一种水稻愈伤组织分化培养基及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种水稻愈伤组织分化培养基及其制备方法和应用，所述水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基或J3基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1‑2mg/L、0.5‑2mg/L和20‑50g/L。本发明通过探索分化激素配比、温度条件以及添加不同碳源，筛选出一种高效的水稻愈伤组织分化培养基，可显著提高水稻愈伤组织分化率。

权利要求

1.一种水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，是在MS基础培养基或J3基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、0.5-1.5mg/L和20-50g/L；

所述水稻愈伤组织分化培养基还含有蔗糖，其中，所述蔗糖在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度为20-50g/L。

2.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、0.5mg/L和40g/L；

或者所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、

1mg/L和40g/L；

或者所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、

1.5mg/L和40g/L。

3.根据权利要求1或2所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述蔗糖在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度为30g/L。

4.根据权利要求1或2所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述水稻愈伤组织分化培养基还含有凝固剂，所述凝固剂包括植物凝固剂、动物凝固剂。

5.根据权利要求4所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述凝固剂为Phytagel植物凝胶。

6.根据权利要求5所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述Phytagel植物凝胶在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度为3-4g/L。

7.根据权利要求1或2所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.8-6.0。

8.根据权利要求7所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.9。

9.权利要求1-8任一所述水稻愈伤组织分化培养基在水稻组织培养及基因转化中的应用；所述水稻包括粳稻和籼稻。

10.一种诱导水稻愈伤组织分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：取水稻愈伤组织置于权利要求1-8任一所述水稻愈伤组织分化培养基上培养诱导分化为绿苗。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述培养诱导条件为温度26-30℃，光照培养，培养周期40d。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述水稻愈伤组织由水稻成熟种子、未成熟种子、幼胚、幼穗或花药诱导获得；所述水稻为粳稻或籼稻。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述水稻为粳稻ZH11或籼稻9311。

说明书

一种水稻愈伤组织分化培养基及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种水稻愈伤组织分化培养基及其制备方法和应用，属于水稻组织培养和转基因技术领域。

背景技术

[0002] 植物组织培养技术由20世纪初发展起来，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等在合适的条件进行离体培养，诱导产生愈伤组织、不定芽等，进一步形成完整植株的过程(王家麟(2006)植物组织培养及其应用研究概况.3:86-89)。组织培养技术因其具有可以利用各种人工培养条件控制细胞的生长、分化等优点，有力地推动了植物生理学、病理学、药学、生物化学、遗传学以及作物育种等学科的交叉发展，并广泛应用于农业、林业、园艺、工业、医药业等多个行业，产生巨大的经济效益和社会效益。归纳起来，组培技术有以下几个应用方面：1、苗木的离体快繁；2、培育脱毒苗；3、应用于植物育种如单倍体育种、原生质体融合、胚和胚乳的培养基转基因育种等；4、生产次生代谢产物如中药成分等；5、人工种子和种质保存(李聪聪，李艳提(2013)植物组织培养概论.20:142-144)；6、基因功能研究等。

[0003] 在合适的离体培养条件下，原来已经组织特异化的细胞，重新分裂形成具备全能性的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化”；经“脱分化”的全能细胞，重新形成根、芽以及输导系统等各种类型细胞的过程称为“分化”。脱分化和分化是植物组织培养的两个重要环节，对组织培养效率起着决定性影响。

[0004] 为了提高愈伤组织的分化率，研究人员对培养基和培养方法进行了改造和创新，并取得了一定进展。比如采用干燥处理，辐射处理，不同激素配比，添加不同碳源，添加铜、银等元素，添加脯氨酸，添加多效唑(MET)和添加活性炭等方法。干燥处理和辐射处理较费时，辐射处理方法还需要特定的仪器；添加铜、银等元素会造成额外的重金属污染等。总之上述的方法多且杂乱，且 有些方法只是对某些特定品种有显著作用，并不适用于其他品种。因此，建立一个普适型的愈伤组织分化成苗系统，就显得尤为重要。

[0005] 本发明通过摸索和实践，进一步优化分化培养基配方，最终摸索出了一种高效的水稻愈伤组织分化培养基。该分化培养基对水稻单倍体和转基因研究及遗传育种等具有较强的实用价值，并对于水稻的基因功能研究有良好的推动作用。

