一种具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖及其制备方法

摘要

本发明属食用菌资源开发领域，具体涉及一种点柄粘盖牛肝菌中具有体内抗氧化活性的多糖及其制备方法，按如下步骤依次实施：（1）子实体经清洗，晾干，粉碎；（2）去离子水煮提，合并提取液；（3）提取液浓缩加入乙醇，收集沉淀，干燥得粗多糖；（4）粗多糖加入Sevag试剂，去除蛋白层和氯仿层，水层重复操作，得多糖SGP；（5）多糖SGP进行洗脱分级，收集洗脱液，洗脱液经透析除盐，冷冻干燥得多糖 SGPII；（6）多糖 SGPII 进行洗脱分级，收集得到的组分经透析除盐，冷冻干燥即得多糖 SGPII‑b。本发明操作简单，目标产物具有明显体内抗氧化能力，目标产物可降低体内自由基并具抗衰老功能。

权利要求

1.一种具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖，其特征在于，源自点柄粘 盖牛肝菌子实体，呈灰黄色粉末状，分子量为25.2kDa；由鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖及 半乳糖5种单糖组成，按质量份计，其组成比例依次为：1:1.37:5.11:16.15:3.59；

上述具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖的制备方法，按如下步骤依次实施：

（1）点柄粘盖牛肝菌子实体经清洗，晾干，粉碎至40～100目后得提取原料；

（2）向提取原料中加入20～40倍重量去离子水后，80～100℃ 浸提2～4h；离心收集残渣，再重复浸提，合并滤液得到粗提液；离心收集速度为3000～5000转/分；离心20～30分钟；

（3）粗提液经旋转蒸发浓缩后，加入3～5倍体积无水乙醇，边加边缓慢搅拌产生沉淀，2～6℃静置10～20h；离心收集沉淀，沉淀经无水乙醇和乙醚洗涤后得粗多糖CSGP；离心收集速度为10000～15000转/分；离心20～30分钟；

（4）粗多糖CSGP溶于去离子水后加入Sevag试剂充分振荡；离心去除蛋白层和氯仿层；

水层重复操作至不再出现蛋白层为止，所得水溶液经透析和冷冻干燥得到多糖SGP；Sevag试剂由正丁醇和氯仿按体积比1:4～5配制；Sevag试 剂的用量按多糖溶液体积的1:4～6加入；离心收集速度为3500～4500转/分；离心10～25分 钟；

（5）将多糖SGP溶于去离子水中，先后用去离子水、0.5M NaCl和1.5M NaCl溶液采用DEAE-纤维素离子交换柱进行洗脱分级；收集1.5M NaCl的洗脱液；洗脱液经透析除盐，冷冻干燥得多糖SGPII；

（6）将多糖SGPII溶于去离子水中采用琼脂糖凝胶CL-6B进行洗脱分级；收集洗脱流出的第二个组分；收集得到的组分经透析除盐、冷冻干燥即得目的产物具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖。

说明书

一种具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖及其

制备方法

技术领域

[0001] 本发明属食用菌资源开发领域，具体涉及一种具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGPII-b及其制备方法。

背景技术

[0002] 点柄粘盖牛肝菌[Suillus granulatus(L.:Fr.)O.Kuntce] 又名黄花松茸、栗壳牛肝菌，在真菌分类上属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、牛肝菌科、粘盖牛肝菌属。点柄粘盖牛肝菌是一种食药兼用野生食用菌，是东北地区重要的野生食用菌之一。点柄粘盖牛肝菌味道鲜美，兼具有的抗肿瘤、抗氧化、提高人体免疫力等功效。这些功效来源于多种生理活性物质，如多糖、维生素、矿物质等，其中以多糖成分最为重点。

[0003] 生物机体内存在多种自由基，大都以活性氧形式存在。可对机体细胞进行攻击，使机体各系统功能出现紊乱进一步伤害体内组织。目前已有很多疾病被认为是自由基过量引起的。如高脂血症、免疫力低下、类风湿性关节炎以及急性呼吸窘迫综合症等。另一方面也被认为是基是促进机体衰老的主要因子。由于，因此能对自由基起清除作用和具有抗氧化活性的物质越来越受到人们的关注。研究已证实许多食用菌多糖具有抗氧化活性，可对各种自由基具有清除作用，能提高抗氧化酶（SOD）、GSH-Px等的活性，从而表现出抗氧化性能。因此天然抗氧化剂——食用菌多糖的研究和开发在医药保健和食品行业具有着宽阔的应用前景。

发明内容

[0004] 本发明旨在克服现有技术不足，提供一种操作简单，收率高，具有明显体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖及其制备方法。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明是这样实现的。

[0006] 一种具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖，其特征在于，源自点柄粘盖牛肝菌子实体，呈灰黄色粉末状，分子量为25.2kDa；由鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖5种单糖组成，按质量份计，其组成比例依次为：1:1.37:5.11:16.15:3.59。

