获。在洗涤以去除样品中任何未结合的蛋白质后，使在不同表位结合CD83的蛋白质直接与捕获的 CD83接触。一般用可检测报告分子来标记该检测蛋白，例如，在ELISA 的情况下的酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或β- 半乳糖苷酶)，或者在FLISA的情况下的荧光团。作为另一选择，可使用结合检测蛋白质的第二标记的蛋白。在洗涤以去除任何未结合的蛋白质后，在ELISA的情况下，通过添加底物来检测可检测的报告分子，例如，过氧化氢、TMB，或甲苯胺，或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(x-gal)。当然，可以以相反的方式使用固定化的(捕获)蛋白质和检测蛋白质。

[0370] 然后使用已经通过使用已知量的标志物产生的标准曲线或通过比较对照样品来来确定样品中的抗原的水平。

[0371] 容易地改造上文描述的测定以使用化学发光或电致化学发光作为检测的基础。

[0372] 对本领域技术人员应显而易见的是，基于免疫吸附测定的其他检测方法可用于本公开的性能。例如，一种免疫吸附方法基于上文描述，使用放射性标记或金标记(例如，胶体金)用于检测，或使用脂质体例如封装的NAD+用于检测，或使用吖啶连接的免疫吸附测定。

[0373] 在本公开的一些例子中，使用表面等离子共振检测器(例如， BIAcoreTM,GE Healthcare,Piscataway,N.J.)、穿流装置(例如，如US7205159中描述的)、微或纳米免疫测定设备(例如，如US7271007 中描述的)、横向流动设备(例如，如US20040228761或US20040265926 中描述的)、荧光极化免疫测定(FPIA，例如，如US4593089或US4751190 中描述的)或免疫浊度测定(例如，如US5571728或US6248597中描述的)来确定CD83的水平。

[0374] 病症或疾病

[0375] 本公开的CD83结合蛋白可用于CD83相关病症或疾病的治疗、预防、诊断或防范。

[0376] 可通过进行本公开的方法来治疗、预防、诊断或预后的示例性的病症或疾病包括炎性或自体免疫病症或疾病。

[0377] 示例性的病症和疾病包括过敏、哮喘、移植物排斥、自体免疫病症例如重症肌无力、多发性硬化症、脉管炎、慢性炎性肠疾病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、HLA B27相关的自体免疫疾病例如白赫铁列夫症和系统性红斑狼疮、皮肤病例如银屑病、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病和AIDS。

[0378] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白耗尽免疫细胞(例如，抗原呈递细胞(APC)(例如，树突状细胞(DC))和/或淋巴细胞(例如， T细胞))以调节例如炎性和/或自体免疫病症或疾病中的异常的或不期望的免疫应答。在一个例子中，所述CD83结合蛋白是特异性结合至APC 和/或淋巴细胞的表面并通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC) 来耗尽所述APC和/或淋巴细胞的抗体。在一个例子中，ADCC由天然杀伤(NK)细胞介导。

[0379] 移植物排斥

[0380] 在一个例子中，本公开的CD83结合蛋白可用于耗尽免疫细胞例如 APC和/或淋巴细胞，从而调节与例如移植物排斥(例如，通过移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病))相关的免疫应答。在一个例子中，所述移植物是器官或组织或细胞移植物。在一个例子中，所述移植物是同种异体移植物。在一个例子中，所述移植物是造血干细胞移植物。

[0381] 在将免疫活性移植物(例如同种异体造血干细胞移植物)与活的功能性免疫细胞一起施用至接受者(例如，组织不相容接受者)并且移植物中存在的免疫细胞(例如T细胞)攻击移植物接受者的组织的情况下，可导致移植物抗宿主疾病。

[0382] 在通过供体或受体APC将来源于异体移植物的抗原展示给受体的免疫细胞(例如，T细胞)，所述免疫细胞进而活化成效应免疫细胞(例如，随后攻击移植物的细胞毒性T淋巴细胞(CTL))的情况下，可导致宿主抗移植物疾病。

[0383] “同种异体移植物”是来自相同物种的遗传不同的供体(例如，组织不相容供体)的移植物。

[0384] 造血干细胞移植(HSCT)

[0385] “造血干细胞移植(HSCT)”是包含可来源于例如骨髓或外周血的多能造血干细胞的移植物。所述移植物可包含一些非干细胞，例如，APC，包括DC和/或淋巴细胞。

[0386] “造血干细胞”可自我更新和分化以产生所有血细胞类型，包括骨髓细胞(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞)、红系细胞(红细胞)、巨核细胞(血小板)和淋巴谱系细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)。在整个分化过程中，造血干细胞首先失去其自我更新能力，然后随着其致力于成熟的效应细胞而逐步地失去谱系潜能。通常来说，Lin-、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA- 人细胞是造血干细胞。在一个例子中，使用CD34的表达来鉴定分离自人供体的外周血中的造血干细胞。

[0387] HSCT可用于需要干细胞移植物的疾病和病症的治疗。例如，可使用干细胞来治疗正常血细胞产生和成熟的失效或机能障碍、造血恶性疾病、自体免疫病、肝病或免疫缺陷(因例如照射、化疗或病原体感染而导致)。

[0388] 可在施用至受试者之前对所述干细胞进行离体扩增或分化。

[0389] 可使用同种异体造血干细胞移植来治疗以下病症中的一种或多种：急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、再生障碍性贫血、纯红细胞发育不全、阵发性夜间血红蛋白尿、范科尼贫血、重型地中海贫血、镰状细胞性贫血、重度综合性免疫缺陷(SCID)、威斯科特-奥尔德里奇综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、先天性代谢缺陷(例如，黏多糖贮积症、戈谢病、异染性脑白质营养不良和肾上腺脑白质营养不良)。

