用于甘薯块根淀粉含量性状标记的SSR标记引物及其应用和方法

摘要

本发明公开了用于甘薯块根淀粉含量性状标记的SSR标记引物及其应用和方法，其中甘薯块根淀粉含量性状相关的SSR标记引物有32对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.64所示，该引物在淀粉含量不同的甘薯品种可检测出不同的特异条带，因此能够用于甘薯块根淀粉含量性状标记，在甘薯遗传育种中具有重要意义。

权利要求

1.用于甘薯块根淀粉含量性状标记的SSR标记引物在区分甘薯块根淀粉含量中的应用，其特征在于：所述SSR标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.64所示。

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2.利用SSR标记引物标记甘薯块根淀粉含量性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取甘薯待检甘薯基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的甘薯基因组DNA为模板，如SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.64所示序列~为引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳的多态性条带标记甘薯块根的淀粉含量性状。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增条件为94℃预变性5min；95℃变性45s，退火温度55℃进行45s，72℃条件下延伸1min，循环35次；然后72℃条件下延伸

10min，低温4℃保存。

说明书

用于甘薯块根淀粉含量性状标记的SSR标记引物及其应用和

方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及用于甘薯块根淀粉含量性状预测的SSR标记。

背景技术

[0002] 传统的育种主要依赖于植株的表现型选择，但环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。而分子标记辅助选择(MAS)不受环境和育种世代的影响，可以进行程序化早代选择和预测。所以利用分子标记尤其基因的功能标记进行关键基因型的辅助选择，可显著提高目标性状的准确性，大大缩短农作物育种年限和提高育种效率。

[0003] 甘薯是重要的粮食、饲料和工业加工原料。目前中国甘薯种植面积约670万hm2，年产量约1亿吨居世界首位。作为加工淀粉和燃料乙醇的重要原料，甘薯块根淀粉含量与产量对甘薯食用、加工和产业化都具有极其重要的影响。选育具有特殊块根淀粉含量，尤其是高块根淀粉含量的甘薯品种也成为甘薯育种的重要目标。由于甘薯是六倍体作物，缺乏基因组信息，目前对其块根淀粉含量性状的调控机理仍不清楚，其分子育种进展缓慢。且其开花结实率低、杂交不亲和的特性也阻碍了其传统育种的快速发展。选育具有高淀粉含量的甘薯品种往往需要经过大规模种植杂交株系并进行筛选，或经过多年的田间试验。因此，寻求一种与其块根淀粉含量相关的功能标记，将其应用于甘薯育种早代选择，可以大大缩小甘薯优秀品种的选育范围，缩短育种周期，将为利用分子手段选育特殊块根淀粉甘薯新品种提供支撑。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供用于甘薯块根淀粉含量性状标记的SSR标记引物；本发明的目的之二在于提供用于甘薯块根淀粉含量性状标记的SSR标记引物在区分甘薯块根淀粉含量中的应用；本发明的目的之三在于提供利用所述的SSR标记引物标记甘薯块根淀粉含量性状的方法。

[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 1、用于甘薯块根淀粉含量性状标记的SSR标记引物，所述SSR标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.64所示。

[0007] 2、所述用于甘薯块根淀粉含量性状标记的SSR标记引物在区分甘薯块根淀粉含量中的应用。

[0008] 3、利用所述的SSR标记引物标记甘薯块根淀粉含量性状的方法，包括如下步骤：

[0009] (1)提取甘薯待检甘薯基因组DNA；

[0010] (2)以步骤(1)提取的甘薯基因组DNA为模板，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.64所示序列为引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳的多态性条带标记甘薯块根的淀粉含量性状。

[0011] 优选的，所述PCR扩增条件为94℃预变性5min；95℃变性45s，退火温度55℃进行45s，72℃条件下延伸1min，循环35次；然后72℃条件下延伸10min，低温4℃保存。

[0012] 本发明的有益效果在于：本发明提供了用于甘薯块根淀粉含量性状标记的SSR标记引物及其应用和方法，SSR标记引物从214对SSR引物中筛选获得32对在不同淀粉含量的甘薯块茎中表现出多态性的引物，因此能够用于甘薯块根淀粉含量性状标记，在甘薯遗传育种中具有重要意义。

附图说明

[0013] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

[0014] 图1为STRUCTURE群体结构分析的K值确定。

[0015] 图2为STRUCTURE群体结构分析。

[0016] 图3为利用特异性引物扩增出的6个不同品种的甘薯的电泳结果图；每个图中最左泳道为分子标记物，其后6条扩增条带分别为：1为D01414的扩增条带，2为渝薯33的扩增条带，3为徐薯22的扩增条带，4为S1-5的扩增条带，5为潮薯1号的扩增条带，6为商丘52-7的扩增条带。6个甘薯品种在2011-2013年间田间测定平均块根淀粉含量(范围)分别为：26.161±0.673％(>25％)，23.623±2.539％(20-25％)，17.961±1.211％(15-20％)，11.989±1.091％(10-15％)，10.201±0.085(约为10％)和5.587±1.568％(<10％)。

具体实施方式

[0017] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0018] 一、关联群体构建及块根淀粉含量性状测定

[0019] 根据多年考察性状和遗传多样性特点选取239个甘薯品种作为甘薯种质资源材料，构建关联群体。每个甘薯品种各选取5个单株，在收获期每个品种随机选取5个块根去皮切丁，每个块根称取50g左右，重复3次，记录数据，分别于80℃烘干至恒重。采用常规烘干法，计算每个甘薯品种的烘干率＝干重/鲜重×100％，淀粉率(％)＝0.86945×烘干率－6.34587％。结果表明239份甘薯种质资源材料的块根淀粉含量在4.476％与31.899％之间，在各个淀粉含量范围内的株系分布较为平均，可用于块根淀粉含量性状的关联分析。

