本发明提供了基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法。采用适体自组装网络型核酸纳米探针和酶循环放大技术，以达到对靶DNA的痕量检测。其设计原理为：将三叉DNA1和三叉DNA2的末端分别设计为能够特异性识别凝血酶的适体序列1和适体序列2，使两种三叉DNA通过与凝血酶的特异性识别互相连接，形成网络型结构。其中，适体序列1和适体序列2又为富G序列，能与氯化血红素结合形成大量过氧化物模拟酶，催化反应底物产生放大的检测信号。通过本方法，可实现对靶DNA的超高灵敏检测，无需复杂仪器设备,简单易行。
1.基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法，其特征在于，设计与靶DNA特异性结合后，能与探针DNA互补配对的捕获探针；
向固定后的捕获探针中依次加入靶DNA、探针DNA、DNA聚合酶、DNA内切酶，引发复制-剪切反应，使靶DNA进行循环放大，实现扩增；
向上述体系中继续加入凝血酶、氯化血红素，探针DNA与凝血酶特异性识别，进而与氯化血红素结合，形成过氧化物模拟酶；
再向上述体系中加入能够通过凝血酶相互连接形成网络型结构的三叉DNA；所述三叉DNA分为两类，分别为三叉DNA1和三叉DNA2，所述三叉DNA1的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点1的适体序列1，所述三叉DNA2的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点2的适体序列2；
网络型结构中的凝血酶适体序列与氯化血红素结合，形成大量过氧化物模拟酶；
向上述产物中加入相应的底物，采用比色法对靶DNA进行检测；
所述凝血酶含有两个识别位点，分别为凝血酶识别位点1和凝血酶识别位点2；
所述三叉DNA末端的适体序列1和适体序列2皆含有富G序列；
所述探针DNA一端为能够特异性识别“凝血酶识别位点1或2”的适配体序列；
所述捕获探针为茎环结构，与靶DNA特异性结合后，茎环结构被打开，被打开的茎环末端可与探针DNA互补配对；
所述适体序列1为5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3'；
所述适体序列2为5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'；
5'-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3'；
5'-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3'；
1)5'-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'；
2)5'-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'；
3)5'-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'；
1)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'；
2)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'；
3)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'；
所述探针DNA序列：5'-GGTTGGTGTGGTTGGGCCGTTGC-3'；
2.一种基于权利要求1的网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的方法设计的试剂盒，其特征在于，包括：能与靶DNA特异性结合的捕获探针；
探针DNA，所述探针DNA一端为能够特异性识别“凝血酶识别位点1或2”的适配体序列，另一端为能够与被靶DNA打开的捕获探针互补配对的序列；
能够通过凝血酶相互连接形成网络型结构的三叉DNA；所述三叉DNA分为两类，分别为三叉DNA1和三叉DNA2，所述三叉DNA1的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点1的适体序列1，所述三叉DNA2的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点2的适体序列2；
所述凝血酶含有两个识别位点，分别为凝血酶识别位点1和凝血酶识别位点2；
所述三叉DNA末端的适体序列1和适体序列2皆含有富G序列；
所述捕获探针为茎环结构，与靶DNA特异性结合后，茎环结构被打开，被打开的茎环末端可与探针DNA互补配对；
所述适体序列1为5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3'；
所述适体序列2为5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'；
5'-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3'；
5'-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3'；
1)5'-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'；2)
5'-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'；
3)5'-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'；
1)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'；
2)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'；
3)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'；
所述探针DNA序列：5'-GGTTGGTGTGGTTGGGCCGTTGC-3'；
3.一种基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的装置，其特征在于，包括权利要求2所述的试剂盒。