发明内容

[0006] 本发明目的是提供一种高效的水稻愈伤组织分化培养基。本发明通过探索分化激素配比、温度条件以及添加不同碳源，筛选出一种高效的水稻愈伤组织分化培养基，可显著提高水稻愈伤组织分化率。

[0007] 实现本发明目的技术方案如下：

[0008] 一种水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基或J3基础培养基中添加KT(即激动素)、NAA(即α-萘乙酸)和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1-2mg/L、0.5-2mg/L和20-50g/L。

[0009] 优选地，上述水稻愈伤组织分化培养基，其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、0.5mg/L和40g/L。

[0010] 上述水稻愈伤组织分化培养基，还含有适量碳源；所述碳源包括蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等；所述碳源优选为蔗糖，其中，所述蔗糖在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度为20-50g/L；优选为30g/L。

[0011] 上述水稻愈伤组织分化培养基，还含有凝固剂。

[0012] 所述凝固剂包括植物凝固剂、动物凝固剂等，例如琼脂、Phytagel植物凝胶、明胶等；优选为Phytagel植物凝胶。

[0013] 其中，所述Phytagel植物凝胶在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度为3-4g/L；优选为3g/L。

[0014] Phytagel是从假单胞菌分泌而来的一种琼脂的替代物，又名Gelrite,Geuam Gum等。可从市售获得，例如SIGMA公司。

[0015] 上述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.8-6.0，优选为5.9。可用本领域 常规pH值调节，例如氢氧化钾和盐酸。

[0016] 较佳地，上述水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基或J3基础培养基中添加KT、NAA、山梨醇、蔗糖和Phytagel植物凝胶；其中，所述KT、NAA、山梨醇、蔗糖和Phytagel植物凝胶在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、0.5mg/L、40g/L、30g/L、3g/L；所述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.9。

[0017] 本发明上述水稻愈伤组织分化培养基适用于粳稻愈伤组织分化和籼稻愈伤组织分化。

[0018] 本发明还研究发现，上述以MS为基础培养基的水稻愈伤组织分化培养基特别适用于粳稻愈伤组织分化；以J3为基础培养基的水稻愈伤组织分化培养基适用于籼稻愈伤组织分化。

[0019] 本发明所述MS基础培养基、J3基础培养基为本领域通用术语，可市售获得，也可自行配制，以下列出其具体配方。

[0020] J3基础培养基与文献YJ Lin，QF Zhang(2005)Optimising the tissue culture conditionsfor high efficiency transformation of indica rice.23:540–547记载的相同。

[0021] 所述MS基础培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质具体配方如下：

[0022]

[0023]

[0024] 所述J3基础培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质具体配方如下：

[0025]

[0026]

[0027] 本发明还提供上述水稻愈伤组织分化培养基的制备方法，包括以下步骤：按配方将各组分添加到MS基础培养基或J3基础培养基中而制得。

[0028] 具体地，以配置1L上述水稻愈伤组织分化培养基为例，其制备方法包括：取MS或J3大量(10X)100ml，MS或J3微量(100X)10ml，MS或J3有机(100X)10ml，MS或J3铁盐(100X)10ml混合后按配方加入蔗糖和山梨醇，完全溶解后调节至所需pH值(例如pH 5.8-6.0)，得混合液。按配方称取Phytagel植物凝胶溶于800ml去离子水，置于微波炉中煮沸至完全溶解，加入上述混合液中定容到1L，116℃灭菌15min；灭菌后待其冷却至50℃左右加KT、NAA至所需浓度，摇匀，即得。可分装至三角瓶，45mL/瓶；分装至平皿25ml/9cm平皿。

[0029] 本发明还提供上述水稻愈伤组织分化培养基在水稻组织培养及基因转化中的应用；所述水稻包括粳稻和籼稻。

[0030] 本发明还提供一种诱导水稻愈伤组织分化的方法，包括以下步骤：取水稻愈伤组织或胚性愈伤组织置于上述水稻愈伤组织分化培养基上培养诱导分化为绿苗；优选地，上述培养诱导条件为温度26-30℃，光照培养，培养周期25-40d。