[0020] 二、关联群体SSR多态性分析

[0021] 先从NCBI和甘薯转录组数据库获得RNA-seq，mRNA及EST序列；利用生物信息学工具对序列进行处理、从头组装和拼接成unigene，并对unigene进行SSR位点搜索获取EST-SSR；然后设计EST-SSR引物；扩增甘薯基因组DNA对EST-SSR进行验证，利用验证的EST-SSR分子标记在薯蓣种质中进行遗传多样性分析的应用。

[0022] EST-SSR进行验证方法如下：取作为种质资源的239个甘薯品种的幼嫩叶片，采用CTAB法提取其基因组DNA。用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度与浓度。采用NanoDrop 2000微量紫外-可见分光光度计(Thermo Fisher scientific，USA)测定DNA的质量、纯度和浓度。

[0023] 以提取的基因组DNA为模板，EST-SSR引物进行PCR扩增，PCR反应的体系为10μL，内含浓度为15ng/μL模板DNA 1μL，dNTP为0.36μL，Taq酶0.5U，0.20mM dNTPs，正、反向引物各1μM，10×PCR buffer(含MgSO420mM)1.2μL。反应程序为：先以94℃预变性5min，然后95℃变性45s，退火温度55℃进行45s，72℃条件下延伸1min，循环35次；然后72℃条件下延伸10min，低温4℃保存，将扩增获得的产物用质量分数10％的非变性聚丙烯酰氨凝胶垂直电泳进行检测，银染检测多态性，拍照记录条带。

[0024] (1)扩增多态型数据统计

[0025] 用数字1和0分别表示供试材料电泳条带的有或无，样品缺失记为2，用Excel进行统计，并根据相应软件格式进行转换，将条带转化成关联分析所需的数据格式。统计结果显示对239份甘薯种质资源材料进行扩增，共扩增出1278个多态性条带，其中每个引物扩增获得1～16条多态性扩增条带，平均每对引物获得5.972条多态性谱带，多态性信息含量(PIC值)平均为0.2571。

[0026] (2)群体结构分析

[0027] 利用STRUCTURE2.3.4软件，按照数学模型划分物种的类群，并计算材料对应的Q值(即第i个材料其基因组变异源于第K个群体的概率)，作为协方差消除关联分析的假阳性，以保证物种群体结构的分析结果准确有效。本发明运用STRCTURE软件对239份甘薯种质资源材料进行群体结构分析。设定K值为1-20，每个K值运行5次，根据似然值最大的原则，选择合适的K值，最后使用CLUMMPP软件合并选定K值得到2个Run的结果生成最终分析用的Q值矩阵。将分子标记数据运用STRUCTURE软件进行群体结构检验，将群体划分为1到20(K＝1，2，3，...，20)的亚群进行5次重复的测试，确认类群数目。将亚群测试过程中运行得出的对数似然值LnP(D)的平均数，绘制成与亚群数K相关的折线图，如图1所示。由图1可知，随着亚群数目K的增加，后验概率对数随之增大，不能确定K的取值。所以采用Evanno等(2005)提出的方法，采用ΔK的方法确定K值，求得ΔK，绘制ΔK与K的相关关系图，来确定最佳亚群数，如图2所示。因此，本发明将K＝2时的Q矩阵作为协方差进行关联分析，以对比消除群体结构引起的假阳性关联。

[0028] 三、SSR分子标记与甘薯块根淀粉含量性状的关联分析

[0029] 运用TASSEL软件的GLM和MLM程序，以得到的K矩阵和群体Q值矩阵作为协方差，采用4种模型，在显著性水平P＜0.01下，将分子数据和数量性状数据进行的逻辑回归率检验。这4种模型分别是(1)不采用K矩阵和群体Q值矩阵作为协方差的GLM模型；(2)采用群体Q值矩阵作为协方差的GLM模型；(3)Q+K+MLM混合线性模型；(4)K矩阵作为协变量的MLM模型。采用为更加准确的消除群体结构带来的假阳性关联，本发明使用K＝2时的Q值矩阵作为协方差，并随机删除一列，运行之后得到各位点的显著性水平P及其对表型变异的解释率R2。运用TASSEL软件的MLM程序，以得到的K矩阵和群体Q值矩阵作为协方差，寻找与性状相关联的分子标记。

[0030] 当选用不同的模型进行关联分析时，在显著性水平P＜0.01下，将分子数据分别跟标记数据和甘薯块根淀粉含量测定数据进行逻辑回归率检验，输出各位点的显著性水平P及其对表型变异的解释率R2，筛选获得32个标记与甘薯块根淀粉含量性状显著相关，32个标记的SSR引物如表1所示，32个标记与甘薯块根淀粉含量性状显著性水平如表2所示。

[0031] 表1、32对SSR引物

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[0034] 表2、32对SSR引物与甘薯块根淀粉含量显著相关的分子标记显著性水平和表型变异解释率

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[0038] 四、分子标记的鉴定及使用实例

[0039] 选取6个具体有不同块根淀粉含量范围的甘薯材料，以其基因组DNA为模板，采用上述32个SSR标记引物进行扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。结果显示，32个标记在6份材料中均获得多态性条带，且获得可区分不同块根淀粉含量的特异条带，其扩增条带多态性可用于区分具有不同块根淀粉含量的甘薯种质资源材料，表明筛选获得32个标记可以作为甘薯块根淀粉含量性状预测的SSR标记。

[0040] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。