4.一种基于权利要求2所述的试剂盒的网络型过氧化物模拟酶纳米结构放大检测信号的方法，其特征在于，包括：加入能够通过凝血酶相互连接形成网络型结构的三叉DNA；所述三叉DNA分为两类，分别为三叉DNA1和三叉DNA2，所述三叉DNA1的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点1的适体序列1，所述三叉DNA2的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点2的适体序列2；
加入凝血酶和氯化血红素；所述凝血酶含有两个识别位点，分别为凝血酶识别位点1和凝血酶识别位点2，在凝血酶作用下，三叉DNA中的适体序列1和适体序列2与凝血酶特异性识别，进而与氯化血红素结合，形成网络型过氧化物模拟酶纳米结构，催化反应底物，放大检测信号；
所述三叉DNA末端的适体序列1和适体序列2皆含有富G序列。
基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法
技术领域：
[0001] 本发明属于生化分析技术领域，特别涉及基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法。背景技术：
[0002] 纳米材料具有表面效应、体积效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应等特点，已广泛应用于生物医学、光学、电子学等诸多领域。基于纳米材料所构建的纳米探针在分析化学，特别是生物分析化学等方面具有重要作用。目前常用的纳米探针有量子点、纳米金、磁性颗粒等。其中，基于核酸自组装所构建的纳米探针具有易标记、设计灵活、结构多样、稳定性好等优点，可实现目标分子的识别、信号的转换和放大等，在生物传感等领域具有重要作用和广阔的应用前景。
[0003] 酶循环放大技术是采用工具酶进行的循环反应，反应过程中被测物浓度扩增，从而提高检测信号，实现被测物的高灵敏检测，在生物分子检测方面具有突出的优势。
[0004] 比色法是通过比较或测量反应体系溶液颜色变化来确定待测组分含量的方法。通过定量测定反应液吸光度的变化，可提高测定的准确度，且无需复杂的仪器设备，简单便捷。
发明内容
[0005] 本发明结合两种信号放大技术：适体自组装网络型核酸纳米探针和酶循环放大技术，以达到对靶DNA的痕量检测。其设计原理为：将三叉DNA1和三叉DNA2的末端分别设计为能够特异性识别凝血酶的适体序列1和适体序列2，使两种三叉DNA通过与凝血酶的特异性结合互相连接，形成网络型结构。其中，适体序列1和适体序列2又为富G序列，在与凝血酶特异性识别后，无需外加任何DNA，即可与氯化血红素形成大量过氧化物模拟酶，进而作为免标记核酸纳米探针，催化反应底物产生检测信号。
[0006] 在96孔板表面包被戊二醛，通过共价方法固定捕获探针，该捕获探针需提前退火，以形成茎环结构；加入待测液，当有靶DNA存在时，靶DNA与捕获探针的茎环部分互补配对，从而将捕获探针打开；加入探针DNA，探针DNA一端可与被打开的捕获探针末端互补配对；加入聚合酶、内切酶和dNTPs，在聚合酶的作用下，探针DNA沿捕获探针生长，将靶DNA取代，被取代的靶DNA进入新一轮反应；在内切酶和聚合酶的作用下，发生剪切-复制反应，生成新的靶DNA，进而引发新的反应。因此，当有靶DNA存在时，通过此循环放大过程，极大地扩增了靶DNA的量。加入凝血酶和氯化血红素，探针DNA的另一端为凝血酶适体序列，可与凝血酶特异性结合；由于凝血酶适体序列为富G序列，在凝血酶的作用下，适体序列与氯化血红素形成过氧化物模拟酶；加入预先退火制备的三叉DNA1和三叉DNA2，通过凝血酶相互连接形成网络型结构；网络型结构中的适体序列与氯化血红素结合，形成大量过氧化物模拟酶，催化反应底物产生检测信号。因此，在DNA聚合酶和DNA内切酶的作用下，通过靶DNA引发复制-剪切反应，实现靶DNA的扩增；进一步在凝血酶、三叉DNA1和三叉DNA2的作用下，形成网络型结构。当有氯化血红素存在时，形成大量过氧化物模拟酶，催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺-过氧化氢反应体系，生成蓝色溶液，在650nm处产生紫外-可见吸收信号；反之，当无靶DNA存在时，生成无色溶液，在650nm处无法产生紫外-可见吸收信号。通过本方法，可实现对靶DNA的超高灵敏检测，无需复杂仪器设备,简单易行。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法，包括：
[0009] 设计与靶DNA特异性结合后，能与探针DNA互补配对的捕获探针；
[0010] 向固定后的捕获探针中依次加入靶DNA、探针DNA、DNA聚合酶、DNA内切酶，引发复制-剪切反应，使靶DNA进行循环放大，实现扩增；
[0011] 向上述体系中继续加入凝血酶、氯化血红素，探针DNA与凝血酶特异性识别，进而与氯化血红素结合，形成过氧化物模拟酶；
[0012] 再向上述体系中加入能够通过凝血酶相互连接形成网络型结构的三叉DNA；所述三叉DNA分为两类，分别为三叉DNA1和三叉DNA2，所述三叉DNA1的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点1的适体序列1，所述三叉DNA2的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点2的适体序列2；
[0013] 网络型结构中的凝血酶适体序列与氯化血红素结合，形成大量过氧化物模拟酶；
[0014] 向上述产物中加入相应的底物，采用比色法对靶DNA进行检测；
[0015] 所述凝血酶含有两个识别位点，分别为凝血酶识别位点1和凝血酶识别位点2；
[0016] 所述三叉DNA末端的适体序列1或适体序列2皆含有富G序列；在与凝血酶特异性识别后，能与氯化血红素结合，形成大量过氧化物模拟酶，催化反应底物产生检测信号。
[0017] 所述探针DNA一端为能够特异性识别“凝血酶识别位点1或2”的适体序列。
[0018] 优选的，所述捕获探针为茎环结构，与靶DNA特异性结合后，茎环结构被打开，被打开的茎环末端可与探针DNA互补配对。
[0019] 优选的，所述适体序列1为5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3'；
[0020] 优选的，所述适体序列2为5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'。
[0021] 优选的，所述捕获探针的序列为：
[0022] 5'-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3'；
[0023] 优选的，所述靶DNA序列为：
[0024] 5'-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3'；
