由当归、蒺藜制成的治疗白癜风的药物及其制法与用途

摘要

本发明属于中药领域，具体涉及一种治疗白癜风的药物组合物。发明名称为由当归、蒺藜制成的治疗白癜风的药物及其制法与用途。该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：当归 1～3，刺蒺藜1～3，乌骨麻1～3。该药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。该药物组合物可用于制备治疗白癜风的药物。

权利要求

1.一种具有治疗白癜风作用的药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：当归 1～3，刺蒺藜1～3，乌骨麻1～3。

2.如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：当归 1，刺蒺藜2，乌骨麻3。

3.如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：当归 2，刺蒺藜3，乌骨麻2。

4.如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：当归 1，刺蒺藜1，乌骨麻1。

5.如权利要求1～4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成口服制剂。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用如下方法制备：取当归、刺蒺藜、乌骨麻，混合，加入5～10倍量的水煎煮2～4次，每次0.5～2小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，装入硬胶囊，即得。

8.如权利要求1～4中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，采用高效液相色谱法对蒺藜酰胺进行含量测定：（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为20～40：60～80的乙腈-

0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；检测波长：190～210nm；柱温：15～25℃；流速：0.5～1.5mL·min-1；进样量：5～20μL；

（2）对照品溶液制备：精密称取干燥至恒重的蒺藜酰胺对照品适量，加甲醇溶解制成对照品溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密称取本品，加甲醇，加热回流，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，采用高效液谱法对蒺藜酰胺进行含量测定：（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；

（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的蒺藜酰胺对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密称取本品10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至

10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。

10.如权利要求1～4中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，采用气相色谱法对异丁香油酚、正丁基苯酞进行含量测定：（1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，0.5～1.5mL·mL-1；氢气，30～50mL·mL-1；空气，300～500mL·min-1；分流比：5～15：1；进样口温度：240～260℃，检测器温度：290～310℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；

（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成溶液，摇匀，作为内标溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密量取本品，置容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取，置容量瓶中，精密加入内标溶液，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

（4）对照品溶液的制备：精密称取异丁香油酚对照品、正丁基苯酞对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含异丁香油酚及正丁基苯酞的对照品储备溶液，备用；

（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入气相色谱仪，进行检测。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，采用气相色谱法对异丁香油酚、正丁基苯酞进行含量测定：（1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；

（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

（4）对照品溶液的制备：精密称取异丁香油酚对照品、正丁基苯酞对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含异丁香油酚0.301mg·mL-1及正丁基苯酞0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；

（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测。

说明书

由当归、蒺藜制成的治疗白癜风的药物及其制法与用途

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，涉及一种由当归、刺蒺藜、乌骨麻组成的具有治疗白癜风作用的药物组合物。

背景技术

[0002] 白癜风是一种常见的后天性限局性或泛发性皮肤色素脱失病。由于皮肤的黑素细胞功能消失引起，但机制还不清楚。全身各部位可发生，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。

[0003] 病因：

[0004] 本病发病原因尚不清楚。近年来研究认为与以下因素有关：

[0005] 1、遗传学说：白癜风可以出现在双胞胎及家族中，说明遗传在白癜风发病中有重要作用。研究认为白癜风具有不完全外显率，基因上有多个致病位点。

[0006] 2、自身免疫学说：白癜风可以合并自身免疫病，如甲状腺疾病、糖尿病、慢性肾上腺机能减退、恶性贫血、风湿性关节炎、恶性黑色素瘤等。血清中还可以检出多种器官的特异性抗体，如抗甲状腺抗体、抗胃壁细胞抗体、抗肾上腺抗体、抗甲状旁腺抗体、抗平滑肌抗体、抗黑素细胞抗体等。

[0007] 3、精神与神经化学学说：精神因素与白癜风的发病密切相关，大多患者在起病或皮损发展阶段有精神创伤、过度紧张、情绪低落或沮丧。白斑处神经末梢有退行性变，也支持神经化学学说。

[0008] 4、黑素细胞自身破坏学说：白癜风患者体内可以产生抗体和T淋巴细胞，说明免疫反应可能导致黑素细胞被破坏。而细胞本身合成的毒性黑素前身物及某些导致皮肤脱色的化学物质对黑素细胞也可能有选择性的破坏作用。

[0009] 5、微量元素缺乏学说：白癜风患者血液及皮肤中铜或铜蓝蛋白水平降低，导致酪氨酸酶活性降低，因而影响黑素的代谢。

[0010] 6.其他因素：外伤、日光曝晒及一些光感性药物亦可诱发白癜风。

[0011] 临床表现：

[0012] 本病的发表与性别无明显差异，各年龄组均可发病，但以青少年好发。皮损为色素脱失斑，常为乳白色，也可为浅粉色，表面光滑无皮疹。白斑境界清楚，边缘色素较正常皮肤增加，白斑内毛发正常或变白。病变好发于受阳光照射及磨擦损伤部位，病损多对称分布。白斑还常按神经节段分布而呈带状排列。

