DCSTAMP基因及其应用

摘要

本发明提供了一种鸭的DCSTAMP基因及其编码的氨基酸序列，本发明所提供的鸭DCSTAMP基因可用于抑制流感病毒，特别是可以显著抑制AIV病毒的复制，因此可以针对鸭DCSTAMP基因进行深入的功能研究，从而确定其抗AIV病毒的关键蛋白结构域或氨基酸。为利用转基因技术等基因编辑方法，培育出抗AIV等多种类型病毒的转基因农业动物优良品种提供了新的途径。

权利要求

1.鸭DCSTAMP基因在影响H5N1型AIV病毒复制中的非诊断和/或非治疗目的的应用，其特征在于，所述鸭DCSTAMP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述H5N1型AIV流感病毒为毒株GS/65或DK/49。

3.鸭DCSTAMP基因在制备抗H5N1型AIV流感病毒的转基因鸡胚成纤维细胞系DF1中的应用，其特征在于，所述应用为在所述鸡胚成纤维细胞系DF1中转入鸭DCSTAMP基因，所述鸭DCSTAMP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

说明书

DCSTAMP基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地，涉及一种DCSTAMP基因及其应用。

背景技术

[0002] 流感病毒是含有8个RNA基因组片段的负链RNA病毒。高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的烈性传染病。

[0003] 水禽包括家鸭是流感病毒的天然宿主，所有16种HA和9种NA的不同组合的亚型都能在水禽中分离。流感病毒对水禽一直保持着低致病力的特征，水禽感染病毒并不发病，但可以向外界排毒。某些对水禽致病力低的毒株，对鸡或其他宿主则表现为高致病性。然而，随着流感病毒的不断进化，水禽与流感病毒的平衡状态被打破。如2002年首次报道在香港出现致死水禽的H5N1亚型毒株，2005年青海湖大规模爆发H5N1亚型流感病毒致死候鸟事件等。在人群中流行的新毒株出现有多种方式：禽流感病毒或其他流感病毒与人流感病毒发生基因重排产生感染人的流行毒株、禽流感病毒在猪体内适应后产生的流行株、禽流感病毒传播到人产生流行毒株以及人流感病毒老毒株时隔数年后又重新流行，此外，还有人流感病毒本身的抗原漂移等。

[0004] 总之，A型流感病毒的最大特点是宿主广泛，亚型众多，变异形式多样，发病突然，流行性、致病性强，易诱发严重并发症，危害巨大。因此，科学家们在研究流感病毒的变异、进化、流行与分布规律，提高防控流感能力的同时，也致力于鉴定新的抗流感病毒的免疫基因，解析宿主影响流感病毒感染性、致病力以及免疫应答的分子机理研究，以提高宿主的抗病性能及促进防控流感病毒新手段的开发。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种与抵抗流感病毒相关的新基因，以及提供该基因在抗流感病毒中的应用。

[0006] 本发明的发明人在研究中发现水禽包括家鸭是H5N1亚型流感病毒的储存宿主，早期病毒不致死水禽，感染病毒的水禽自身也不表现出明显的临床症状，随着病毒的不断进化，对水禽高致病力的毒株也随之出现。因此发明人通过研究比对感染两种亚型H5N1毒株的北京鸭的差异基因表达寻找抗性或易感相关的基因。从而发现并提供了一种鸭的DCSTAMP基因，所述鸭DCSTAMP基因具有：

[0007] a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

[0008] b)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。

[0009] 本发明还提供了所述的鸭DCSTAMP基因所编码的氨基酸序列。

[0010] 本发明还提供了含有所述鸭DCSTAMP基因的载体。

[0011] 优选的，所述载体为导入鸭DCSTAMP基因CDS序列后获得的PiggyBac-DCSTAMP载体。

[0012] 本发明还提供了含有所述的鸭DCSTAMP基因的转基因细胞。

[0013] 所述转基因细胞可以为禽类细胞或哺乳动物细胞。

[0014] 优选的，所述转基因细胞为鸡胚成纤维永生化细胞系DF1。

[0015] 本发明还提供了所述的鸭DCSTAMP基因在影响流感病毒复制中的应用。

[0016] 可选的，所述流感病毒包括H5N1型AIV病毒，例如可以为低致病力的毒株GS/65(A/goose/Hubei/65/05)和高致病力的毒株DK/49(A/duck/Hubei/49/05)。