[0031] 优选地，所述水稻愈伤组织或胚性愈伤组织由水稻成熟种子、未成熟种子、幼胚、幼穗、花药等外植体诱导获得。

[0032] 优选地，所述水稻为粳稻或籼稻，进一步优选为粳稻ZH11或籼稻9311。

[0033] 采用本发明水稻愈伤组织分化培养基，分化条件容易控制；经测试，在上述分化条件下愈伤组织分化出现绿点时间快且出现绿点数多即分化率高。

[0034] 本发明通过研究不同激素配比、不同碳源的添加以及不同培养条件，从而显著提高水稻愈伤组织绿苗分化率，并有助于提高基因转化效率或组培成苗率。

[0035] 与已有技术相比，本发明的优点在于：

[0036] 1、本发明分化激素只用到KT和NAA，不需要添加其他激素和有机物就可 以实现高分化率，简单方便，节约成本。

[0037] 2、在培养基内添加20-50g/L的山梨醇，使愈伤组织保持良好的状态，抑制愈伤组织褐化，提高分化率和组培成苗率或转基因效率。

[0038] 3、本发明培养条件为26-30℃，光照培养，在该条件下分化，出苗快且长势好。

[0039] 本发明所述的培养基具有高效率地提高愈伤组织绿苗分化率的优点，从而显著提高愈伤组织转化效率及组培的成苗率等。

[0040] 经测试，采用本发明水稻愈伤组织分化培养基，水稻愈伤组织生长旺盛、色泽鲜黄不黑，分化出苗快且分化率高，粳稻愈伤组织分化30d后愈伤组织平均分化率高于90％；40d后平均分化率达到100％。籼稻愈伤组织分化25d后平均分化率达到80％；40d后平均分化率达到89.38％。

附图说明

[0041] 图1为实验例中粳稻ZH11愈伤组织分化40天图(MSRe分化培养基)。

[0042] 图2为实验例中籼稻9311愈伤组织分化25天图(J3Re分化培养基)。

具体实施方式

[0043] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

[0044] 为配制方便，先配制以下母液，再由母液配制成各培养基。各母液由溶剂和溶质水组成，溶质具体配方如下：

[0045]

[0046]

[0047]

[0048] 实施例1

[0049] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为MSK1N0.5)，是在MS基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇而制得；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1mg/L、0.5mg/L和40g/L；该水稻愈伤组织分化培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶。

[0050] 实施例2

[0051] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为MSK1N1)，是在MS基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇而制得；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1mg/L、1mg/L和40g/L；该水稻愈伤组织分化培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶。

[0052] 实施例3

[0053] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为MSK1N1.5)，是在MS基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇而制得；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1mg/L、1.5mg/L和40g/L；该水稻愈伤组织分化培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶。

[0054] 实施例4

[0055] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为MSK2N1)，是在MS基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇而制得；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水 稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、1mg/L和40g/L；该水稻愈伤组织分化培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶。

[0056] 实施例5

[0057] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为MSK2N1.5)，是在MS基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇而制得；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、1.5mg/L和40g/L；该水稻愈伤组织分化培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶。

[0058] 实施例6

[0059] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为J3K1N0.5)，与实施例1区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0060] 实施例7

[0061] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为J3K1N1)，与实施例2区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0062] 实施例8

[0063] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为J3K1N1.5)，与实施例3区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0064] 实施例9

[0065] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为J3K2N1)，与实施例4区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0066] 实施例10

[0067] 一种水稻愈伤组织分化培养基(简写为J3K2N1.5)，与实施例5区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0068] 实施例1-10所述水稻愈伤组织分化培养基，其制备方法包括按配方将各组分添加到MS基础培养基或J3基础培养基中即得。

[0069] 实施例11

[0070] 一种水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇而制得；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养 基中的浓度分别为2mg/L、0.5mg/L和40g/L；该水稻愈伤组织分化培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶。

[0071] 实施例12

[0072] 本实施例提供一种水稻愈伤组织分化培养基的制备方法，其配方同实施例11。以配置1L该水稻愈伤组织分化培养基为例，其制备方法包括：取MS大量(10X)100ml，MS微量(100X)10ml，MS有机(100X)10ml，铁盐(100X)10ml混合后加入30g蔗糖，40g山梨醇，完全溶解后调pH 5.9，得混合液。称取3g Phytagel植物凝胶溶于800ml去离子水，置于微波炉中煮沸至完全溶解，加入上述混合液中定容到1L，116℃灭菌15min，灭菌后待其冷却至50℃左右加KT、NAA至所需浓度，摇匀。可分装至三角瓶，45mL/瓶；分装至平皿25ml/9cm平皿。