[0013] 本病多无自觉症状，少数患者在发病前或同时有患处局部瘙痒感。白癜风常伴其他自身免疫性疾病，如糖尿病、甲状腺疾病、肾上腺功能不全、硬皮病、异位性皮炎、斑秃等。具体分型如下：

[0014] 1、局限型：（1）局灶型一处或多处白斑局限在一个区域，但不呈节段分布；（2）单侧型（节段型）一处或多处白斑呈节段分布，在中线处突然消失；（3）黏膜型仅累及黏膜。

[0015] 2、散在型：（1）寻常型广泛且散在分布的白斑；（2）面部肢端型分布于面部和四肢；（3）混合型节段型、面部肢端型和/或寻常型混合分布。

[0016] 3、泛发型：全部或几乎全部色素脱失。90%以上的白癜风是散在型，剩余的白癜风中局限型比泛发型更多。

[0017] 据病损处色素脱失情况又可将该病分为完全型与不完全型两种。前者对二羟苯丙胺酸（DOPA）反应阴性，黑素细胞消失，治疗反应差。后者对DOPA反应阳性，黑素细胞未消失仅为数目减少，治愈几率大。

[0018] 治疗：

[0019] 1、药物治疗：

[0020] （1）补骨脂素及其衍生物如甲氧沙林口服后照射紫外线。

[0021] （2）大剂量维生素如维生素B族、维生素C、维生素P长期服用。

[0022] （3）有用含铜的药物等治疗如0.5%硫酸铜溶液口服。

[0023] （4）免疫调节剂左旋咪唑口服，冻干卡介苗（BCG）肌注、口服牛胎盘等。

[0024] （5）皮肤刺激剂局部涂擦使皮肤发生炎症反应，促使色素增生，常用者有30%补骨脂酊、氮芥酒精，苯酚（纯石炭酸），25%～50%三氯醋酸，斑蝥酊等。此法只适用于小片皮损，涂后皮损处可出现大疱。

[0025] （6）皮质类固醇激素各种皮质类固醇激素如丙酸倍氯美松软膏、卤米松霜剂、去炎松尿素软膏等局部封包治疗。

[0026] 2、手术治疗：皮损稳定无进展的患者可行自体表皮移植手术。

[0027] 3、脱色疗法：适用于皮损面积大，超过体表面积一半以上者，可用3%～20%氢醌单苯甲醚霜外搽。

[0028] 4、物理疗法：采用窄波紫外线、长波紫外线或308nm准分子激光治疗。

[0029] 中医药是治疗白癜风的重要方法之一，与西药相比具有毒性作用小、可长期服、疗效稳定等特点。研究人员根据白癜风的病因病机理论以及临床用药经验，研制了治疗寻常型白癜风的本发明中药组合物，用于治疗寻常型白癜风，取得了较为满意的治疗效果，且几乎无药物不良反应。

发明内容

[0030] 本发明的目的是提供一种治疗白癜风的药物组合物。

[0031] 本发明的另一目的是提供药物组合物的制备方法。

[0032] 本发明的还提供该药物组合物在制备治疗白癜风以及手足癣药物中的应用。

[0033] 本发明的目的是通过以下方式实现的：

[0034] 一种治疗白癜风的药物组合物，是由以下重量份的原料制成的：当归 1～3，刺蒺藜1～3，乌骨麻1～3。

[0035] 所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：当归 1，刺蒺藜2，乌骨麻3。

[0036] 所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：当归 2，刺蒺藜3，乌骨麻2。

[0037] 所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：当归 1，刺蒺藜1，乌骨麻1。

[0038] 所述药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成口服制剂。

[0039] 所述药物组合物制备成的口服制剂为片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。

[0040] 所述药物组合物优选采用如下方法制备：取当归、刺蒺藜、乌骨麻，混合，加入5～10倍量的水煎煮2～4次，每次0.5～2小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，装入硬胶囊，即得。

[0041] 所述的药物组合物，可采用高效液相色谱法对蒺藜酰胺进行含量测定：

[0042] （1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为20～40：60～80的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；检测波长：190～210nm；柱温：15～25℃；流速：0.5～1.5mL·min-1；进样量：5～20μL；

[0043] （2）对照品溶液制备：精密称取干燥至恒重的蒺藜酰胺对照品适量，加甲醇溶解制成对照品溶液；

[0044] （3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物组合物，加甲醇，加热回流，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

[0045] （4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。

[0046] 其中，优选采用高效液谱法对蒺藜酰胺进行含量测定：

[0047] （1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；

[0048] （2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的蒺藜酰胺对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；

[0049] （3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物组合物10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次
20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