[0025] 优选的，所述三叉DNA1的序列为：
[0026] 1)5'-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'；
[0027] 2)5'-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'；
[0028] 3)5'-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'；
[0029] 优选的，三叉DNA2的序列为：
[0030] 1)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'；
[0031] 2)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'；
[0032] 3)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'。
[0033] 本发明还提供了一种基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的试剂盒，包括：
[0034] 能与靶DNA特异性结合的捕获探针；
[0035] 探针DNA，所述探针DNA一端为能够特异性识别“凝血酶识别位点1或2”的适体序列，另一端为能够与被靶DNA打开的捕获探针互补配对的序列；
[0036] 能够通过凝血酶相互连接形成网络型结构的三叉DNA；所述三叉DNA分为两类，分别为三叉DNA1和三叉DNA2，所述三叉DNA1的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点1的适体序列1，所述三叉DNA2的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点2的适体序列2；
[0037] 凝血酶、氯化血红素、DNA聚合酶、DNA内切酶；
[0038] 所述凝血酶含有两个识别位点，分别为凝血酶识别位点1和凝血酶识别位点2；
[0039] 所述三叉DNA末端的适体序列1或适体序列2皆含有富G序列。在与凝血酶特异性识别后，能与氯化血红素结合，形成大量过氧化物模拟酶，催化反应底物产生检测信号。
[0040] 优选的，所述捕获探针为茎环结构，与靶DNA特异性结合后，茎环结构被打开，被打开的茎环末端可与探针DNA互补配对。
[0041] 优选的，所述适体序列1为5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3'；
[0042] 优选的，所述适体序列2为5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'。
[0043] 优选的，所述捕获探针的序列为：
[0044] 5'-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3'；
[0045] 优选的，所述靶DNA序列为：
[0046] 5'-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3'；
[0047] 优选的，所述三叉DNA1的序列为：
[0048] 1)5'-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'；
[0049] 2)5'-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'；
[0050] 3)5'-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'；
[0051] 优选的，三叉DNA2的序列为：
[0052] 1)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'；
[0053] 2)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'；
[0054] 3)5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'。
[0055] 本发明还提供了一种基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的装置，包括上项任一所述的试剂盒。
[0056] 本发明还提供了一种网络型过氧化物模拟酶纳米结构放大检测信号的方法，包括：
[0057] 加入能够通过凝血酶相互连接形成网络型结构的三叉DNA；所述三叉DNA分为两类，分别为三叉DNA1和三叉DNA2，所述三叉DNA1的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点1的适体序列1，所述三叉DNA2的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点2的适体序列2；加入凝血酶和氯化血红素；所述凝血酶含有两个识别位点，分别为凝血酶识别位点1和凝血酶识别位点2，在凝血酶作用下，三叉DNA中的适体序列1和适体序列2与凝血酶特异性识别，进而与氯化血红素结合，形成网络型过氧化物模拟酶纳米结构，催化反应底物，放大检测信号；
[0058] 所述三叉DNA末端的适体序列1和适体序列2皆含有富G序列。
[0059] 本发明的有益效果：
[0060] 在本研究工作中，我们第一次尝试将适体自组装网络型核酸纳米探针与酶循环放大技术相结合，建立了一种比色法检测靶DNA的方法，具有灵敏度高，选择性好，简单快速，价格低廉等优点。其中，适体自组装网络型核酸纳米探针可将信号放大10倍以上，酶循环放大技术可将信号放大100倍以上。将两种信号放大技术相结合，可将检测信号放大1000倍以上，极大地提高了检测灵敏度，对靶DNA的检出限为10-15M，灵敏度远高于其他比色法。由于三叉DNA的凝血酶适体序列中含有富G序列，在与凝血酶特异性识别形成网络型结构后，无需外加任何DNA，即可与氯化血红素形成大量过氧化物模拟酶，进而作为免标记核酸纳米探针，催化反应底物产生检测信号。此外，通过使用其他配体识别机制，如核酸适体识别等，该方法可以扩展到其他生物分子的检测，如蛋白类、小分子类、甚至肿瘤细胞等生物标志物的检测，在疾病诊疗等方面具有巨大的应用前景和发展潜力。
附图说明
[0061] 图1采用所构建的方法检测不同浓度靶DNA得到的紫外-可见光谱图。
[0062] 图2采用所构建的方法检测错配靶DNA得到的紫外-可见光谱图。
[0063] 图3本发明的原理图。
具体实施方式
