一种乌司他丁冻干粉制剂及其制备方法

摘要

本发明涉及一种乌司他丁冻干粉制剂及其制备方法。所述乌司他丁冻干粉制剂的配方为，每1000支：乌司他丁2500万单位～10000万单位、甘露醇1～30g、氯化钠0～10g、磷酸氢二钠0～5g和磷酸二氢钠0～5g。本发明提供的乌司他丁冻干粉制剂的制备方法有以下特点：将乌司他丁与辅料分开溶解，对活性成分乌司他丁现配现用；在2～4℃的低温环境下配制冻干前药液，并在整个配置过程中保持这一温度范围，保证乌司他丁的稳定性；在冷冻干燥的预冻过程中采用“快‑慢‑快”的三步预冻方式，加快了其干燥速率，同时提高了其复溶性能。按照本发明提供配方与制备方法制成的乌司他丁冻干粉制剂复溶性能与稳定性均较为优异。

权利要求

1.一种乌司他丁冻干粉制剂的制备方法，其中，所述乌司他丁冻干粉制剂的配方为，每

1000支：乌司他丁2500万单位～10000万单位、甘露醇1～30g、氯化钠0～10g、磷酸氢二钠

0.17～5g和磷酸二氢钠0.32～5g，

其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

(1)按照配方用量称取甘露醇、氯化钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠于配液桶中，用温度为2～4℃注射用水搅拌至溶解；加入医用活性炭搅拌混匀后，使用0.45μm滤膜过滤脱碳，并保持温度为2～4℃，此溶液为辅料溶液；用2～4℃的注射用水溶解上述配方量的乌司他丁，并与上述2～4℃辅料溶液混合均匀，得到药液A，下述步骤(2)-(5)中涉及的所有药液均保持在2～4℃；

(2)用盐酸或氢氧化钠溶液调节上述药液A的pH值至5.5～6.0，得到药液B；

(3)用2～4℃注射用水将上述药液B补足体积至1500mL，混匀，得到药液C；

(4)采用0.22μm滤膜对药液C进行两次过滤除菌，得到冻干前药液D；

(5)分装冻干前药液D，半加塞，于冻干机中冷冻干燥。

2.如权利要求1所述的乌司他丁冻干粉制剂的制备方法，其特征在于：所述制备方法步骤(1)中的医用活性炭的平均粒径为2～5μm。

3.如权利要求2所述的乌司他丁冻干粉制剂的制备方法，其特征在于：所述制备方法步骤(1)中的医用活性炭的平均粒径为3～4μm。

4.如权利要求1-3任一项所述的乌司他丁冻干粉制剂的制备方法，其特征在于：步骤(5)中的冷冻干燥包括以下步骤：①第一阶段预冻：冻干前药液D温度为2～4℃，搁板温度为0～4℃进箱；以3～5℃/min的降温速率将冻干机降温至-25～-22℃，保温1.5～2小时；

②第二阶段预冻：以0.3～0.6℃/min的降温速率将冻干机降温至-30～-27℃，保温1.5～2小时；

③第三阶段预冻：以3～5℃/min的降温速率将冻干机降温至-38～-32℃，保温1.5～2小时；

④一次干燥：将冷凝温度降至-45～-40℃，抽真空至10Pa以下，以0.6～0.8℃/min的速度将冻干机温度升至10～15℃，保温至冰晶消失，然后继续保温1.5～2小时；

⑤二次干燥：以0.8～1℃/min的速度将冻干机温度升至28～32℃，计时保温3～4小时；

检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

5.如权利要求4所述的乌司他丁冻干粉制剂的制备方法，其特征在于：步骤(5)中的冷冻干燥包括以下步骤：①第一阶段预冻：冻干前药液D温度为2～3℃，搁板温度为0～2℃进箱；以3～4℃/min的降温速率将冻干机降温至-22～-23℃，保温1.5～2小时；