[0050] （4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。

[0051] 所述的药物组合物，采用气相色谱法对异丁香油酚、正丁基苯酞进行含量测定：

[0052] （1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，0.5～1.5mL·mL-1；氢气，30～50mL·mL-1；空气，300～500mL·min-1；分流比：5～15：1；进样口温度：240～260℃，检测器温度：290～310℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；

[0053] （2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成溶液，摇匀，作为内标溶液；

[0054] （3）供试品溶液的制备：精密量取本品，置容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取，置容量瓶中，精密加入内标溶液，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

[0055] （4）对照品溶液的制备：精密称取异丁香油酚对照品、正丁基苯酞对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含异丁香油酚及正丁基苯酞的对照品储备溶液，备用；

[0056] （5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入气相色谱仪，进行检测。

[0057] 其中，采用气相色谱法对异丁香油酚、正丁基苯酞进行含量测定，优选步骤如下：

[0058] （1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；

[0059] （2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；

[0060] （3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

[0061] （4）对照品溶液的制备：精密称取异丁香油酚对照品、正丁基苯酞对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含异丁香油酚0.301mg·mL-1及正丁基苯酞0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；

[0062] （5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测。

[0063] 所述药物组合物可用于制备治疗白癜风的药物。

[0064] 所述药物组合物还可用于制备治疗手足癣的药物。

[0065] 本发明所述的药物组合物中各药味的基原如下：

[0066] 当归为伞形科当归属植物当归的根。

[0067] 刺蒺藜为蒺藜科蒺藜属植物蒺藜和大花蒺藜的果实。

[0068] 乌骨麻为荨麻科楼梯草属植物庐山楼梯草的根茎及全草。

[0069] 通过如下实验研究验证本发明的技术效果：

[0070] 实验一：本发明药物治疗白癜风的实验研究

[0071] 1 实验材料

[0072] 1.1 动物

[0073] 昆明种清洁级豚鼠（黑色或黑花色），体质量（250±20）g，雌雄兼有（烟台大学实验动物中心提供）；实验室温度：（25±1）℃，相对湿度 70%。

[0074] 1.2 药物

[0075] （1）本发明药物甲：取干燥的当归 333g、刺蒺藜333g、乌骨麻333g，加5000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，干燥，加入蒸馏水中，制成1.0g生药/mL浓度的溶液。

[0076] （2）本发明药物乙：取干燥的当归 167g、刺蒺藜334g、乌骨麻501g，加5000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，干燥，加入蒸馏水中，制成1.0g生药/mL浓度的溶液。

[0077] （3）本发明药物丙：取干燥的当归 286g、刺蒺藜429g、乌骨麻286g，加5000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，干燥，加入蒸馏水中，制成1.0g生药/mL浓度的溶液。

[0078] （4）对比药物A（当归与刺蒺藜组合物）：取干燥的当归 500g、刺蒺藜500g，加5000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，加入蒸馏水中，制成1.0g生药/mL浓度的溶液。

[0079] （5）对比药物B（刺蒺藜与乌骨麻组合物）：取干燥的刺蒺藜500g、乌骨麻500g，加5000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，加入蒸馏水中，制成1.0g生药/mL浓度的溶液。

[0080] （6）对比药物C（当归与乌骨麻组合物）：取干燥的当归500g、乌骨麻500g，加5000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，加入蒸馏水中，制成1.0g生药/mL浓度的溶液。

[0081] （7）阳性对照药物：白癜风胶囊，规格 0.45g/粒，白癜风胶囊，天津宏仁堂药业有限公司，国药准字Z12020225

[0082] 1.3 试剂

[0083] 对苯二酚（氢醌，天津市天新精细化工开发中心）；胆碱酯酶、单胺氧化酶、丙二醛试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

[0084] 1.4 仪器

[0085] YDA-IU 型血液流变仪（北京宏润达科技发展有限公司）。

[0086] 1.5 方法

[0087] 取豚鼠180只，雌雄各半，用电动剃毛刀剃取背部毛面积 4cm×4cm，随机分成9组，每组20 只（雌雄各半），即正常对照组、模型对照组、白癜风胶囊组、本发明药物甲组、本发明药物乙组、本发明药物丙组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组。

[0088] 其中正常对照组在脱毛区涂纯化水 0.05ml，bid，作空白对照；其余各组均在脱毛区涂0.5%的氢醌0.05ml，bid，连续 60d，按照文献方法（张兰兰，闫明，刘晓东，等.两种化学脱色剂对两种动物模型拟白癜风作用比较.医药导报，2009.28(6):690～692）制备实验性白癜风豚鼠模型。在此期间，各组豚鼠每3天脱毛一次。白癜风胶囊组、本发明药物甲组、本发明药物乙组、本发明药物丙组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组给药剂量均为相当于临床人推荐剂量的5倍。各给药组豚鼠分别于造模第11天起开始灌胃给药，每天给药1次，容积为2ml/100g，正常对照组和模型对照组豚鼠分别灌胃等容量的纯化水，所有豚鼠均连续灌胃50d。