[0064] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0065] 实施例1
[0066] 实验步骤：
[0067] (1)捕获探针退火形成茎环：90℃加热10min，缓慢降至室温后保持2h。
[0068] (捕获探针序列：
[0069] 5’-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3’)
[0070] (2)在96孔板的5个微孔中加入200μL 5mM戊二醛，将96孔板放入湿盒，37℃水浴振荡反应4h，在微孔底部包被戊二醛。
[0071] (3)弃去反应液，将5个微孔用磷酸盐缓冲液(pH＝5.0)和二次水各洗2次，加入200μL 10-6M的捕获探针，37℃水浴孵育4h，将捕获探针修饰到微孔板上。
[0072] (4)弃去反应液，将5个微孔用二次去离子水清洗3次，在5个孔中各加入100μL浓度为10-12M，10-13M，10-14M，10-15M，0M的靶DNA，25℃反应2h。
[0073] (靶DNA序列：5'-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3')
[0074] (5)三叉DNA1的制备：用二次去离子水将一端为适体序列1的三条DNA稀释至10-4M，再分别用TE缓冲液稀释至3×10-5M；三条DNA各取10μL，混合均匀后，95℃加热2min，65℃孵育5min，60℃孵育2.5min，缓慢降温至20℃。所得产物三叉DNA1于4℃保存。同理制备三叉DNA2。
[0075] (三叉DNA1制备序列：
[0076] 1. 5'-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'
[0077] 2. 5'-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'
[0078] 3. 5'-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'
[0079] 其中：适体序列1为5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3'
[0080] 三叉DNA2制备序列：
[0081] 1.5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3'[0082] 2.5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3'[0083] 3.5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3')[0084] 其中：适体序列2为5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'
[0085] (6)弃去反应液，将5个微孔用二次去离子水清洗2次，在5个孔中各加入10μL 10-5M的探针DNA，5μL 10-5M的三叉DNA1，5μL 10-5M的三叉DNA2，10μL混合液(包括2×10-6M凝血酶，5mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(pH＝7.4),200mM硝酸钠，20mM硝酸钾，2×10-6M氯化血红素)，10μL 10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸，1μL DNA聚合酶(5U/μL)，1μL DNA内切酶(10U/μL)，5μL DNA聚合酶缓冲液(500mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，50mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇，pH 8.0)，
5μL DNA内切酶缓冲液(50mM醋酸钾，20mM三氨基甲烷醋酸盐，10mM醋酸镁，100μg/mL牛血清白蛋白)，3μL TE缓冲液(10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸二钠，pH＝8.0)，
25℃反应1h。
[0086] (探针DNA序列：5'-GGTTGGTGTGGTTGGGCCGTTGC-3'
[0087] DNA聚合酶：Klenow Fragment(exo-)DNA聚合酶
[0088] DNA内切酶：Nb.BbvCI核酸内切酶)
[0089] (7)弃去反应液，将5个微孔用二次去离子水清洗3次，加入100μL显色液(1μL 0.5％3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，2μL 30％过氧化氢，97μL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺缓冲液，含26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，15mM氯化钾)，显色反应后，进行紫外-可见光吸收检测。
[0090] 实验结果：
[0091] 一、基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大比色法检测DNA的的灵敏度[0092] 图1中从下到上依次为采用所建立的方法检测浓度为0M，10-15M，10-14M，10-13M，10-12M靶DNA所产生的紫外-可见光谱图，检出限为10-15M。
[0093] 二、基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大比色法检测DNA的选择性
[0094] 图2中从下到上依次为采用所建立的方法检测0M，10-12M错配靶1，10-12M错配靶2，10-12M靶DNA，所产生的紫外-可见光谱图(错配靶1的序列为：5'-GACGGCGAAGGATTGATACT-
3'，错配靶2的序列为：5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3')
[0095] 结论：只有靶DNA能在650nm处产生紫外-可见吸收信号。
[0096] 实施例2
[0097] 本发明所述的三叉DNA根据文献“Controlled assembly of dendrimer-like DNA,Nature Materials,2003,3,38-42”所述的方法制备。
[0098] 上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