[0390] 试剂盒

[0391] 此外，本公开还包括包含以下中的一种或多种的试剂盒：

[0392] (i)本公开的CD83结合蛋白或编码该CD83结合蛋白的表达构建体；

[0393] (ii)本公开的细胞；或

[0394] (iii)本公开的药物组合物。

[0395] 在用于检测CD83的试剂盒的情况下，所述试剂盒还可包检测用具，例如连接至本公开的CD83结合蛋白的检测用具。

[0396] 在用于治疗性/预防性用途的试剂盒的情况下，所述试剂盒还可包含药学可接受载体。

[0397] 本公开的试剂盒任选与用于根据任何例子的本文描述的方法的说明书包装在一起。

[0398] 本公开包括以下非限制性实施例。实施例

[0399] 实施例1.材料与方法

[0400] 表达载体设计

[0401] 使用可公开获取的人恒定区重链(IgG1和IgG4亚型)和κ轻链序列来组装mAbXpress载体。合成所需要DNA，并由Geneart AG(Germany) 针对哺乳动物表达来进行密码子优化。然后，将这些盒置于包含用于在哺乳动物细胞中表达、选择和扩增的哺乳动物表达载体中(Aeyte Biotech， Australia)。将单一的SacI位点引入表达载体中以利于线性化以及对可变结构域的In FusionTM(ClonTech)克隆。

[0402] 针对CD83的噬菌体展示淘选以及不依赖于连接的对scFv的In FusionTM克隆

[0403] 将人CD83的细胞外结构域表达于CHO细胞中，并通过IMAC纯化。然后使用该制备物来分离来自公共人scFv噬菌体展示文库(Sheets等， Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A 95(11)：6157-62，1998)的结合剂。分离到一些独特的针对重组GD83的结合剂，并且选择克隆3C12用于克隆和表达。使用针对每条链的5′和3′框架区的引物，从噬菌粒载体PCR扩增重链和轻链二者的可变区。每条引物上包含了与目的载体的上游和下游碱基对应的额外的15bp，使得能够进行不依赖于连接的In FusionTM克隆 (Clontech)。用于重链的示例性引物是：3C12_VhFor5′- CAGGTGTCCACTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAG-3′(SEQ ID NO：50)和 3C12_VhRev 5′-GCGGAGGACACGGTGAGCGTGGTCCCTTGGCCC-3′(SEQ ID NO： 51)，以及用于轻链的示例性引物是：3C12_VkFor 5′- CCGGCGTGCACTCCGAGATCGTGATGACCCAG-3′(SEQ ID NO：52)和 3C12_VkRev 5′-GCCACGGTCCGCTTGAGTTCCAGCTTGGTCCC-3′(SEQ ID NO：53)。下划线标示的区域表示scFv特异性序列，其随着克隆而不同。通过使用In FusionTM系统(Clontech)根据制造商的说明书将未经纯化的PCR产物插入mAbXpress IgG1重链和κ轻链载体中。按下文所述来进行转染和抗体纯化。

[0404] 哺乳动物细胞表达

[0405] 为了进行抗体表达，使用制备于水中的Polyethylenimine(PEI)-Max (Polysciences Inc)对携带重链和轻链序列的mAbXpress质粒进行共转染。以3.5:1的PEI:
DNA比率来制备转染复合物。使用0.75:0.25的细胞: 转染复合物v/v比率来进行混悬适应的CHO的瞬时转染，也就是说，用 250μL OptiPro SFM介质(Invitrogen)中的1.6μg DNA和
5.6μg PEI转染每750μL CD-CHO介质中的细胞(1.5×106细胞·mL-1)。将该复合物于室温不间断地孵育15分钟，然后添加至细胞混悬物中。转染后4小时，用0.1mg·L-1的CD-CHO和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)使总体积加倍从而稀释细胞，然后将培养物转移至32℃和7.5％CO2的湿润的孵育器中，振荡(160rpm至250rpm，根据容器以及振荡器甩出比率而定)7 至14天。通常以小规模(2mL)、中规模(30mL)或大规模(400mL) 来进行表达研究。通过离心去除细胞碎屑，并用蛋白-A色谱来纯化所分泌的抗体。

[0406] 免疫球蛋白和Ig融合蛋白的蛋白A纯化

[0407] 用20倍柱体积(CV)的PBS泵送洗涤1mL蛋白A HiTrap柱(GE Healthcare)。以1mL每分钟的流量来施加包含人IgG1或CD83-Fc融合蛋白的上清液，范围介于20mL至1.2L的体积。用20至50CV的PBS 洗涤柱子，然后施加10CV的蛋白A洗脱缓冲剂，将1mL级分洗脱至 40μL中和缓冲剂中，以将pH恢复至7.0。

[0408] mAbXpress中表达的抗体的分析型尺寸排阻色谱(SEC)

[0409] 对于SEC，将TSK-GEL G300SWxl 30cm×7.8mm柱(Tosoh Bioscience)用于Agilent 1200系列LC上，流动相为100mM pH 6.7的磷酸盐，200mM NaCl，通过0.22μm的过滤器过滤。
流量为0.8mL·min-1。使用凝胶过滤标准(Bio-Rad)进行平衡。使用该系统的瞬时转染实验得到的一般产率为20mg.L-1至60mg.L-1。