[0089] 1.5.1 肉眼观察

[0090] 治疗结束后，肉眼观察治疗豚鼠实验性白癜风的疗效，疗效判断标准：以豚鼠脱毛区中心3cm2为一观察单位，优为受试区（3cm2）色素基本恢复正常；良为受试区出现色素面积＞50%；中为受试区出现色素面积＜50%；差为受试区皮肤呈苍白或白斑状。总有效率以优加良计。

[0091] 1.5.2 黑色素染色

[0092] 治疗结束后，取各组豚鼠脱毛区中央（1cm×1cm）皮肤，用中性甲醛固定，石蜡包埋、切片、lillie 法进行黑色素染色，观察皮肤黑色素的分布情况，并在高倍镜下随意观察基底细胞和棘细胞颗粒的细胞300个，计算其中有黑素颗粒的细胞个数。表皮黑色素分布等级：“－”示表皮基底细胞及棘层无黑色素；“±” 示表皮基底细胞及棘层偶见黑色素；“+”示表皮基底细胞及棘层 1/3～1/2 有黑色素；“+ +”示表皮基底细胞及棘层1/2以上有黑色素；“+ + +”示表皮基底细胞及棘层均有黑色素。

[0093] 1.5.3 生化测定

[0094] 各组豚鼠于末次给药后1h，以20%乌拉坦腹部注射麻醉，于腹部主动脉取血，加入抗凝管中，离心得血浆，用于胆碱酯酶、单胺氧化酶、丙二醛指标的测定，另取血作血液流变学各项指标的测定。

[0095] 2 结果

[0096] 2.1 皮肤反应

[0097] 肉眼观察模型对照组豚鼠表皮颜色均明显苍白，正常对照组与模型对照组比较差异有极显著性（## P＜0.01），肉眼观察各用药组豚鼠皮肤呈棕黑色，接近正常对照组，并出现少量色素沉着，本发明药物各组与模型对照组比较差异有极显著性（## P＜0.01），白癜风胶囊组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组与模型对照组比较，差异有显著性（* P＜0.05），由此可见，本发明药物的疗效优于白癜风胶囊，并且优于对比药物A、对比药物B、对比药物C，说明本发明药物中各药味之间的组合产生了协同增效作用。见表1-1。

[0098] 表1-1治疗白癜风豚鼠模型的疗效观察（3cm2）

[0099]

[0100] 注：与模型对照组比较 * P＜0.05，## P＜0.01

[0101] 2.2 组织学观察

[0102] 光镜检查可见各用药组棘层明显增厚，角质层增生明显，黑色素被染成暗绿色至黑色，模型对照组基底层和棘层的黑色明显缺失，本发明药物各组的黑色素基本恢复至正常水平，与模型对照组比较，差异有极显著性（## P＜0.01）；白癜风胶囊组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组的黑色素趋近至正常水平，与模型对照组比较，差异有显著性（* P＜0.05），由此可见，本发明药物的疗效优于白癜风胶囊，并且优于对比药物A、对比药物B、对比药物C，说明本发明药物中各药味之间的组合产生了协同增效作用。结果见表 1-2。

[0103] 表1-2 对白癜风模型豚鼠皮肤黑色素影响（ ±s）

[0104]

[0105] 注：与模型对照组比较 * P＜0.05，## P＜0.01

[0106] 2.3 对胆碱酯酶、单胺氧化酶、丙二醛指标的影响

[0107] 取各组豚鼠血浆适量，分别按胆碱酯酶、单胺氧化酶、丙二醛试剂盒要求进行操作，测定血浆中胆碱酯酶和单胺氧化酶的活力以及丙二醛含量。结果模型对照组豚鼠血浆胆碱酯酶和单胺氧化酶活力以及丙二醛含量明显增加，本发明药物各组的豚鼠血浆中胆碱酯酶和单胺氧化酶活力以及丙二醛的含量均明显降低，与模型对照组比较，差异有极显著性（## P＜0.01）；白癜风胶囊组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组的豚鼠血浆中胆碱酯酶和单胺氧化酶活力以及丙二醛的含量均有一定降低，与模型对照组比较，差异有显著性（* P＜0.05），由此可见，本发明药物的疗效优于白癜风胶囊，并且优于对比药物A、对比药物B、对比药物C，说明本发明药物中各药味之间的组合产生了协同增效作用。结果见表1-3。

[0108] 表1-3对模型豚鼠血浆中胆碱酯酶、单胺氧化酶、丙二醛指标的影响（ ±s）[0109]