[0073] 实施例13

[0074] 一种水稻愈伤组织分化培养基，是在J3基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇而制得；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、0.5mg/L和40g/L；该水稻愈伤组织分化培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶。

[0075] 实施例14

[0076] 本实施例提供一种水稻愈伤组织分化培养基的制备方法，其配方同实施例13。以配置1L该水稻愈伤组织分化培养基为例，其制备方法包括：取J3大量(10X)100ml，J3微量(100X)10ml，J3有机(100X)10ml，J3铁盐(100X)10ml，混合后加入30g蔗糖，40g山梨醇，完全溶解后调pH5.9，得混合液。称取3g Phytagel植物凝胶溶于800ml去离子水，置于微波炉中煮沸至完全溶解，加入上述混合液中定容到1L，116℃灭菌15min，灭菌后待其冷却至50℃左右加KT、NAA至所需浓度，摇匀。可分装至三角瓶，45mL/瓶；分装至平皿25ml/9cm平皿。J3母液见文献YJ Lin，QF Zhang(2005)Optimising the tissue culture conditionsfor high efficiency transformation of indica rice.23:540–547。

[0077] 实施例15

[0078] 一种水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基添加有KT、NAA和山梨 醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1mg/L、0.5mg/L和40g/L；所述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.8。

[0079] 实施例16

[0080] 一种水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基添加有KT、NAA和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1mg/L、1mg/L和40g/L；所述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.9。

[0081] 实施例17

[0082] 一种水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基添加有KT、NAA和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1mg/L、1.5mg/L和40g/L；所述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为6.0。

[0083] 实施例18

[0084] 一种水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基添加有KT、NAA和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、1mg/L和40g/L；所述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.9。

[0085] 实施例19

[0086] 一种水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基添加有KT、NAA和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、1.5mg/L和40g/L；所述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.9。

[0087] 实施例20

[0088] 一种水稻愈伤组织分化培养基，与实施例15区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0089] 实施例21

[0090] 一种水稻愈伤组织分化培养基，与实施例16区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0091] 实施例22

[0092] 一种水稻愈伤组织分化培养基，与实施例17区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0093] 实施例23

[0094] 一种水稻愈伤组织分化培养基，与实施例18区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0095] 实施例24

[0096] 一种水稻愈伤组织分化培养基，与实施例19区别仅在于将MS基础培养基替换为J3基础培养基。

[0097] 实施例25-34

[0098] 水稻愈伤组织分化培养基，分别在实施例15-24所述水稻愈伤组织分化培养基的配方基础上添加有蔗糖，该水稻愈伤组织分化培养基中蔗糖的浓度为30g/L。

[0099] 实施例15-34所述水稻愈伤组织分化培养基，其制备方法包括按配方将各组分添加到MS基础培养基或J3基础培养基中即得。

[0100] 对比例1

[0101] 一种培养基MSTG，以配置1L该培养基为例，其制备方法包括：取MS大量(10X)100ml，MS微量(100X)10ml，MS有机(100X)10ml，铁盐(100X)10ml混合后加入30g蔗糖，和脯氨酸(Pro)、水解酪蛋白(CH)；使Pro、CH、在该培养基中的浓度分别为300mg/L，200mg/L；完全溶解后调pH5.9，得混合液。称取3g Phytagel溶于800ml去离子水，置于微波炉中煮沸至完全溶解，加入上述混合液中定容到1L，116℃灭菌15min，灭菌后待其冷却至50℃左右加入
6-BA(即6-苄氨基嘌呤)、KT、NAA、IAA，使其在培养基中的浓度分别为2mg/L，2mg/L，0.2mg/L，0.2mg/L，摇匀。可分装至三角瓶，45mL/瓶。参考文献：YJ Lin，QF Zhang(2005)Optimising the tissue culture conditionsfor high efficiency transformation of indica rice.23:540–547。