[0410] CD83蛋白质印迹

[0411] 为了评估抗CD83 mAb是否识别线性或构象表位，制备了用于 SDS-PAGE的重组hCD83ECD-His蛋白。将包含5μg hCD83ECD-His的未变性的样品(即，没有通过在巯基乙醇中煮沸以变性)直接上载至孔，而变性的样品包含2.5％的β-巯基乙醇，并在95℃下加热10分钟，然后进行上载。通过在200伏下运行50分钟来在12％的NuPAGE凝胶 (Invitrogen)上分离蛋白质，然后使用Transblot System(BioRad)转移至硝化纤维膜，在100伏下保持45分钟。施加Odyssey封闭缓冲剂(Li-Cor Biosciences)，保持1小时，然后添加一抗。一抗由5μg·mL-1的3C12 IgG 或1:2,000稀释度的抗人CD83试剂HB15e-PE构成，每个都制备于具有 0.5％吐温-20(PBST)的PBS中，保持1小时。在用PBST洗涤两次后，以1:10,000的稀释度施加红外IRD800抗人或小鼠Fc抗体(Li-Cor)，保持45分钟，然后洗涤，并在Odyssey Infrared Imaging System(Li-Cor) 上显示。

[0412] 细胞膜CD83的定量

[0413] 使用标准QIFIKIT(Dako)方案来估计展示于来自人PBMC的细胞系和血液DC的细胞表面CD83分子的数目(Serke S等，Cytometry 33(2): 179-87,1998)。在细胞系和转染的细胞的情况下，使用20μg·mL-1未缀合的抗CD83 mAb HB15a(Immunotech)于4℃下保持45分钟，以及1:50 稀释的试剂盒提供的抗小鼠IgG-FITC或抗小鼠IgG-PE(Chemicon)来染色0.5x106个细胞。为了定量活化的DC上的CD83水平，将1×106 PBMC培养过夜以上调CD83-1
(Zhou等，Immunol.154(8):3821-35,1995)。然后，用20μg·mL 的HB15a染色细胞，接着如上文所述进行检测。为了封闭任何残余的未结合的抗小鼠FITC，添加50μL 10％的小鼠血清，并在4℃下孵育20分钟。添加由缀合至PE的CD3抗体、CD14抗体、 CD19抗体、CD20抗体和CD56抗体组成的并且根据制造商的建议添加的谱系混合物，以及HLA-DR-apc-Cy7和150μg.mL-1生物素化的CMRF-44，然后用1:50稀释度的链霉亲和素-Pacific Blue进行检测。如下文所述，每个步骤之间用2mL MACS缓冲剂洗涤细胞，并在1000×g 下离心2分钟。将活化的人DC作为谱系-HLA-DR+CMRF-44+HB15a+门控。如QIFIKIT提供的方案概括的，制作标准曲线来估计CD83的表面密度。

[0414] 流式细胞术

[0415] 在由PBS pH7.2中的0.5％牛血清白蛋白(BSA；Invitrogen)以及2mM EDTA构成的冷的磁活化的细胞分选(MACS)缓冲剂中或者在包含处于 PBS中的0.5％FCS、0.05％叠氮化钠(Ajax Finechem)的荧光活化的细胞分选(FACS)缓冲液中，分析用于流式细胞分析的细胞。对洗涤的细胞进行计数，并且使2×105至2×106个细胞分布于5mL聚苯乙烯圆底管(BD Biosciences)。所有步骤都涉及在DiaCent-12Benchtop离心机 (DiaMed)中在1000×g下离心细胞沉淀2分钟。除非另有说明，否则在50μL最终体积中于冰上用荧光一抗或二抗缀合物染色细胞30至60 分钟。用3mL FACS或MACS缓冲剂洗涤细胞并沉淀。对于多步骤染色方法，重复该步骤。在染色完成3小时内分析细胞，或者通过施加200μL 1％的多聚甲醛(PFA)将细胞固定30分钟，然后洗涤并重悬于200μL FACS缓冲剂中。在其中通过7-AAD染色来评估死细胞的情况下，在进行分析之前将细胞放在冰上保持最多2小时。使用FACS Calibur 4-色流式细胞仪使用CellQuest软件获取数据，或者使用LSRII流式细胞仪系统分析细胞使用6.1版的FACSDiva软件(所有这些都来自BD Biosciences) 来分析细胞。在8.8.6版的FlowJo或FCS Express 3软件(DeNovo Software)上进行数据分析。

[0416] mAb与R-藻红蛋白(RPE)的化学缀合

[0417] 使用Lynx Rapid RPE Antibody Conjugation(AbDSerotec)根据制造商的说明书将纯化的3C12或人IgG1同种型对照mAb、PBS中的赫赛汀(60μg)共价偶联至100μg RPE。在用于流式细胞实验前，将抗体滴定成0.5μg·mL-1至50μg·mL-1，将5μg·mL-1确定为用于对KM-H2细胞上的CD83进行染色的最优工作浓度。

