鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗及其制备方法

摘要

本发明提供了一种鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗及其制备方法，是由如SEQ ID No.1所示的鲍曼不动杆菌SmpA和如SEQ ID No.2所示的鲍曼不动杆菌PLD核酸序列，分别连入表达载体，分别构建SmpA和PLD重组质粒，分别诱导表达重组SmpA和PLD蛋白，再将两种蛋白混合佐剂制备的疫苗。本发明利用免疫信息学和逆向遗传学，分析多重耐药鲍曼不动杆菌的外膜蛋白成分的抗原性和免疫原性，进行基因克隆，蛋白表达、纯化以及免疫学研究，筛选出有效的外膜蛋白成分，并予以联合，提高疫苗的安全性和有效性，较以往疫苗有更现实和诱人的应用前景。

权利要求

1.鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗，其特征在于，是由如SEQ ID No .1所示的鲍曼不动杆菌SmpA和如SEQ ID No .2所示的鲍曼不动杆菌PLD核酸序列，分别连入表达载体，分别构建SmpA和PLD重组质粒，分别诱导表达重组SmpA和PLD蛋白，再将两种蛋白混合佐剂制备的疫苗；

所述的鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗的制备方法：(1)根据SmpA、PLD基因序列，设计合成SmpA、PLD序列引物，在两端引物分别引入NdeⅠ和Xho Ⅰ的酶切位点，PCR合成SmpA和PLD基因；(2)回收纯化PCR产物，TA克隆至载体pMD 18-T，构建克隆载体pMD 18-SmpA和pMD 

18- PLD  ,并将其转化到E.coli BL21中，PCR筛选阳性转化子，小量提取质粒，经酶切鉴定测序； (3)用Nde I和Xho I双酶切测序正确的pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD，与经同样酶切的 pET28b质粒用T4 DNA连接酶连接，构建表达质粒pET28b-SmpA和pET28b-PLD，并将其转化到表达宿主E .coli BL21(DE3)中，PCR筛选阳性转化子； (4)将阳性单菌落接种于含卡那霉素的LB培养基中，IPTG诱导表达重组SmpA和重组PLD 蛋白；  (5)SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定重组蛋白； (6)采用离子交换层析法纯化重组蛋白并去除内毒素； (7)重组的SmpA蛋白和重组PLD蛋白混合后，再与佐剂混合制备疫苗；

步骤(7)是将重组的SmpA蛋白25μg和重组PLD蛋白5μg混合后，再与1％氢氧化铝溶液按质量比1：1混合制备疫苗。

说明书

鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学和免疫学交叉领域，具体来说是一种鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 鲍曼不动杆菌存在于医院环境并在患者多部位定植，导致引起医院获得性肺炎、血流感染、腹腔感染、脑膜炎、皮肤软组织感染和泌尿系感染等。由于其强大的获得耐药性及克隆传播能力，鲍曼不动杆菌已成为全球流行并呈高度耐药的常见致病菌。在我国，鲍曼不动杆菌已经成为医院感染最常见的病原菌之一，2013年中国CHINET细菌耐药性监测显示鲍曼不动杆菌检出率为11.97％，仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其中大多数为多重耐药菌(对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为62.8％和59.4％；对头孢哌酮舒巴坦、米诺环素和左氧氟沙星的耐药率分别为36.4％、41.8％和43.4％)。全耐药鲍曼不动杆菌的出现和不断增多已成为临床面临的另一重大挑战，XDR鲍曼不动杆菌主要分布于重症监护病房或烧伤病房，显著增加患者住院费用，延长患者住院时间，并导致感染患者陷入无药可用的困境。当前新的有效抗菌药物研发严重滞后，新的针对性的治疗手段刻不容缓。近年来，国内研究主要聚焦在监测鲍曼不动杆菌耐药性动态变化及耐药机制的研究，国外研究则涵盖了耐药机制、致病机理、耐药变化等方面，关于疫苗的研究则包括灭活疫苗、外膜蛋白疫苗、基因重组疫苗和荚膜多糖疫苗。McConnell、Bomerger等人的研究结果表明IWC(inactivated whole cell灭活全菌)、OMC(outer membrane complex外膜蛋白复合物)、OMV(outer membrane vesicle外膜囊泡)免疫的小鼠均能抵抗鲍曼不动杆菌的侵袭。然而由于所含成分繁多且复杂，在生产过程中难以标准化疫苗剂量；而且其中脂多糖(内毒素)含量过高，可产生明显的毒副作用。对应的重组蛋白疫苗诸如Bap(biofilm associated protein生物膜相关蛋白)、OmpA(outer  membrane protein  A外膜蛋白A)和Ata(trimeric autotransporter protein三聚体自转运蛋白)均为保守基因表达产物，具有高度同源性，并覆盖了较大部分的鲍曼不动杆菌毒株，表现了良好的免疫效果，且成分单一、重复性好、产品批间差异小、易于控制细菌内毒素含量等优势，但单一成分疫苗可能免疫保护不足，并易将鲍曼不动杆菌置于强大的选择压力下诱导细胞膜靶蛋白下调，出现免疫逃避导致疫苗最终失效。