[0007] 上述具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖的制备方法，可按如下步骤依次实施。

[0008] （1）点柄粘盖牛肝菌子实体经清洗，晾干，粉碎后得提取原料。

[0009] （2）向提取原料中加入去离子水后，浸提；离心收集残渣，再重复浸提，合并滤液得到粗提液。

[0010] （3）粗提液经旋转蒸发浓缩后，加入无水乙醇，搅拌产生沉淀，静置，离心收集沉淀，沉淀经无水乙醇和乙醚洗涤后得粗多糖CSGP。

[0011] （4）粗多糖CSGP溶于去离子水后加入Sevag试剂充分振荡；离心去除蛋白层和氯仿层；水层重复操作至不再出现蛋白层为止，所得水溶液经透析和冷冻干燥得到多糖SGP。

[0012] （5）将多糖SGP溶于去离子水中，先后用去离子水、0.5M NaCl和1.5M NaCl溶液进行洗脱分级；收集1.5M NaCl的洗脱液；洗脱液经透析除盐，冷冻干燥得多糖SGPII。

[0013] （6）将多糖SGPII溶于去离子水中进行洗脱分级；收集洗脱流出的第二个组分；收集得到的组分经透析除盐、冷冻干燥即得目的产物具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGPII-b。

[0014] 作为一种优选方案，本发明所述步骤（2）中，向提取原料中加入20～40倍重量去离子水后，80～100℃浸提2～4h。

[0015] 进一步地，本发明所述步骤（3）中，粗提液经旋转蒸发浓缩后，加入3～5倍体积无水乙醇，边加边缓慢搅拌产生沉淀，2～6℃静置10～20h。

[0016] 进一步地，本发明所述步骤（1）中，点柄粘盖牛肝菌子实体粉碎至40～100目。

[0017] 进一步地，本发明所述步骤（2）中，离心收集速度为3000～5000转/分；离心20～30分钟。

[0018] 进一步地，本发明所述步骤（3）中，离心收集速度为10000～15000转/分；离心20～30分钟。

[0019] 进一步地，本发明所述步骤（4）中，Sevag试剂由正丁醇和氯仿按体积比1:4～5配制； Sevag试剂的用量按多糖溶液体积的1:4～6加入；离心收集速度为3500～4500转/分；离心10～25分钟。

[0020] 进一步地，本发明所述步骤（5）中，可采用DEAE-纤维素离子交换柱洗脱分级。

[0021] 进一步地，本发明所述步骤（6）中，可采用琼脂糖凝胶CL-6B洗脱分级。

[0022] 点柄粘盖牛肝菌子实体多糖的体内抗氧化实验。

[0023] 动物模型的构建的原理是通过一定时间内给动物连续注射D-半乳糖，使细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶作用下，还原成半乳糖醇，后者不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀，功能障碍，代谢紊乱；同时，D-半乳糖在体内氧化时产生大量自由基，超过机体的清除能力，引发脂质过氧化的链式反应，最终机体衰老。

[0024] 60只昆明小鼠（2月龄；体重BW 20±2g）中随机分为6组，每组10只，包括正常组、模型组、阳性对照组和3个多糖实验组。正常组每天按10 mL/kg BW皮下注射生理盐水；模型组、阳性对照组和3个多糖实验组每天均按100 mg/kg BW皮下注射D-半乳糖的生理盐水溶液，注射体积等同于正常组。阳性对照组每天采用胃管饲法给予100 mg/kg BW抗坏血酸，3个多糖实验组每天采用胃管饲法分别给予SGP II-b剂量100，200，和400 mg/kg BW，连续给药40天后，小鼠禁食不禁水12h，眼球取血，4℃，4000r/min离心10分钟，收集血清待测。取血后小鼠颈椎脱臼处死取肝脏匀浆（1g肝脏加9mL生理盐水）4℃，4000r/min离心10分钟，分离上清待测。分别测定血清和肝脏中的超氧化物歧化酶（SOD）活力、过氧化氢酶（CAT）活力、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力以及丙二醛（MDA）含量，上述检测均采用南京建成生物工程研究所生产的相应试剂盒进行检测。实验结果见表1和表2。

[0025] 表1 点柄粘盖牛肝菌子实体多糖对小鼠血清中SOD, CAT, GSH-Px 和 MDA 水平的影响。

[0026]

[0027] 注：与模型组比较：*，p＜0.05；**，p＜0.01。

[0028] 表2 点柄粘盖牛肝菌子实体多糖对小鼠肝脏中SOD, CAT, GSH-Px 和 MDA 水平的影响。

[0029]