[0418] 去岩藻糖基化IgG的制备

[0419] 通过在添加转染混合物后约4至6小时将2μg·mL-1的几夫碱 (GlycoFineChem,New Zealand)添加至根据上文概括的标准方案转染的 CHO细胞，由此得到未岩藻糖基化的抗体。在标准培养6至7天后收集培养物，并如上文所述使用蛋白-A亲和色谱来进行纯化。为了验证抗体相关的寡糖的含量，使用固定角度离心机中的Ultra-4Centrifugal Filter Device(Amicon)根据制造商的说明书将纯化的蛋白质浓缩至2mg.mL-1。用50mM碳酸氢铵中的0.25％2-巯基乙醇、0.25％SDS于100℃还原50 μL样品20分钟。将Triton-X-100添加至0.5％以SDS复合，然后添加1U N-糖苷酶F(Roche)。将样品在变频微波中消化4分钟，然后用
0.5％三氟乙酸(TFA)稀释和酸化，并通过石墨化的碳固相提取(SPE)色谱来纯化。冻干纯化的样品，重悬于50mM NaCl中，并在Bruker Ultraflex 中正反射模式上的超-2,5-二羟基苯甲酸(sDHB；Sigma)MALDI-MS基质中进行分析。然后进行通过质谱仪的去岩藻糖基化IgG验证。

[0420] 用于亲和力成熟的VL改组文库的构建

[0421] 使用试剂盒提供的方案用2.5U高保真度Pfu聚合酶(Stratagene) 以及具有限制性位点(下划线标示)和额外的与载体重叠以允许缺口修复克隆(Orr-Weaver和Szostack,1983；Gietz和Schiestl 1991)的5'序列的引物从pHEN1噬菌粒载体扩增3C12 scFv的重链(VH)DNA (Hoogenboom等，Nucleic Acids Res.19(15):4133-7,1991)：

[0422] 3C12VH5’5’- GACTATGCAGCTAGCGGTGCCATGGCAGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3’ (SEQ ID NO：54)

[0423] Mod3C12VH3’5’- GTTGAGCCTCCGGACTTAAGGTCGACTGAGGACACGGTGAGCGTGGTCC-3’ (SEQ ID NO：55)

[0424] 终浓度0.5μM。使用体内同源重组，基于具有如下改造的以前描述的方法(Zhou等，J.Mol.Biol.404(1)：88-99，2010)，来构建3C12-VL改组文库。简略而言，10μg凝胶纯化的(GeneClean Turbo，Qbiogene)3C12 VH片段DNA与50μg NcoI-SalI消化的包含约107人VL基因序列的文库的 pYD4载体一起用于EBY100酵母菌细胞(Antibody Epitope Mapping using Yeast Display(Garcia-Rodriguez C，ZhouY，Marks JD编，2010)，Springer) 的标准醋酸锂转化。将转化的酵母菌文库培养于500mL如别处定义(Antibody Epitope Mapping using Yeast Display(Garcia-Rodriguez C， Zhou Y，Marks JD编，2010)，Springer)的酵母菌基本培养基选择性生长酪蛋白氨基酸培养基(SD-CAA)中。除非另有说明，否则培养物条件为处于30℃下并且250rpm振荡。通过将连续稀释的转化的酵母菌涂布于 SD-CAA平板8
上来估计文库的大小。在转化后48小时，将表示最大文库多样性(即，10)的十倍过量的样品在选择性生长半乳糖酪蛋白氨基酸培养基(SG-CAA)中于18℃下诱导48小时。

[0425] 使用FACS通过酵母菌展示来进行VL改组文库的分选

[0426] 使展示的3C12 VL改组文库经历三轮细胞分选。每轮涉及用可溶的 hCD83ECD-His于4℃下孵育1小时。对于第一轮至第三轮，用于在多轮选择中与展示的抗体克隆结合的抗原浓度分别为，稀释于FACS缓冲剂中的20nM、2.5nM和0.5nM的hCD83ECD-His。第三也就是最后一轮分选还并入了在用hCD83ECD-His抗原染色后于FACS缓冲剂中的过夜洗涤步骤以选择具有更慢解离速率的克隆。在每个选择步骤中使用分别由1∶500稀释度的抗小鼠IgG1 Fc特异性-FITC或抗兔Fc特异性-FITC(二者皆来自Jackson Immunoresearch)捕获的抗CD83抗体(100μg·mL-1小鼠单克隆抗体mB4或1μg·mL-1多克隆抗体RA83)来检测抗原结合。在每轮期间使用抗SV5-Alexa 647评估scFv在酵母菌表面上的表达。在 FACSAriaII仪器(BD Biosciences)上分析冷FACS缓冲剂中的稀释至l× 107至5×107细胞·mL-1的细胞，如图6A所示。将来自收集门的输出以1 ×104至1×105细胞·mL-1在SD-CAA液体培养基(Antibody Epitope Mapping using Yeast Display(Garcia-Rodriguez C,Zhou Y,Marks JD编， 2010),Springer)中培养48小时，然后用包含半乳糖的SG-CAA液体培养基(Antibody Epitope Mapping using Yeast Display(Garcia-Rodriguez C, Zhou Y,Marks JD编，
2010),Springer)诱导表面展示用于下一轮分选。将第三轮分选克隆的输出涂布于SD-CAA。
将总共90个单个克隆在 SD-CAA中培养过夜，然后在SG-CAA培养基中再诱导18小时。用
0.2nM hCD83ECD-His染色扩增的酵母菌的展示scFv，并与酵母菌展示的野生型 3C12 scFv进行对比。通过该FACS分析，选择在抗原结合强度方面具有明显升高的20个单个的克隆用于测序。DNA测序揭示了四个优势的VL链序列(3C12.B、3C12.C、3C12.D和3C12.E)，如上文所述将其重构为人IgG1κ(mAbXpress载体，ACYTE Biotech)。