②第二阶段预冻：以0.3～0.4℃/min的降温速率将冻干机降温至-29～-27℃，保温1.5～2小时；

③第三阶段预冻：以3～4℃/min的降温速率将冻干机降温至-35～-32℃，保温1.5～2小时；

④一次干燥：将冷凝温度降至-43～-40℃，抽真空至10Pa以下，以0.6～0.7℃/min的速度将冻干机温度升至10～13℃，保温至冰晶消失，然后继续保温1.5～2小时；

⑤二次干燥：以0.8～0.9℃/min的速度将冻干机温度升至28～30℃，计时保温3～4小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

6.如权利要求4所述的乌司他丁冻干粉制剂的制备方法，其特征在于：步骤(5)中的冷冻干燥包括以下步骤：①第一阶段预冻：冻干前药液D温度为3～4℃，搁板温度为2～4℃进箱；以4～5℃/min的降温速率将冻干机降温至-23～-25℃，保温1.5～2小时；

②第二阶段预冻：以0.4～0.6℃/min的降温速率将冻干机降温至-29～-30℃，保温1.5～2小时；

③第三阶段预冻：以4～5℃/min的降温速率将冻干机降温至-35～-38℃，保温1.5～2小时；

④一次干燥：将冷凝温度降至-43～-45℃，抽真空至10Pa以下，以0.7～0.8℃/min的速度将冻干机温度升至10℃，保温至冰晶消失，然后继续保温1.5～2小时；

⑤二次干燥：以0.9～1℃/min的速度将冻干机温度升至30～32℃，计时保温3～4小时；

检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

7.一种按照权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的乌司他丁冻干粉制剂，其特征在于：所述乌司他丁冻干粉制剂的孔隙率为96.1％～98.2％。

8.如权利要求7所述乌司他丁冻干粉制剂，其特征在于：所述乌司他丁冻干粉制剂的孔隙率为98.2％。

说明书

一种乌司他丁冻干粉制剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种复溶性能与稳定性优异的乌司他丁冻干粉制剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 乌司他丁(Ulinastatin)是从人体尿液中分离纯化的一种糖蛋白，其也被称为人尿胰蛋白酶抑制剂(Human Urinary Trypsin Inhibitor)。乌司他丁具有：减少促炎性细胞因子的生成和释放；调节凝血功能，抑制纤溶亢进，保护血小板；稳定溶酶体膜，抑制多种水解酶活性；免疫调节作用等药理活性。因此，乌司他丁在临床抗炎、脏器保护、脑损伤神经保护、改善微循环等方面具有重要作用。临床上乌司他丁常用于急性胰腺炎、急性循环障碍、急性器官功能衰竭的治疗；大中型手术期的器官保护；以及危重症中全身性炎症反应、多器官功能障碍综合症的预防等。

[0003] 目前，市售乌司他丁制剂多为粉针剂，粉针剂在使用前需要进行配置复溶。粉针剂的复溶性能与其孔隙率有关，粉针剂的孔隙率指其堆积体积中，粉末颗粒之间的孔隙体积所占的比例。常规情况下，孔隙率越大，粉针剂的复溶性能越优良。本发明人长期致力于乌司他丁制剂的研制工作，并取得了一定效果。例如，在中国专利申请CN101439180A中公开了一种稳定的乌司他丁粉针剂药物组合物，并公开了利用冻干技术制备该粉针剂的方法。然而，该冻干粉针剂的复溶性能并不令人满意。复溶性能良好的粉针剂应当是复溶速度快，复溶后澄明度良好且质量稳定。当乌司他丁用于急性器官功能衰竭时，用药时间至关重要，而冻干粉针剂的复溶速度是影响其用药时间的重要因素。除了辅料的配比之外，冻干前溶液的配制与具体冻干过程也对冻干粉制剂的复溶性能有重要影响。尤其是冻干过程中的各个参数的调整对冻干粉的复溶性能经常存在难以预料的影响。