[0110] 注：与模型对照组比较 * P＜0.05，## P＜0.01

[0111] 2.4 对模型豚鼠血液流变学各项指标的影响

[0112] 取各组豚鼠血适量，肝素抗凝后于血液流变仪测定血液流变学各项指标，结果，模型对照组豚鼠全血粘度和血浆粘度明显升高，本发明药物组能明显降低模型豚鼠的全血粘度和血浆粘度，与模型对照组比较，差异有极显著性（## P＜0.01）；白癜风胶囊组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组能部分降低模型豚鼠的全血粘度和血浆粘度，与模型对照组比较，差异有显著性（* P＜0.05），由此可见，本发明药物的疗效优于白癜风胶囊，并且优于对比药物A、对比药物B、对比药物C，说明本发明药物中各药味之间的组合产生了协同增效作用。结果见表 1-4。

[0113] 表 1-4对模型豚鼠血液流变学指标的影响（ ±s）

[0114]

[0115] 注：与模型对照组比较 * P＜0.05，## P＜0.01

[0116] 3 讨论与结论

[0117] 白癜风是一种原发性的局限性或泛发性的皮肤色素脱色征，临床表现为皮肤黑色素减少。根据黑色素易受强氧化剂破坏的特点，参照文献（张兰兰，闫明，刘晓东，等.两种化学脱色剂对两种动物模型拟白癜风作用比较.医药导报，2009.28(6):690～692）制备白癜风动物模型的方法，选用性质更为稳定的氢醌造模后，模型对照组豚鼠大多数黑色素细胞已被破坏，肉眼可见豚鼠皮肤苍白，有的出现白斑，甚至原有棕色毛处长出白毛，镜下可见皮肤切片棘层和毛囊内黑色素减少，有的毛囊内上、中部黑色素完全脱失，而下部有少量黑色素细胞，同时血液中胆碱酯酶、单胺氧化酶和丙二醛值以及全血粘度和血浆粘度明显升高，符合中医白癜风病因病机理论中“瘀血阻滞“之说，与临床白癜风患者病理状况也类似，说明本实验模型是成功的，该模型在一定程度上能够反映白癜风的主要病理特征。

[0118] 黑色素是皮肤颜色的主要决定物质，它由人体皮肤的黑色素细胞产生，白癜风皮损处大多数黑色素细胞已被破坏，仅毛囊周围和皮损边缘有残存的黑色素细胞，这些残存的黑色素细胞也有不同程度的异常改变。近年来不少学者在探讨胆碱酯酶、单胺氧化酶与黑色素合成的关系，提出交感神经兴奋可导致单胺氧化酶活性增加，进而出现过氧化氢聚集导致黑色素合成减少。同时当胆碱酯酶活力增加时，乙酰胆碱代谢增加，在突触间隙内含量减少，致使付交感神经功能减弱而使交感功能增强，也导致黑色素合成减少。

[0119] 白癜风患者皮损部位与自由基的氧化损伤有密切关系，当受到外来不良刺激时即可产生大量的自由基，使生物膜脂质双层中的不饱和脂肪酸过氧化，而形成脂质过氧化产物，从而使膜结构和功能发生障碍，引起白癜风发生。丙二醛是主要的脂质过氧化物，白癜风患者血浆中丙二醛含量明显升高，因此测定丙二醛含量能较好地反映体内氧自由基水平和脂质过氧化程度。曾有人报告白癜风患者全血中丙二醛浓度升高，患者的抗氧化能力明显降低。

[0120] 本发明药物对白癜风动物模型的治疗效果表明，该药能使胆碱酯酶和单胺氧化酶活力降低，使丙二醛的含量减少，血液流变学改善，全血粘度和血浆粘度降低，表皮基底细胞和棘细胞黑色素增加，且黑素颗粒细胞数也明显增加，说明本发明药物能明显改善白癜风的病变，疗效优于白癜风胶囊，并且还疗效优于对比药物A、对比药物B、对比药物C，说明本发明药物组方精良，缺一不可，组方中各药味之间的组合产生了协同增效作用。本发明药物为一纯中药制剂，显示在长期的治疗过程中具有较好的安全性，符合白癜风的基本治疗原则，有利于患者的短期利益和长远利益。

[0121] 实验二：本发明药物组合物高效液相色谱法质量检测方法研究

[0122] 1仪器与试药

[0123] 1.1仪器

[0124] 高效液相色谱仪（Agilent110高效液相色谱仪及工作站，G1311Aquat泵，G1314紫外检测器）。

[0125] 1.2试药

[0126] 蒺藜酰胺对照品（中国药品生物制品检定研究院）；本发明中药组合物：参照本发明说明书具体实施方式中的实施例1制备；甲醇（色谱醇，上海生化工助剂厂）；其他试剂为分析纯。

[0127] 2方法与结果

[0128] 2.1处方

[0129] 当归 333g，刺蒺藜333g，乌骨麻333g。

[0130] 2.2制备

[0131] 取干燥的当归 333g、刺蒺藜333g、乌骨麻333g，加5000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，干燥，即得。