[0030] 注：与模型组比较：*，p＜0.05；**，p＜0.01。

[0031] 由表1和表2可知，的模型组小鼠的血液和肝脏中的抗氧化酶（SOD，GSH-Px和CAT）的活性与正常组相比均显著的降低，MDA与正常组相比也明显增加，说明衰老小鼠模型已成功的构建。多糖实验组的检测结果显示点柄粘盖牛杆菌子实体多糖SGPII-b显著地增加了SOD，GSH-Px和CAT活力并显著降低了MDA水平，其影响还表现为浓度依赖型。此外点柄粘盖牛杆菌子实体多糖SGPII-b表现出的影响与阳性对照组（抗坏血酸）相比较有着相似或更好的结果。

附图说明

[0032] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。本发明的保护范围不仅局限于下列内容的表述。

[0033] 图1为点柄粘盖牛肝菌子实体多糖DEAE-纤维素离子交换层析图。

[0034] 图2为点柄粘盖牛肝菌子实体多糖的琼脂糖凝胶CL-6B层析图。

[0035] 图3为点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGPII-b的单糖组成分析图。

[0036] 图4为点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGPII-b的HPLC图。

具体实施方式

[0037] 实施例1。

[0038] 点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGPII-b的制备。

[0039] （1）点柄粘盖牛肝菌子实体经清洗，晾干，粉碎至80目，得提取原料。

[0040] （2）萃取提取原料1000g加入25L去离子水后，90℃浸提3h； 4000转/分离心20分钟收集沉淀，沉淀再重复浸提，合并滤液得到粗提液。

[0041] （3）粗提液经旋转蒸发浓缩至4L后，加入12L无水乙醇，边加边缓慢搅拌产生沉淀，4℃静置12h，12000转/分离心20分钟收集沉淀，沉淀经无水乙醇和乙醚洗涤后得点柄粘盖牛肝菌子实体粗多糖CSGP 55.4g。

[0042] （4）称取粗多糖50克，溶解于1000毫升去离子水中，加入250毫升Sevag 试剂(正丁醇：氯仿＝1：4，v/v)，充分震荡2小时，4000转/分离心20分钟，去除蛋白层和氯仿层。水层重复操作至不再出现蛋白层为止，所得水溶液经透析和冷冻干燥得到点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGP(32.8克)。

[0043] （5）将多糖SGP（5g）溶于100mL去离子水中，采用DEAE-纤维素离子交换柱(2.8×50cm)分级，依次用去离子水、0.5M和1.5M NaCl溶液洗脱，洗脱液流速为10毫升/分钟，每20 毫升洗脱液收集一管，经由苯酚硫酸法检测，1.5M 氯化钠洗脱得到的级分经去离子水透析
24小时后，冷冻干燥得到点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGPII(3.6克)（图1）。

[0044] （6）点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGPII(0.5克)溶于2mL去离子水中，采用琼脂糖凝胶CL-6B柱(2.5×90cm)分离。使用生理盐水进行洗脱，洗脱液流速为0.5毫升/分钟，每10 毫升洗脱液收集一管，经由苯酚硫酸法检测，得到a和b两个级分，b级分经去离子水透析24小时后，冷冻干燥得到点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGP II-b(0.22克)（图2）。

[0045] 1、本发明点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGPII-b的纯度和分子量测定。

[0046] 采用Shodex KS-802和 KS-804 串联柱，示差折光检测器，通过Agilent1100 series高效液相色谱仪，以不同相对分子质量的葡聚糖(P-5、P-10、P-20、P-50、 P-100、 P-200、P-400 和 P-800)作为标准品，做出标准曲线，测定多糖SGPII-b的纯度及相对分子质量，结果如图3所示。图3显示单一对称峰，可判定该多糖为纯品，根据标准曲线计算测得点柄粘盖牛肝菌子实体多糖SGPII-b分子量为25.2kDa。

[0047] 2、本发明点柄粘盖牛肝菌子实体多糖的单糖组成测定。

[0048] 多糖SGPII-b 2mg，1ml的2M三氟乙酸水解90min，旋转蒸发仪蒸干，加入2ml甲醇，蒸干，反复2次。残基加入2ml双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，加入甲醇3ml，反复3次，旋蒸至粉末，110度烘箱烘干，然后加入1ml乙酸酐乙酰化，100℃反应1h,冷却,然后加入3mL甲苯,减压浓缩蒸干,重复4-5次,以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗,加入少量蒸馏水充分震荡后,除去上层水溶液,如此重复4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥,定容至10mL，GC分析。分析结果见图4。

[0049] GC条件：Agilent GC 7890A,Hp-5 (Agilent 19091J-413)色谱柱(30m×0.25mm×320µm)；程序升温条件为：起始温度140°C，以1.5°C/min升温至200°C/min；最后以10°C /min升温至250°C，保持5min；进样口温度为250°C，检测器温度为250°C /min，氢气流量
30mL/min，空气流量400mL/min；载气为N2，流速为1mL/min。

[0050] 单糖组测定结果显示点柄粘盖牛肝菌子实体多糖多糖SGPII-b由鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成，按质量份计，其组成比例依次为：1:1.37:5.11:16.15:3.59。

[0051] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。