[0102] 对比例2

[0103] 一种培养基MSB3N0.5，以配置1L该培养基为例，其制备方法包括：取 MS大量(10X)100ml，MS微量(100X)10ml，MS有机(100X)10ml，铁盐(100X)10ml混合后加入30g蔗糖，和脯氨酸(Pro)、水解酪蛋白(CH)、谷氨酰胺(Gln)；使Pro、CH、Gln在该培养基中的浓度分别为
500mg/L，300mg/L，500mg/L；完全溶解后调pH5.9，得混合溶液；称取Agar(琼脂粉)8.6g，加入上述混合溶液中定容到1L，116℃灭菌15min，灭菌后待其冷却至50℃左右加6-BA(即6-苄氨基嘌呤)、NAA，使其在培养基中的浓度分别为3mg/L，0.5mg/L，摇匀。可分装至三角瓶，
45mL/瓶。参考文献：王亚琴，2004，水稻幼穗培养高效再生系统的建立.21:52-60。

[0104] 实验例1

[0105] 选取水稻成熟种子(粳稻ZH11、籼稻9311)诱导的愈伤组织作为供体，挑选约绿豆大小的、色泽鲜黄、致密、干燥的胚性愈伤，分别置于不同分化培养基上诱导分化绿苗，培养条件控制为：温度26-30℃、光照培养，定期观察。25-40d后计算：绿苗分化率(％)＝出苗愈伤数/转移的愈伤数*100％；平均一颗愈伤出苗数(株)＝出苗数/转移的愈伤数。

[0106] 实施例11水稻愈伤组织分化培养基(简写为MSRe)诱导粳稻愈伤组织分化结果如表1所示：愈伤组织生长旺盛、色泽鲜黄不黑，约7天左右出现分化绿点，愈伤组织分化30d后平均分化率高于90％，40d平均分化率为100％，平均一颗愈伤出苗数达到8株，分化40天结果见图1。

[0107] 表1:粳稻ZH11愈伤组织分化率

[0108]

[0109] 对比例1培养基MSTG诱导粳稻愈伤组织分化结果如表2所示：愈伤组织 在该培养基上分化约7天左右会出现分化绿点，但随着分化时间的延长，大部分分化绿点未能继续分化形成绿苗，反而慢慢褐化死亡，只有一小部分分化成绿苗，40d平均分化率仅为34.4％，平均一颗愈伤出苗数仅为1.1株。

[0110] 对比例2培养基MSB3N0.5诱导粳稻愈伤组织分化结果如表2所示：愈伤组织在该培养基上的分化约5天左右会出现分化绿点，但随着分化时间的延长，大部分分化绿点未能继续分化形成绿苗，愈伤组织多数出现褐化死亡，40d平均分化率仅为31.1％，平均一颗愈伤出苗数仅为0.9株。

[0111] 实施例11水稻愈伤组织分化培养基(简写为MSRe)常温与低温下对比结果如表2所示：在28℃下粳稻愈伤组织分化出现绿点时间比24℃下短且出现绿点数目多，在分化一周时，不同培养基在常温下的分化粳稻愈伤组织都有27％左右出现绿点，而低温下分化的粳稻愈伤组织都没有出现绿点。

[0112] 表2:不同培养基愈伤组织(粳稻ZH11)分化率

[0113]

[0114] 综合上述几种培养基分化率对比可以发现，本发明使用的培养基出苗快而且分化率高，愈伤组织分化30d后平均分化率高于90％，是其他培养基分化率的三倍以上，平均一颗愈伤出苗数高达8.1株，是其他培养基的七倍以上。

[0115] 实施例13水稻愈伤组织分化培养基(简写为J3Re)诱导籼稻愈伤组织分化结果如表3所示：愈伤组织的平均分化率高于85％，且分化过程愈伤组织色泽鲜黄，不发黑，分化25d见图2。分化率低是籼稻愈伤组织成苗率低的主要因素之一，所以应用该分化培养基可以显著提高籼稻愈伤组织成苗率。

[0116] 表3:籼稻9311愈伤组织分化率

[0117]

[0118] 综上，本发明提供的水稻愈伤组织分化培养基通过调节激素(KT、NAA)合理配比，及合理添加碳源(山梨醇)，适用于粳稻及籼稻的愈伤组织分化，可应用于水稻的组织培养，转基因及单倍体研究与遗传育种，并对水稻的基因功能研究有较大的帮助。

[0119] 实验例2

[0120] 按实验例1相同的方法，以实施例1-5培养基对粳稻进行分化实验，以实施例6-10培养基对籼稻进行分化实验，实验结果分别见表4和表5。

[0121] 表4:不同培养基愈伤组织(粳稻ZH11)分化率

[0122]

[0123] 表5:不同培养基愈伤组织(籼稻9311)分化率

[0124]

[0125] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。