[0003] 多种革兰阴性菌基因组中小蛋白A(small protein A，SmpA)几乎都有同源性表达，SmpA是鲍曼不动杆菌细胞膜重要成分之一；SmpA被认为是维持细胞膜完整的重要结构，是外膜形成过程中重要的功能配件。磷脂酶D(phospholipase D，PLD)被证实在病原菌血源传播的过程中发挥了重要的作用，同时，研究证明PLD是鲍曼不动杆菌的重要致病因子。逆向免疫学提示SmpA和PLD可以作为一个良好的蛋白疫苗靶点。此外，SmpA和PLD均可诱导机体产生免疫应答，SmpA抗体可破坏体内鲍曼不动杆菌细胞膜的完整性，PLD抗体可灭活PLD活性，减低体内鲍曼不动杆菌毒力，两者协同作用可发挥更完善的保护作用。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗及其制备方法。利用免疫信息学和逆向遗传学，分析多重耐药鲍曼不动杆菌的外膜蛋白成分的抗原性和免疫原性，进行基因克隆，蛋白表达、纯化以及免疫学研究，筛选出有效的外膜蛋白成分鲍曼不动杆菌外膜蛋白small protein A(SmpA)、鲍曼不动杆菌磷脂酶D(PLD)，并予以联合，提高疫苗的安全性和有效性，较以往疫苗有更现实和诱人的应用前景。

[0005] 一种鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗，是由如SEQ ID No.1所示的鲍曼不动杆菌SmpA和如SEQ ID No.2所示的鲍曼不动杆菌PLD核酸序列，分别连入表达载体，分别构建SmpA和PLD重组质粒，分别诱导表达重组SmpA和PLD蛋白(蛋白序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)，再将两种蛋白混合佐剂制备的疫苗。

[0006] 所述的鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗的制备方法：

[0007] (1)根据SmpA、PLD基因序列，设计合成SmpA、PLD序列引物，在两端引物分别引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点，PCR合成SmpA和PLD基因；

[0008] (2)回收纯化PCR产物，TA克隆至载体pMD 18-T，构建克隆载体pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD,并将其转化到E.coli BL21中，PCR筛选阳性转化子，小量提取质粒，经酶切鉴定测序；

[0009] (3)用Nde I和Xho I双酶切测序正确的pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD，与经同样酶切的pET28b质粒用T4 DNA连接酶连接，构建表达质粒pET28b-SmpA和pET28b-PLD，并将其转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中，PCR筛选阳性转化子；

[0010] (4)将阳性单菌落接种于含卡那霉素的LB培养基中，IPTG诱导表达重组SmpA和重组PLD蛋白；

[0011] (5)SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定重组蛋白；

[0012] (6)采用离子交换层析法纯化重组蛋白并去除内毒素；

[0013] (7)重组的SmpA蛋白和重组PLD蛋白混合后，再与佐剂混合制备疫苗。

[0014] 步骤(7)具体是将重组的SmpA蛋白25μg和重组PLD蛋白5μg混合后，再与1％氢氧化铝溶液按质量比1：1混合制备疫苗。

[0015] 本发明在GenBank中检索到的ATCC19606来源SmpA基因序列和PLD基因序列，SmpA蛋白(转录基因名称ABAYE2921，GeneBankID：CAM87743.1)和PLD蛋白(转录基因名称A1S_2989，Genebank ID：ABO13392.1)。

[0016] 本发明重组质粒构建：

[0017] (1)在GenBank中检索到的ATCC19606来源SmpA基因序列和PLD基因序列，设计合成SmpA和PLD序列的引物，并在两端引物分别引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点；

[0018] (2)以测序正确的质粒为模板，以pfu酶进行PCR扩增，引入酶切位点；

[0019] (3)反应条件:94℃预变性5min,94℃30s，51℃30s，72℃30s，30个循环，72℃延伸10min，1.5％凝胶电泳后回收纯化PCR产物；

[0020] (4)用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切PCR产物，所得产物与经同样酶切的pET28b质粒用T4 DNA连接酶连接并转化至表达宿主E.coli。

[0021] 本发明重组蛋白的原核表达及纯化过程具体如下：

[0022] (1)取1ul重组的pET28b质粒转化BL21(DE3),42℃热击90s后冰上静置2min后涂含有30ug/mL卡那霉素的培养基平板，37℃培养过夜；