[0017] 可选的，所述应用包括通过鸭DCSTAMP基因在细胞中的过表达来抑制AIV病毒在细胞中的复制，以及在敲除DCSTAMP的细胞中AIV病毒的复制显著增加。

[0018] 本发明还提供了一种转基因动物的构建方法，所述方法包括在动物细胞转入本发明所述的鸭DCSTAMP基因。

[0019] 本发明所述鸭DCSTAMP基因可用于制备抗流感病毒的转基因动物，此外，敲除DCSTAMP基因的细胞系可以作为AIV等病毒疫苗生产的工具细胞。

[0020] 本发明所提供的DCSTAMP基因可用于抑制流感病毒，特别是可以显著抑制AIV病毒的复制，因此可以针对鸭DCSTAMP基因进行深入的功能研究，从而确定其抗AIV病毒的关键蛋白结构域或氨基酸。利用转基因技术等基因编辑方法，获得可诱导性高表达DCSTAMP基因的转基因畜禽，培育出抗AIV等多种类型病毒的转基因农业动物优良品种。

附图说明

[0021] 图1为本发明实施例1中利用转录组数据分析得到的鸭DCSTAMP基因mRNA序列。

[0022] 图2为本发明实施例3中所述载体PiggyBac的图谱，其中X gene为DCSTAMP。

[0023] 图3为本发明实施例4、5中瞬时转染DCSTAMP以及阴性对照质粒24h后DF1细胞的镜下观察结果。

[0024] 图4为本发明实施例4、5中瞬时转染DCSTAMP以及阴性对照质粒48h后，收取细胞总蛋白后对DCSTAMP基因的过表达效果的Western blot验证。

[0025] 图5为本发明实施例4、5中在DF1细胞中过表达DCSTAMP基因，抑制实施例6中流感病毒DK/49(左)和GS/65(右)的复制。

[0026] 图6为本发明实施例4、5中DF1细胞感染流感病毒AIV(DK/49)48h后，内源DCSTAMP基因mRNA的表达变化，以GAPDH基因作为内参。

[0027] 图7为本发明实施例4、5中细胞过表达DCSTAMP基因前后，感染流感病毒AIV(DK/49)后，病毒不同形式RNA的相对表达变化，以GAPDH基因作为内参。

具体实施方式

[0028] 下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

[0029] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0030] 若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0031] 实施例1

[0032] 利用分析转录组数据发现新的抗AIV感染的基因DCSTAMP。

[0033] 水禽包括家鸭是H5N1亚型流感病毒的天然宿主，其感染部分H5N1亚型病毒后，不表现出明显的临床症状。随着病毒的不断进化，对水禽高致病力的毒株也随之出现。本研究选取两种H5N1亚型毒株(即高致病性的A/duck/Hubei/49/05(DK/49)及低致病性的A/goose/Hubei/65/05(GS/65)H5N1病毒)，感染4周龄绍兴麻鸭。通过高通量测序的方法，分别构建感染DK/49或GS/65H5N1流感病毒后1天、2天和3天鸭的以及对照组鸭的脾脏、脑和肺组织基因表达图谱，鉴定参与机体抗流感病毒相关的免疫基因，为禽流感的治疗和预防提供新办法。

[0034] 前期用DK/49或GS/65H5N1病毒感染4周龄绍兴麻鸭，分别在感染AIV后1、2和3天后，取脾脏、脑和肺组织样，提取总RNA，建库进行高通量测序，通过生物信息学分析。分析发现：与对照组相比较，无论是在感染DK/49或GS/65H5N1病毒后1、2和3天的脾脏、脑和肺组织中，DCSTAMP的表达量均极显著升高(如图1所示，分别在两株H5N1毒株(A/duck/Hubei/49/05,DK/49，高致病)和(A/goose/Hubei/65/05,GS/65，低致病)，感染4周龄绍兴鸭后的第1、第2和第3天脾脏、肺和脑组织中的表达模式；横坐标代表时间点，纵坐标代表相对表达量。)。