[0427] 生成具有变化的CD83表达水平的稳定转染子

[0428] 将全长cDNA(Genbank获取号NM_004233.3)克隆至双顺反子内部核糖体进入位点IRES)-绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pMXIE.2中。使用lipofectamine(Invitrogen)根据制造商的方案在T25烧瓶中使用质粒DNA(10μg)转染汇合的GP+E86逆转录病毒包装细胞。当稳定转染的GP+E86包装细胞达到80％汇合时，以2000cGy来辐照该包装细胞以抑制扩增，并添加5×105细胞·mL-1的BB88混悬细胞系用于共培养，以及2μg·mL-1至4μg·mL-1的海美溴铵(Sigma)作为病毒性感染的增强剂。在37℃、5％CO2下培养48小时后，移除BB88混悬细胞，并使用FACSAriall仪器针对GFP表达来对这些细胞进行分选。进行后续的分选轮次，选择具有增强的GFP/CD83表达的转化子。通过对分选的细胞进行流式细胞染色来验证CD83的表达。通过有限稀释来克隆细胞的单克隆培养物。

[0429] 用CD83 mAb耗尽活化的树突状细胞

[0430] 融化冷冻保藏的PBMC，并在RPMI-10中培养过夜以诱导CD83的上调(Zhou和Tedder,J.Immunol.154(8):3821-35,1995)。在存在6,000 IU·mL-1重组IL-2(Boehringer -1
Mannheim)以活化NK细胞以及5μg·L  3C12.C IgG或人IgG1κ同种型对照的情况下，以2×
106细胞·mL-1将细胞培养于无菌的有帽的5mL FACS管(BD Biosciences)中的1mL最终体积中。将细胞孵育3至4天，然后进行流式细胞染色和分析以评估活化的DC群体。

[0431] 异种SCID小鼠模型GVHD模型

[0432] 所有动物工作都得到了昆士兰大学动物伦理委员会(University of Queensland Animal Ethics Committee)的批准。从Animal Resources Centre (Western Australia)得到五周大的SCID小鼠，并在没有病原体的条件下关一周，然后用于实验工作。以前已经描述了所使用的异种模型 (Wilson等，J.Exp.Med.206(2):387-98,2009)。简略而言，对在第-1 天用325cGy照射处理的小鼠施以asialoGM1抗体(ASGM-1)，这耗尽 NK细胞和其他白细胞，以有助于在第0天进行50×106人PBMC腹膜内注射的移植。在PBMC移植的那天(第0天)还是通过腹膜内注射以图解中指定的剂量对小鼠施用抗体治疗。每天对小鼠进行评分，分值范围介于0.0(健康)至2.0(状况不良)，每种GVHD临床表现0.5的最小增量，移植后保持30天，不知晓治疗组以消除偏见。评分标准为体重损失、体姿、活动性、皮毛纹理、皮肤和眼完整性以及腹泻。通过颈脱位法处死任一标准的评分为2.0或拥有累积评分>5.0的动物。对于存活超过第20天的动物，收集脾、骨髓和腹腔冲刷物，并针对使用抗人和抗小鼠CD45 抗体的流式细胞染色进行评估以确认存在移植的人细胞。在5.01版的 GraphPad Prism中使用对数秩(Mantel-Cox)检验来进行存活曲线比较。

[0433] Fab制备和亲和力分析

[0434] 通过木瓜酶消化使用Pierce Fab MicroFab制备试剂盒根据制造商的说明书来生成Fab片段，除了用MAbSelect SuRE树脂代替试剂盒提供的蛋白A树脂外(Seldon等，J.Biomol.Tech.22:50-2,2011)。将Fab稀释于由10mM Hepes、150mM氯化钠、3mM EDTA和0.005％聚山梨醇酯 20(GE Healthcare)组成的HBS-EP缓冲剂中。使用配备了与100个 hCD83ECD-His蛋白的共振单元(RU)偶联的CM5芯片的BiaCore3000 (GE Healthcare)仪评估稀释的Fab的亲和力。使用BiaE评价软件(GE Healthcare)使用内置的具有物质传递限制的1:1结合模型来估计动力学速率。

[0435] 细胞

[0436] 淋巴瘤细胞系、KM-H2和L428以及包括混悬的中国仓鼠卵巢 (CHO-S)和小鼠细胞系BB88和FDCP1在内的易于转染的细胞系得自 Mater Medical Research Institute储库。人外周血单核细胞(PBMC)得自根据Mater Health Services Human Research Ethics Committee招募的捐献血液或脱落产物的健康志愿者。所有人健康供体样品都进行针对人免疫缺陷病毒、乙型肝炎和丙肝病毒、人T淋巴细胞病毒和梅毒的筛选。

[0437] 细胞培养基和培养溶液

[0438] 将人细胞系和人PBMC培养于添加有1×青霉素-链霉素、2mM GlutaMAX、25mM HEPES和10％胎牛血清(FCS)的Roswell Part Memorial Institute(RPMI)培养基中，使用之前将所述培养基在56℃下热灭活30分钟(RPMI-10，所有组分来自Invitrogen)。将小鼠细胞系BB88 和FDCP1细胞培养于添加有青霉素-链霉素、GlutaMAX、HEPES和10％FCS(DMEM-10)的杜氏改良伊格尔培养基(Invitrogen)中。此外，在 100μg·mL-1的G418遗传霉素选择性抗生素的存在下培养用全长人CD83 转染FDCP1细胞。所有细胞培养于湿润、37℃、5％CO2的孵育器中，并适当传代。