[0132] 2.3 蒺藜酰胺的含量测定

[0133] 2.3.1 HPLC色谱条件

[0134] 采用HypersilDs（4.0mm×125mm，5μm）色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；在该色谱条件下，对照品及样品色谱峰良好，无刺藜酰阴性对照对测定无干扰。

[0135] 2.3.2对照品溶液的制备

[0136] 精密称取80℃干燥至恒重的蒺藜酰胺对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液。

[0137] 2.3.3供试品溶液与阴性对照液的制备

[0138] 精密称取本发明药物组合物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得；另按处方比例制备不含当归的阴性对照品，同法制成阴性对照液。

[0139] 2.3.4标准曲线的绘制

[0140] 精密称取80℃干燥至恒重的蒺藜酰胺对照品适量，用甲醇制成10.4，20.8，41.6，83.2，166.4μgmL-1系列浓度的溶液，分别精密量取上述5种浓度溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行测定。

[0141] 以峰面积比值与浓度进行线性回归，得回归方程为：A=21.2764C—0.1396，r=0.9999。表明蒺藜酰胺在10.1～166.6μgmL-1浓度范围内呈良好的线性关系。

[0142] 2.3.5稳定性试验

[0143] 精密吸取供试品溶液10μL，分别于0，1，2，4，8h进样，并计算蒺藜酰胺含量。结果8h内RSD为0.46%（n=5）。表明样品溶液在8h内稳定。

[0144] 2.3.6重复性试验

[0145] 按供试品溶液制备方法平行处理样品5份，依法测定蒺藜酰胺含量并计算。结果测得蒺藜酰胺平均含量为0.11mg·g-1，RSD为1.2%。

[0146] 2.3.7精密度实验

[0147] 精密吸取蒺藜酰胺对照品溶液，重复进样5次，依法测定峰面积。结果RSD为0.25%（n=5）。表明精密度较好。

[0148] 2.3.8回收率实验

[0149] 精密称取已知蒺藜酰胺含量的同一批号的样品6份，按高、中、低浓度分别精密加入适量的蒺藜酰胺对照品溶液，按样品测定项下操作，依法测定，计算回收率。结果平均回收率为100.2%，RSD为0.44%（n=5）。

[0150] 2.3.9样品含量测定

[0151] 分别量取对照品溶液和供试品溶液适量，用微孔滤膜滤过，各进样10μL，按上述色谱条件测定3批样品，平行测定5次。按外标法以峰面积计算供试品溶液蒺藜酰胺的含量。本品含蒺藜酰胺应为标示含量的95%～105%，以每1g本品含蒺藜酰胺计，不得少于0.11mg。3批样品含量分别为100.2%（RSD=1.1%），101.6%（RSD=1.2%），99.5%（RSD=1.2%）。

[0152] 实验三：本发明药物组合物气相色谱法同步测定异丁香油酚、正丁基苯酞的含量[0153] 1仪器与试药

[0154] Agilent7890N气相色谱仪：FID检测器，A.01.12.1色谱工作站；SGH－300高纯氢气发生器（北京东方精华科技苑科技有限公司）；色谱柱弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；梅特勒－托利多十万分之一电子分析天平；异丁香油酚对照品（含量99.9%，中国食品药品检定研究院）；正丁基苯酞对照品（含量99.9%，中国食品药品检定研究院）；本发明药物组合物（参照本发明说明书具体实施方式中的实施例1制备），试剂：环己酮，无水乙醇均为色谱纯。

[0155] 2色谱条件

[0156] 色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；载气：N2，1.0mL·mL-1；-1 -1
氢气，40mL·mL ；空气，400mL·min ；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；
程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法。

[0157] 3试验方法与结果

[0158] 3.1内标溶液的制备

[0159] 取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1g含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液。

[0160] 3.2供试品溶液的制备

[0161] 精密量取本品1.0g，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀。

[0162] 3.3对照品储备溶液的制备

[0163] 精密称取异丁香油酚对照品、正丁基苯酞对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含异丁香油酚0.300mg·mL-1及正丁基苯酞0.900mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；

[0164] 3.4阴性对照溶液的制备

[0165] 取按处方中未加异丁香油酚与正丁基苯酞的空白溶液，按“3.2”项下制备方法，制成阴性对照溶液。

[0166] 3.5线性关系的考察

[0167] 分别精密移取0.2、0.5、1.0、1.5、3.5mL对照品储备液于10mL容量瓶中，加内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，分别取1μL进样，记录色谱图，以异丁香油酚、正丁基苯酞与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），浓度（C）为横坐标（X），分别绘制标准曲线，得回归方程分别为：Y（异丁香油酚）=1.1145X－0.0015，R2=0.9999，异丁香油酚浓度在0.141～2.552mg·mL-1范围内，线性关系良好；Y（正丁基苯酞）=1.1346X+0.0036，2 -1
R=0.9999，正丁基苯酞浓度在0.196～3.465mg·mL 范围内，线性关系良好。