[0035] 实施例2

[0036] 利用分子生物学实验方法获得鸭DCSTAMP基因全长编码区序列

[0037] 参照Ensemble网站上的鸭基因组参考序列，并根据转录组拼接序列，设计鸭DCSTAMP基因全长CDS区克隆引物TF/TR，序列如下：

[0038] TF：5'-ATGCAAGCAC TTGTCTCAAC AGCCC-3'，

[0039] TR：5'-TCCAAAACAC TGCTGACCAT TAGCC-3'。

[0040] 以鸭脾脏组织cDNA为模板，利用NEB公司的Q5高保真聚合酶进行PCR扩增，扩增产物经胶回收后连接到T载体上进行测序。序列比对分析后发现：鸭DCSTAMP基因全长编码区为1431bp(SEQ ID NO.1)，共编码476个氨基酸(SEQ ID NO.2)。

[0041] 本发明人成功克隆得到鸭DCSTAMP基因全长编码区序列。

[0042] 实施例3

[0043] 利用细胞学实验方法在细胞中瞬时过表达DCSTAMP基因

[0044] 1、鸭DCSTAMP基因过表达载体的构建

[0045] 根据鸭DCSTAMP基因编码区序列，设计其真核表达载体引物eTF/eTR，上、下游引物都是分别引入Mlu I和Pme I酶切位点(下划线标注)；此外，上游引物在起始密码子ATG之前引入kozak(粗体标注)序列，在目的基因C末端引入flag标签(粗体标注)。引物序列如下：

[0046] eTF：

[0047] 5'-CGACGCGTGCCACCATGCAAGCACTTGTCTCAACAGCCCAGAATGC-3'，

[0048] eTR：

[0049] 5'-GGGTTTAAACCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCACCACATTGTCATTTACCATTGTC-3'。

[0050] 将扩增得到的DCSTAMP基因的CDS序列(如序列表CDS所示)导入原始载体PiggyBac-X gene(由本发明人所在实验室前期所构建，载体图谱如图2所示)，构建得到PiggyBac-DCSTAMP载体。由于PiggyBac空载体具有CAG强启动子，能够使导入其中的DCSTAMP基因有效地高表达。

[0051] 2、细胞中瞬时过表达DCSTAMP基因

[0052] 将PiggyBac-DCSTAMP质粒和未连接鸭目的基因CDS区序列的PiggyBac-X gene空载体质粒，利用Fugene HD(Promega)分别转染鸡DF1细胞系，同时将只加入转染试剂、未加入任何质粒的处理组也设为阴性对照组(DF1)。转染24h后显微镜下观察细胞状态及转染效率(如图3所示)。

[0053] 3、鸭DCSTAMP基因过表达载体的验证

[0054] 将以上转染有PiggyBac-DCSTAMP和PiggyBac-X gene空载体的细胞，于CO2培养箱中培养48h，提取细胞的总蛋白，利用Anti-flag标签抗体进行Western blot检测。Western blot结果显示，PiggyBac-DCSTAMP-C-Flag载体可以在DF1细胞中有效高表达DCSTAMP蛋白(如图4所示，实验处理组依次为过表达DCSTAMP组(OE)、阴性对照组(Mock)，以GAPDH基因作为内参)。以上转染组细胞(过表达目的基因组、阴性对照NC和DF1组)可以用于下一步的攻毒实验。

[0055] 实施例4利用细胞学实验方法验证鸭DCSTAMP基因抗AIV感染

[0056] 1、鸭DCSTAMP基因抑制流感病毒复制

[0057] 将生长状态良好的转染PiggyBac-DCSTAMP-C-Flag载体(DCSTAMP)、PiggyBac-X gene空载体(NC)和DF1细胞系以2×105个/ml的密度接种于12孔细胞培养板中，待细胞稳定贴壁后进行攻毒。攻毒实验选用毒株为2株H5N1亚型禽流感病毒，即DK/49和GS/65，攻毒剂量为MOI＝0.001，实验设3孔独立重复。分别收取攻毒后12h、24h、36h、48h、60h和72h细胞上清液，用于EID50检测。细胞攻毒实验在哈尔滨兽医研究所P3实验室完成。