[0439] 来自外周血和脱落产物的PBMC的聚蔗糖制备

[0440] 在从血液产物纯化PBMC中使用密度梯度离心。简略而言，用无菌的室温PBS以1:1稀释400mL外周血样品，而用PBS以1:20稀释浓缩的脱落产物。在无菌的50mL管中，用15mL Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)使35mL稀释的血液产物处于下层，然后用断开制动开关的离心机在600×g下离心20分钟。使用Pasteur移液器收集Ficoll接口处的细胞，并用PBS洗涤3至5次，以去除污染性的血小板。使用血细胞计数器对细胞进行计数，或者将细胞进行培养、冷冻保存或用于功能测定。

[0441] 哺乳动物细胞的冷冻保藏和恢复

[0442] 通过在300×g下离心5分钟并以50×106细胞·mL-1的最终浓度重悬于由10％二甲亚砜(DMSO；Sigma)和90％FCS构成的溶液中，从而制备用于冷冻保藏的PBMC。所有其他细胞都通常重悬于包含8％DMSO、 50％条件培养基和42％新鲜培养基的溶液中。将细胞等分至1mL无菌冷冻管中，置于Cryo 1℃冷冻容器(Nalgene)中，并立即转移至-80℃的临时储存中，在24至48小时内重新安置到液氮储存(-196℃)中。当需要时，在37℃水浴中将细胞融化，并立即稀释于15mL预暖的培养基中。以300×g离心细胞5分钟，并重悬于10mL培养基中，用于后续使用或培养。

[0443] 淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞的生成

[0444] 洗涤新鲜的或融化的PBMC(<2×109细胞)，并重悬于由PBS pH 7.2 中的0.5％牛血清白蛋白(BSA；Invitrogen)以及2mM EDTA构成的冷MACS缓冲剂中。根据制造商的建议添加人CD56微珠，并在配备有LS 柱的VarioMACS Separator上正选择细胞(所有都来自Miltenyi)。为了确认NK细胞的纯度，用CD56荧光抗体缀合物(BD Biosciences)染色阳性级分和阴性级分，并通过流式细胞术来分析。在6000IU·mL-1的人 IL-2(Boehringer Mannheim)的存在下于37℃、5％CO2下培养LAK细胞2至7天。通过在冰上孵育30分钟来收集细胞，然后去除上清液，接着置于冰上的包含2％EDTA的冷PBS中，保持30分钟；在添加前所有收集的细胞洗涤两次，然后重悬于RPMI-10中。

[0445] 铬释放测定

[0446] 为了确定mAb诱导具有LAK效应细胞的ADCC的能力，使用用人 CD83稳定转染的KM-H2细胞系或BB88细胞系作为铬标记的靶标。用 TD缓冲剂中的100μCi 51Cr标记最多1×106细胞·mL-1，在37℃、5％CO2下保持45分钟，每10分钟进行温柔的搅拌。用RPMI-10洗涤细胞两次。以图解中指定的效应子:靶标(E:T)比率将LAK效应细胞和1-5×103 51Cr 标记的靶细-1胞涂布于V底96孔板(Nunc)。按指定来添加抗体处理。对于封闭实验，将15μg·mL 未缀合的抗人CD16克隆3G8或小鼠IgG1κ同种型对照添加至150μL的最终体积。制备包含处于RPMI-10(即，自发释放)或1.67％Triton-X-100(总释放)中的靶细胞的额外的孔。每种条件进行五次重复。将涂布的细胞孵育4小时，然后在300×g下于室温离心5分钟。将来自每个孔的上清液(50μL)与150μL OptiPhase“SuperMix”混合，并用Trilux 1450-MicroBeta闪烁计数器(二者都来自Wallac)测定每分钟的51Cr计数(cpm)。使用以下的标准式来计算特异性细胞裂解：％裂解＝[(受试样品cpm-自发cpm)/(总cpm-自发cpm)*100]。使用5.01版的GraphPad Prism软件对数据和平均值的标准差作图。

[0447] 混合的淋巴细胞反应(MLR)

[0448] 将来自两个人供体的冷冻保藏的PBMC融化，并添加20μg·mL-1的 DNA酶1(Roche)以防止细胞聚集。对于单向MLR，用3000cGy辐照来自一个供体的选择为充当MLR“刺激物”的细胞。将刺激物细胞(1×105细胞)添加至U底96孔板(Nunc)中的相等数量的未辐照“响应”细胞，与抗体一起于180μL最终体积中进行测试，每种条件五次重复。对于双向MLR，来自两个供体的细胞均未进行辐照，并参与同种异体活化。在 37℃、5％CO2下孵育四天后，添加20μL体积中的1μCi滴定的胸腺嘧啶(Perkin Elmer)。将细胞再孵育16小时，然后使用FilterMate Harvester  (PerkinElmer)转移至过滤垫。完全干燥过滤垫，然后施加5mL Betaplate Scint(Wallac)，并用Trilux 1450Microbeta计数器读取。原始数据针对无抗体对照孔来标准化，并报道为最大增殖百分率。

[0449] 实施例2 3C12 mAb的生成和表征

[0450] 通过针对重组的hCD83ECD-His的三轮选择来生物淘选大的人天然 scFv免疫球蛋白基因文库(Sheets等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95(11): 6157-62,1998)从而得到scFv噬菌体克隆。使用结合每个可变区的保守的侧翼框架区并且还包含所需要的载体重叠的引物，通过PCR扩增这些克隆，并使用In FusionTM系统克隆至mAbXpress载体中。将重构的IgG1 mAb表达于CHO细胞中，接着进行蛋白-A基纯化。通过SDS-PAGE和 SEC分析(图1)示出，分子在该瞬时表达系统中良好表达，没有可观察到的降解或聚集。重构的抗体显示出对由人霍奇金淋巴瘤衍生的细胞系KM-H2表达的细胞表面CD83的特异性结合(图2)。