[0168] 3.6精密度试验

[0169] 取异丁香油酚浓度为0.230mg·mL-1和正丁基苯酞浓度为0.290mg·mL-1的对照品溶液，重复进样6次，记录峰面积，分别计算2种成分与内标的峰面积比值（A/A内标），异丁香油酚、正丁基苯酞的RSD分别为0.24%和1.4%（n=6）。

[0170] 3.7重复性试验

[0171] 取同一批样品，按样品测定项下的方法重复测定6次，结果异丁香油酚、正丁基苯酞的RSD分别为0.34%、1.5%（n=6）。

[0172] 3.8稳定性试验

[0173] 取同一批样品溶液，分别在室温下放置0、2、4、6、8、12h后测定，结果按异丁香油酚、正丁基苯酞的RSD分别为0.37%、1.6%，说明样品溶液在12h内测定，结果稳定。

[0174] 3.9加样回收率试验

[0175] 取已知含量的样品溶液9份，并加入适当的低、中、高对照品溶液，按样品测定法测定异丁香油酚、正丁基苯酞含量，分别计算回收率，结果见表3-1。

[0176] 表3-1 回收率测定结果（n=9，%）

[0177]

[0178] 结果表明，本方法的回收率较好，异丁香油酚的回收率分别在99.4%～100.2%，正丁基苯酞的回收率在98.1%～100.7%之间，相对标准偏差分别为0.28%与0.86%，本测定方法能满足本发明药物组合物中异丁香油酚与正丁基苯酞的含量测定。

[0179] 3.10定量限与检测限

[0180] 采用“信噪比法”来确定本研究的定量限和检测限，取线性标准溶液适量，采用加-1无水乙醇逐步稀释法进行稀释，当进样浓度为6.27、9.90μg·mL 时，取1μL进样，连续进样3次，得到异丁香油酚、内标、正丁基苯酞信噪比平均值分别接近10.0，可以以此浓度为定量限；继续稀释进样，当进样浓度为1.044、1.65μg·mL-1，连续进样3次，得到异丁香油酚、内标、正丁基苯酞信噪比平均值接近3.0，可以以此浓度为检测限。

[0181] 3.11耐用性试验

[0182] 经不同色谱柱考察和溶液稳定性考察，以及柱温，进样口温度和检测器温度考察，表明本方法耐用性良好，适用于本发明药物组合物中两组分的含量测定。

[0183] 3.11.1色谱柱的影响

[0184] 选用3根不同商品规格的色谱柱，测定同一批样品的含量，计算含量值的RSD%分别为1.3、1.7、1.6。结果表明，样品用不同的PEG色谱柱测定含量，异丁香油酚、正丁基苯酞与内标均可有效分离，说明方法耐用性良好。

[0185] 3.11.2柱温的影响

[0186] 柱温对分离的影响主要为影响主峰的出峰时间，温度越高，主峰出峰时间越短，在第一阶段为80℃时，异丁香油酚主峰异丁香油酚与杂质峰能保证基线分离，第二阶段120℃时正丁基苯酞主峰与杂质峰能保证基线分离，且各温度下含量的RSD小于2.0%。

[0187] 3.11.3进样口温度的影响

[0188] 进样口温度高于柱温时，异丁香油酚与杂质峰能够保证基线分离，正丁基苯酞与杂质分离良好，且各温度下含量的RSD小于2.0%。

[0189] 3.11.4检测器温度的影响

[0190] 检测器温度高于进样口温度时，异丁香油酚与杂质峰能够保证基线分离，正丁基苯酞与杂质分离良好，且各温度下含量的RSD小于2.0%。

[0191] 3.12样品含量测定结果

[0192] 经过方法学验证，本含量测定方法操作简便、准确度高、重现性好，能更有效地控制产品质量。因此应用该方法对10批样品，按照前述方法采用内标法进行含量测定，结果见表3-2。

[0193] 表3-2 样品含量测定结果

[0194]

[0195] 4讨论

[0196] 4.1系统适应性试验

[0197] 在本试验气相色谱系统下，分别吸取样品测定用混合对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各1μL，记录色谱图。2种组分与内标物均能够较好地分离，阴性无干扰。该系统适应性结果见表3-3。

[0198] 表3-3系统适应性试验

[0199]

[0200] 4.2内标物的选择

[0201] 曾试用过环己酮、萘、联苯、水杨酸甲酯等，因样品挥发性成分多，结果以环己酮的保留时间及分离效果最合适。

[0202] 4.3柱温的选择

[0203] 异丁香油酚、环己酮和正丁基苯酞的沸点相差比较大，柱温低时，正丁基苯酞的保留时间过长，柱温高时，异丁香油酚与杂质不能有效分离，经采用两段程序升温方式能满足两种成分的同时分析。