[0058] 攻毒结果显示：与阴性对照组(NC)相比，鸭DCSTAMP基因抑制DK/49流感病毒的复制，并在36h达到显著差异(P<0.05)，72h达到极显著差异(P<0.01，图5A)；同时，鸭DCSTAMP有效抑制GS/65流感病毒的复制，在24h和36h达到显著差异(P<0.05)，在48h达到极显著差异(P<0.01，图5B)。其中阴性对照组(NC)与DF1组病毒生长曲线趋势一致，不存在显著性差异。

[0059] 图5中，横坐标表示感染后收取细胞上清液的时间点，纵坐标表示EID50的对数值。

[0060] 2、细胞感染AIV后显著增加DCSTAMP基因的表达

[0061] 本发明利用Real time RT-PCR技术检测DF1细胞在感染AIV(DK/49)病毒48h后DCSTAMP基因mRNA的相对表达量，结果显示：DF1细胞在感染AIV病毒后，显著的增加内源DCSTAMP基因mRNA的表达量(P<0.05，图6)。

[0062] 3、鸭DCSTAMP基因显著抑制AIV病毒各种形式RNA的表达

[0063] 本发明进一步利用Real time RT-PCR技术检测细胞在过表达DCSTAMP基因前后，感染AIV(DK/49)病毒48h后，流感病毒M基因vRNA、cRNA和mRNA的表达变化，结果显示：细胞在感染AIV后，过表达DCSTAMP基因，极显著抑制流感病毒M基因vRNA和cRNA的表达量(P<0.01，图7)，对流感病毒M基因mRNA的表达没有影响。

[0064] 综上所述，本发明人通过比较过表达DCSTAMP基因的DF1细胞和阴性对照(NC)细胞中AIV的病毒含量，从而分析DCSTAMP基因对于AIV病毒在DF1细胞中复制的影响。最终得出结论：鸭DCSTAMP基因能够抑制AIV病毒的复制。

[0065] 本发明所提供的编码DCSTAMP蛋白的基因可用于制备抗AIV等病毒的转基因动物，为畜、禽的广谱抗病育种提供了一种新手段，应用前景十分广阔。

[0066] 本实施例实验操作中包含：

[0067] 1)总RNA的提取及反转录反应

[0068] 组织或细胞总RNA的提取利用Invitrogen公司生产的Trizol试剂，并严格按照产品说明书进行操作；反转录反应采用的是Promega公司的MMLV逆转录酶试剂，并严格按照说明书进行操作。

[0069] 2)基因克隆及载体构建

[0070] 以反转录得到的cDNA为模板，利用特异引物进行PCR扩增。产物经胶回收纯化后连接到pEasy-Blunting simple载体上，挑取单克隆菌落，测序鉴定正确后提取质粒。质粒双酶切后，利用T4连接酶将目的基因连接到相应的载体上。

[0071] 3)细胞培养及转染

[0072] 鸡胚成纤维细胞系(DF1)由本实验室前期所冻存。细胞复苏培养严格无菌操作，加完全培养基(DMEM+10％FBS)进行培养，37℃，5％CO2条件下培养，每两天换一次液。细胞转染参照 HD Transfection Reagent(Promega)说明书操作。

[0073] 4)Western blot

[0074] Western blot严格参照标准实验方法进行，一抗为Abcam公司的Anti-flag标签抗体，二抗为北京中杉金桥的HRP标记的山羊抗鼠抗体；GAPDH内参一抗购自碧云天生物技术研究所。

[0075] 5)H5N1亚型流感病毒攻毒实验

[0076] GS65和DK49攻毒实验在哈尔滨兽医研究所P3实验室完成，病毒生长曲线测定选取12h、24h、36h、48h、60h和72h共计6个时间点，攻毒剂量为MOI＝0.001，病毒滴度测定方法为鸡胚半数感染量测定(EID50)，并根据Reed-Muench法计算EID50值。

[0077] 6)利用real time RT-PCR技术检测宿主因子及流感病毒基因的表达情况[0078] 荧光实时定量PCR仪器为ABI公司生产的ABI 7500，定量试剂为德国Roche的480 SYBR Green I Master，并按照产品说明书操作。利用2-ΔΔCt的方法将原始Ct值转换为相对的基因表达量，以GAPDH作为内参基因。

[0079] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。