[0451] 将抗CD83scFv重构为特异性地提供ADCC应答的IgG1κ。为了显示所得的抗体是有功能的，在流式细胞术中使用纯化的重组抗CD83抗体(即，3C12 mAb)来展示对CD83+人细胞系和hCD83转染的细胞的结合(图2A)。此外，在铬释放功能测定中，在存在活化的天然杀伤(NK) 效应细胞的情况下，3C12 mAb诱导显著的KM-H2细胞的细胞溶解(图2B)。但是，在用抗CD16mAb 3G8封闭FcγIIIRa(CD16)后，该抗体诱导的裂解消失，这证实在铬释放测定中CD16在3C12作用的体外机制中的必要性。

[0452] 实施例3抗CD83mAb 3C12的表征

[0453] 表征抗人CD83 mAb 3C12以评估结合亲和力和特异性(表4)。3C12 结合CD83+细胞系KM-H2，并抑制MLR中的同种异体T细胞刺激。

[0454] 表4：3C12的结合亲和力和特异性

[0455]

[0456] 在非还原条件下，3C12在蛋白质印迹上检测重组人CD83ECD-HIS，但是当已经通过热和二硫键还原使CD83变性时，3C12结合消失。该观察也适用于市售抗体HB15e(图3A)。因此，3C12和HB15e二者都表现出结合构象表位，构象表位被热和二硫还原破坏。为了确定CD83 mAb 结合是与其他抗CD83试剂竞争性地还是独立性地，将3C12 IgG缀合至 RPE，并与FITC缀合的市售抗体HB15a和HB15e进行竞争性测定，并且用抗体兔Ig来检测RA83多克隆抗体。在同时添加这些抗体后，用3C12 的竞争性封闭是明显的，因为在3C12的存在下观察到HB15e的完全抑制、HB15a的部分抑制以及RA83结合(图3的插入的表)。这说明，3C12 表位与其他抗体的表位由共享或重叠。在所检查的条件下，任何抗CD83 试剂的添加都对3C12结合改变很小，在与RA83的竞争中观察到3C12 信号的最低限度的降低。该发现证实，3C12抗体与其他抗CD83试剂竞争抗原结合，并且3C12表位与来源于传统的抗体生成方法的抗体相似。

[0457] 实施例4 3C12 mAb的体内评价

[0458] 为了评估3C12 mAb体内预防GVHD的能力，将抗体施用至接受了人PBMC的异种移植的SCID小鼠。3C12抗体的给药在以前针对兔多克隆抗体RA83确定的0.125的最优剂量(Wilson等，Med.206(2):387-98, 2009)的三倍以上及以下变化。如针对RA83所观察到的，相对于其同种型对照，施用0.125mg 3C12显著提高异种GVHD模型中的存活(图 4A)。将3C12 IgG的剂量提高至0.375mg导致降低治疗效力，但是该趋势不显著。与得到61％存活的兔多克隆RA83抗体的标准0.125mg剂量相比，相等剂量的3C12 IgG效价更低，保护39％的小鼠免于因GVHD 死亡(图4B)。将RA83的剂量提高1mg导致100％的存活，但是对3C12 抗体的相同提高使该单克隆抗体的效力消失(图4C)。用标准剂量(0.125 mg)的RA83与1mg 3C12 IgG共同治疗动物也无效。这说明，RA83的作用被存在的高剂量3C12所抑制。因为标准剂量和更低剂量的3C12有效但是在体内比RA83效价更低，所以对3C12抗体进行进一步的设计用于提高mAb效价的抗体工程化。

[0459] 实施例5 CD83 mAb的糖工程化

[0460] 为了产生无岩藻糖基化的抗体用于提高ADCC的潜力的目的，在用编码3C12的cDNA转染CHO细胞期间使用强效糖苷酶抑制剂几夫碱。图5证实，如质谱仪所评估的，在转染期间几夫碱的存在有效阻断了将岩藻糖添加至3C12抗体(即，3C12.Kif)。如果没有高甘露聚糖过程，则如所期望的，通过N-糖苷酶F消化从3C12.Kif样品释放的多糖产生对应GlcNAc2Man9的约1905m/z的优势信号。还存在分别对应 GlcNAc2Man8和GlcNAc2Man7的
1742m/z和1580m/z的较小信号。相比之下，野生型3C12产生对应包含岩藻糖碳水化合物的
1485m/z的优势信号。该糖修饰在没有可辨别地改变野生型3C12的分子量、特异性和功能性亲和力的情况下完成(图5B、C)。

[0461] 实施例6通过轻链改组的CD83 mAb亲和力工程化

[0462] 使用通过轻链改组的亲和力成熟来提高抗原-抗体相互作用的强度，作为增强功能的策略。在此，将3C12VH DNA序列克隆至人VL序列的 cDNA文库中，并将所得的约107独特的VH-VL对的文库展示于酵母菌细胞的表面上以允许亲和力驱动的选择。在蛋白水平上，这些配对中的许多对3C12结合CD83抗原的能力有害，因为在第一轮酵母菌分选中，<1％的展示的scFv保持对的抗原结合呈阳性(图6A)。通过如下来选择对重组的CD83抗原具有提高的亲和力的克隆富集酵母菌，展示相对于酵母菌表面上的scFv表达水平强结合hCD83ECD-His的scFv，通过检测各scFv C端表达的SV5标签的荧光强度来确定。通过该方法进行的scFv克隆的选择产生四种相对于野生型scFv具有不同VL序列和增强的结合性质的新3C12 scFv变体(图6B、C)。