[0023] (2)挑取转化了重组质粒的表达菌株BL21(DE3)的单菌落于装有4mL含有30ug/mL卡那霉素的LB培养基的试管中，37℃，220rpm过夜培养；

[0024] (3)将培养的菌液按体积比1:100的比例接种于LB液体培养基中，添加30ug/mL卡那霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.2mM的IPTG，37℃，220rpm，5h，离心收集细胞菌体；

[0025] (4)收集菌体并用PBS缓冲液悬浮；

[0026] (5)SDS-PAGE电泳检测；

[0027] (6)将收集的细菌菌体用破碎Buffer溶解,破碎Buffer配方为50mM Tris，300mM NaCl，0.1％Triton X-114,pH＝8.0，冰浴中超声破碎菌体，功率500W，25min，超声2s，暂停6s为一个循环；超声完毕，12000rpm/min，4℃离心20min，弃上清，沉淀再用加尿素的破碎Buffer溶解(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，0.1％Triton X-114,pH＝8.0)，冰浴中超声破碎菌体，功率500W，25min，超声2s，暂停6s为一个循环；超声完毕，12000rpm/min，4℃离心
20min，上清用于亲和层析；

[0028] (7)取10mL Ni-NTA，用10倍柱床体积的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min，Binding Buffer配方为：8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，pH＝8.0；

[0029] (8)样品上柱，流速为2mL/min；

[0030] (9)上样结束后，用10倍柱体积的去内毒素buffer冲洗柱子，去内毒素buffer配方：8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，1％Triton X-114，pH＝8.0；

[0031] (10)用10倍体积的Wash Buffer清洗柱子,流速2mL/min；Wash Buffer配方为：8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，20/50咪唑，pH＝8.0；

[0032] (11)Elution Buffer洗脱,流速2mL/min，收集洗脱液；Elution Buffer配方为：8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑，pH＝8.0。

[0033] 本发明实施例中尝试将两种蛋白分别与氢氧化铝佐剂混合后免疫小鼠，收集免疫后小鼠血清，进行ELISA检测鲍曼不动杆菌SmpA和PLD抗体滴度，发现经SmpA和PLD免疫后体内均产生了较高的抗体水平。然后将两种蛋白一起与氢氧化铝佐剂混合后免疫小鼠，小鼠雾化吸入临床分离的鲍曼不动杆菌，观察72h，在小鼠肺组织中细菌负荷在联合免疫组较对照组降低102倍，优于单用PLD免疫组(10倍)和单用SmpA免疫组(几乎无变化)，且在血清中炎症因子水平显著降低，肺组织炎症细胞浸润明显减少。显示了该联合疫苗具有更高的免疫原性。而且将SmpA和PLD免疫后小鼠抗血清通过尾静脉注射进入小鼠体内，在以临床分离的耐药鲍曼不动杆菌感染，发现SmpA和PLD联合血清被动免疫的小鼠15天生存率100％，PLD组为83.3％，SmpA组为50％，对照组为0％。显示了SmpA和PLD抗血清具有被动保护效果。

[0034] 本发明的优点和积极效果

[0035] (1)动物实验表明SmpA和PLD联合疫苗无论在主动免疫还是被动免疫均表现了较好的免疫效果；

[0036] (2)具有制备简单、产量高、杂质少，抗原性好，不良反应少的优点；

[0037] (3)理论上鲍曼不动杆菌对SmpA和PLD联合疫苗的逃避免疫较单一疫苗发生率低；

[0038] (4)临床应用可能显著降低在各重症监护室鲍曼不动杆菌的发生率，节约患者住院费用并缩短患者住院时间。

附图说明

[0039] 图1为蛋白SDS-PAGE分析图，

[0040] A为SmpA蛋白SDS-PAGE分析图、B为SmpA蛋白亲和层析SDS-PAGE分析图、C为SmpA蛋白Western Blot分析图；

[0041] D为PLD蛋白SDS-PAGE分析图、E为PLD蛋白亲和层析SDS-PAGE分析图、F为PLD蛋白Western Blot分析图；

[0042] 图2为不同浓度抗原免疫小鼠时抗体滴度；

[0043] 图3为雾化吸入感染后72小时各组肺组织匀浆中细菌集落数；

[0044] 图4为各组感染后72h支气管肺泡灌洗液(左)和血清(右)中细胞因子浓度；

[0045] 图5为注射血清感染后各组生存率。

具体实施方式

[0046] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明的保护范围。

[0047] 实施例1：重组质粒构建

[0048] (1)根据SmpA、PLD基因序列，设计合成SmpA、PLD序列引物，在两端引物分别引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点，PCR合成SmpA和PLD基因；

[0049] (2)回收纯化PCR产物，TA克隆至载体pMD 18-T(购自上海浩然生物技术有限公司)，构建克隆载体pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD,并将其转化到E.coli BL21中，PCR筛选阳性转化子，小量提取质粒，经酶切鉴定测序；