[0204] 4.4本品的含量限度

[0205] 由10批次产品测定结果，暂定本品的含量限度为：本品每1g含异丁香油酚不得少于0.200mg，含正丁基苯酞不得少于0.200mg。

[0206] 本方法对2种成分同时进行分离与检测，方法快速、灵敏，分离度好、专属性好，能有效地控制药品质量。

[0207] 具体实施方式：

[0208] 实施例1：

[0209] 处方：当归 333g，刺蒺藜333g，乌骨麻333g。

[0210] 制备：取干燥的当归 333g、刺蒺藜333g、乌骨麻333g，加5000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，干燥，加入适量糊精，混匀，制成颗粒，装入胶囊，制成硬胶囊剂1000粒。

[0211] 含量测定：

[0212] 采用高效液谱法对蒺藜酰胺进行含量测定：

[0213] （1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；

[0214] （2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的蒺藜酰胺对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；

[0215] （3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物组合物10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次
20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

[0216] （4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测；

[0217] （5）测定结果：以每1g本品含蒺藜酰胺计，为0.15mg。

[0218] 采用气相色谱法对异丁香油酚、正丁基苯酞进行含量测定：

[0219] （1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；

[0220] （2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；

[0221] （3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

[0222] （4）对照品溶液的制备：精密称取异丁香油酚对照品、正丁基苯酞对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含异丁香油酚0.301mg·mL-1及正丁基苯酞0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；

[0223] （5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测；

[0224] （6）测定结果：本品每1g含异丁香油酚为0.221mg，含正丁基苯酞为0.224mg。

[0225] 实施例2：

[0226] 处方：当归166g，刺蒺藜332g，乌骨麻498g。

[0227] 制法：取干燥的当归 166g、刺蒺藜332g、乌骨麻498g，加8000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，加入适量淀粉、硬脂酸镁，混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包衣，制成1000片。

[0228] 含量测定：

[0229] 采用高效液谱法对蒺藜酰胺进行含量测定：

[0230] （1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；

[0231] （2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的蒺藜酰胺对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；

[0232] （3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物组合物10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次
20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

[0233] （4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测；

[0234] （5）测定结果：以每1g本品含蒺藜酰胺计，为0.15mg。

[0235] 采用气相色谱法对异丁香油酚、正丁基苯酞进行含量测定：

[0236] （1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；

[0237] （2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；

[0238] （3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

[0239] （4）对照品溶液的制备：精密称取异丁香油酚对照品、正丁基苯酞对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含异丁香油酚0.301mg·mL-1及正丁基苯酞0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；

[0240] （5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测；

[0241] （6）测定结果：本品每1g含异丁香油酚为0.225mg，含正丁基苯酞为0.228mg。

[0242] 实施例3：

[0243] 处方：当归 286g，刺蒺藜429g，乌骨麻286g。

[0244] 制法：取干燥的当归 286g、刺蒺藜429g、乌骨麻286g，加7000mL水煎煮，煎煮3次，每次0.5小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，加入适量淀粉，泛制成丸，干燥，制成5000丸。

[0245] 含量测定：

[0246] 采用高效液谱法对蒺藜酰胺进行含量测定：

[0247] （1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；

[0248] （2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的蒺藜酰胺对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；

[0249] （3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物组合物10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次
20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

[0250] （4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测；

[0251] （5）测定结果：以每1g本品含蒺藜酰胺计，为0.14mg。

[0252] 采用气相色谱法对异丁香油酚、正丁基苯酞进行含量测定：

[0253] （1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；

[0254] （2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；

[0255] （3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

[0256] （4）对照品溶液的制备：精密称取异丁香油酚对照品、正丁基苯酞对照品适量，加-1 -1无水乙醇溶解并稀释制成含异丁香油酚0.301mg·mL 及正丁基苯酞0.901mg·mL 的对照品储备溶液，备用；

[0257] （5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测；

[0258] （6）测定结果：本品每1g含异丁香油酚为0.229mg，含正丁基苯酞为0.227mg。

[0259] 实施例4：

[0260] 处方：当归 333g，刺蒺藜333g，乌骨麻333g。

[0261] 制法：取干燥的当归 333g、刺蒺藜333g、乌骨麻333g，加10000mL水煎煮，煎煮4次，每次2小时，提取液合并，静置，滤过，滤液加水调整总量至5000mL，灌装，每支10mL，灭菌，制成口服液500支。

[0262] 实施例5：

[0263] 处方：当归 600g，刺蒺藜200g，乌骨麻200g。

[0264] 制法：取干燥的当归 600g、刺蒺藜200g、乌骨麻200g，加5000mL水煎煮，煎煮2次，每次1小时，提取液合并，过滤，滤液浓缩，干燥，加入适量糊精，混匀，制成颗粒，装入胶囊，制成硬胶囊剂1000粒。