[0463] 当使用木瓜酶消化来制备为Fab结合剂时，据估计，如通过Biacore SPR确定的，完整的人IgG1重构的亲和力成熟的3C12 mAb具有相对于野生型(3C12.WT)3至20倍的亲和力提高(表5)。抗体结合的这些巨大提高可归因于更慢的动力学解离速率，克隆显示出对观察到的Koff的8 至15倍的提高。抗体结合速率仍然与3C12野生型(Kon＝9.0×105M-1s-1) 相似，大多数克隆表现出<1.4倍的提高，并且一个克隆(3C12.B)在结合速率方面具有约3倍的降低(Kon＝3.2×105M-1s-1)。在总体亲和力的提高方面，变体3C12.C具有最高的观察到的对CD83的亲和力(KD＝6.1 ×10-9M)，包括最佳(即，最慢)解离速率(Koff＝7.8×10-3s-1)，并对其进行进一步表征。图7A通过图示凸显了3C12.C结合相对于3C12.WT 的提高，因为在Koff和Kon依赖的缔合阶段期间使用降低的VL改组变体的浓度实现了更高的结合信号强度(即，RU)。类似地，在Koff依赖的解离阶段期间，观察到3C12.C Fab的更慢的解离速率。作为完整的IgG 分子，亲和力提高的3C12.C IgG还表现出相对于3C12.WT IgG优异的与 KM-H2细胞的结合(图7B)。

[0464] 表5：野生型3C12(3C12.WT)和VL改组的变体Fab片段的亲和力

[0465]

[0466] 实施例7：糖工程化和亲和力工程化的3C12变体提高体外效力

[0467] 通过ADCC测定并在MLR内评估了糖工程化的3C12.kif和亲和力增强的3C12.C抗体的功能活性的提高。在铬释放测定中，3C12.C和 3C12.Kif二者都产生了>10％升高的最大NK介导ADCC，并且具有 3C12.WT的>25倍效价(图8A)。类似地，在MLR内，作为同种异体刺激刺激的结果的细胞增殖被3C12.C和3C12.Kif IgG以3C12.WT的>5倍升高的效价所抑制(图8B)。对于3C12.C观察到优异的活性，其表现出能比得上多克隆抗体RA83的效价。

[0468] 实施例8：工程化的抗CD83 mAb的体外作用机制

[0469] 为了确定抗CD83 mAb对原代血液DC的作用，在IL-2的存在下，将3C12.C抗体施加至培养的PBMC以活化NK细胞。如通过标志物 CMRF-44和CD83的活化(不是通过FITC缀合的3C12.C，而是通过未缀合的3C12.C和作为二抗的抗人Fc-FITC来检测，以去除因与处理抗体的竞争所致的检测信号强度的任何降低的潜在性；图9)所评估的，在存在3C12.C IgG的条件下，培养的细胞具有降低的活化DC的百分率(58％)，这与无抗体或同种型对照处理的细胞(>80％)相反。此外，在 3C12.C处理后，本来存在于无处理或同种型处理对照中的表达CD83亮的DC群体消失，而仅观察到CD83暗的DC群体。为了确定细胞表面 CD83表达水平是
3C12.C诱导ADCC的能力的贡献因素，使用具有变化的CD83表达水平的稳定转染的BB88细胞。使用间接的免疫荧光流式细胞测定来定量这些细胞和其他表达CD83的细胞系上的CD83分子数，其显示，BB88转染子表达5,400分子每细胞(MPC)至<2,300MPC的CD83 抗原(表6)。
因此，与永生细胞系和原代血液DC(10,000MPC至 50,000MPC)的表达水平相比，转染子具有低得多的CD83水平。BB88 CD83转染的细胞系中的每一个都被工程化的3C12变体特异性裂解，证实仅需要低水平的细胞表面CD83来触发ADCC。此外，由3C12 mAb 变体诱导的裂解的程度对细胞表面上表达的CD83分子数敏感。这在图 10中进行了举例说明，其中抗原密度从<2,300提高至3,600和5,400与5 至25倍升高的特异性裂解相关。

[0470] 表6：CD83抗原密度的QIFIKit定量

[0471]

[0472] *低于QIFf kit标准的极限   TF＝转染的细胞

[0473] **参见关于门控的附件6

[0474] 实施例9亲和力成熟的抗CD83 mAb 3C12.C在异种GVHD模型中是有效的

[0475] 为了评估亲和力增强的3C12.C mAb在体内预防GVHD，以标准 0.125mg剂量将VL改组的3C12变体施用至经处理的用人PBMC移植的 SCID小鼠。与保护45％(5/11)的小鼠的多克隆试剂RA83相比，3C12.C IgG表现出等同的效价，预防54％(6/11)的小鼠中的GVHD，并且具有比27％(4/15)的存活的3C12.WT更高的效价(图11)。与以前的发现  (Wilson等，J.Exp.Med.206(2):387-98.,2009)相比，所有组群的效力都表现出降低，因为RA83和3C12.WT分别提供>60％和40％的存活。在这些实验条件下，仅3C12.C是与同种型对照显著不同的。