[0050] (3)用Nde I和Xho I双酶切测序正确的pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD，与经同样酶切的pET28b质粒(购自上海北诺生物科技有限公司)用T4 DNA连接酶连接，构建表达质粒pET28b-SmpA和pET28b-PLD，并将其转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中，PCR筛选阳性转化子。

[0051] 实施例2：融合蛋白的原核表达及纯化(图1)

[0052] (1)取1ul重组的pET28b质粒转化BL21(DE3),42℃热击90s后冰上静置2min后涂平板(30ug/mL卡那霉素)，37℃培养过夜；

[0053] (2)挑取表达菌株BL21(DE3)的单菌落于试管中(4mL LB培养基，30ug/mL卡那霉素)37℃，220rpm过夜培养；

[0054] (3)将培养的菌液按1:100的体积比例分别接种于4ml LB培养基中，添加30ug/mL卡那霉素，37℃，220rpm培养；

[0055] (4)当OD值达到0.6左右时，分别添加终浓度为0.2mM的IPTG，20℃过夜，37℃，220rpm诱导5h,未加IPTG诱导剂的作为阴性对照；

[0056] (5)收集菌体并用PBS缓冲液悬浮；

[0057] (6)SDS-PAGE电泳检测(图1A、D)；

[0058] (7)大量诱导：将步骤(2)培养的菌液按1:100的体积比例接种于4L的LB液体培养基中，添加30ug/mL卡那霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.2mM的IPTG，37℃，220rpm，5h，离心收集细胞菌体；

[0059] (8)将收集的细菌菌体用破碎Buffer(50mM Tris，300mM NaCl，0.1％Triton X-114,pH＝8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率500W，25min(超声2s，暂停6s为一个循环)。
超声完毕，12000rpm/min，4℃离心20min，弃上清，沉淀用加尿素的破碎Buffer(8M尿素，
50mM Tris，300mM NaCl，0.1％Triton X-114,pH＝8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率
500W，25min(超声2s，暂停6s为一个循环)。超声完毕，12000rpm/min，4℃离心20min，上清用于亲和层析(图1B、E)；

[0060] (9)取10mL Ni-NTA，用10倍柱床体积的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min；

[0061] (10)样品(溶解液上清)上柱，流速为2mL/min；

[0062] (11)上样结束后，用10倍柱体积的去内毒素buffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，1％Triton X-114，pH＝8.0)冲洗柱子；

[0063] (12)用10倍体积的Wash Buffer清洗柱子,流速2mL/min；

[0064] (13)Elution Buffer洗脱,流速2mL/min，收集洗脱液，WB分析(图1C、F)。

[0065] 注：Binding Buffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，pH＝8.0)[0066] Wash Buffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，20/50咪唑，pH＝8.0)[0067] Elution Buffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑，pH＝8.0)[0068] 实施例3：SmpA和PLD分别动物免疫选择适当的剂量

[0069] 重组的SmpA和PLD各以5/25/125μg与1％氢氧化铝溶液按照质量比1：1混合，以混合液分别在第0天、第7天、第21天进行3次皮下注射免疫，糖尿病小鼠饲养在SPF级环境中。最后一次免疫后2周采血进行抗体水平的ELISA，ELISA检测时抗原包被为10μg的重组SmpA和PLD，检测结果证实抗体滴度达103-106，证实产生了高滴度特异性抗体，并选择SmpA25μg和PLD5μg作为疫苗剂量(图2)。

[0070] 实施例4：联合疫苗的主动免疫实验

[0071] 重组的SmpA和PLD各以25、5μg与1％氢氧化铝溶液按照质量比1：1混合，以混合液分别在第0天、第7天、第21天进行3次皮下注射免疫，糖尿病小鼠饲养在SPF级环境中。最后一次免疫后2周后进行临床分离的耐多药鲍曼不动杆菌雾化感染，小鼠肺组织细菌负荷联合免疫组较对照组降低102倍，优于单用PLD免疫组(10倍)和单用SmpA免疫组(几乎无变化)，且在血清中炎症因子水平显著降低，肺组织炎症细胞浸润明显减少。显示了该联合疫苗具有较高的免疫原性(图3、4)。

[0072] 实施例5：联合疫苗的被动免疫实验

[0073] 取经三次免疫后的小鼠抗血清100μL，尾静脉注射入小鼠体内，1h后再经腹腔注射注射106CFU鲍曼不动杆菌菌液，感染后15天对小鼠进行观察，SmpA和PLD联合血清被动免疫的小鼠15天生存率100％，PLD组为83.3％，SmpA组为50％，对照组为0％(图5)。显示了SmpA和PLD抗血清具有被动保护效果。