[0004] 药品从生产到使用所经历的各个流通环节中，很难完全保证始终严格处于该药品所需的存放条件(温度以及湿度)。作为一种生物活性蛋白，乌司他丁对温度和湿度更为敏感，在存放过程中容易发生生物活性降低甚至失效。而临床使用时，很难在每次使用时对药物的生物学活性进行检测，这就造成对无效病例发生的原因难以判断，一方面影响对病人的治疗，另一方面造成药物的浪费。由此可见，提高药品在储存过程中的稳定性显得更加重要。此外，乌司他丁发挥临床作用的对象是人体，人体的正常体温为36.2～37.2℃，乌司他丁药剂在类似人体正常体温的温度范围内的稳定性直接影响其活性，进而影响其药效。本发明人在中国专利申请CN101439180A中公开一种乌司他丁粉针剂药物组合物，该药物组合物能够在25℃保持相对稳定，然而在更高温度下的稳定性并不理想。

[0005] 综上所述，提高乌司他丁粉针剂的复溶性能和稳定性是其实际生产和临床使用需要解决的重要问题。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种复溶性能与稳定性优异的乌司他丁冻干粉制剂及其制备方法。

[0007] 在本发明中，乌司他丁单位被定义为：2μg胰蛋白酶活性被抑制50％时的乌司他丁的量为1个单位。

[0008] 一个方面，本发明提供了一种乌司他丁冻干粉制剂，该冻干粉制剂的配方，每1000支：乌司他丁2500万单位～10000万单位、甘露醇1～30g、氯化钠0～10g、磷酸二氢钠0～5g和磷酸氢二钠0～5g。

[0009] 本发明所述的乌司他丁冻干粉制剂的孔隙率为96.1%～98.2%，优选为98.2%。本发明所述的乌司他丁冻干粉制剂中，甘露醇的用量优选为5g。

[0010] 另一方面，本发明还提供了上述乌司他丁冻干粉制剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

[0011] ⑴.按照上述配方用量称取甘露醇、氯化钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠于配液桶中，用温度为2～4℃注射用水搅拌至溶解；加入医用活性炭搅拌混匀后，使用0.45μm滤膜过滤脱碳，并保持温度为2～4℃，此溶液为辅料溶液；用2～4℃的注射用水溶解上述配方量的乌司他丁，并与上述2～4℃辅料溶液混合均匀，得到药液A，下述步骤⑵-⑸中涉及的所有药液均保持在2～4℃；

[0012] ⑵.用盐酸或氢氧化钠溶液调节上述药液A的pH值至5.5～6.0，得到药液B；

[0013] ⑶.用2～4℃注射用水将上述药液B补足体积至1500mL，混匀，得到药液C；

[0014] ⑷.采用0.22μm滤膜对药液C进行两次过滤除菌，得到冻干前药液D；

[0015] ⑸.分装冻干前药液D，半加塞，于冻干机中冷冻干燥。

[0016] 本发明所述制备方法中步骤⑴中溶解乌司他丁所用注射用水以及辅料溶液的温度优选为2～3℃，或3～4℃，进一步优选为4℃。

[0017] 本发明所述制备方法中步骤⑴中0.45μm滤膜过滤脱碳的次数为1～3次，优选为2次。

[0018] 本发明所述制备方法中步骤⑴中医用活性炭的平均粒径为2～5µm，优选为3～4µm，进一步优选为4µm。

[0019] 本发明所述制备方法步骤⑵中药液A的pH值优选为6.0。

[0020] 本发明所述制备方法步骤⑸中所述冷冻干燥包括以下步骤：

[0021] ①.第一阶段预冻：冻干前药液D温度为2～4℃，搁板温度为0～4℃进箱；以3～5℃/min的降温速率将冻干机降温至-25～-22℃，保温1.5～2小时；

[0022] ②.第二阶段预冻：以0.3～0.6℃/min的降温速率将冻干机降温至-30～-27℃，保温1.5～2小时；

[0023] ③.第三阶段预冻：以3～5℃/min的降温速率将冻干机降温至-38～-32℃，保温1.5～2小时；

[0024] ④.一次干燥：将冷凝温度降至-45～-40℃，抽真空至10Pa以下，以0.6～0.8℃/min的速度将冻干机温度升至10～15℃，保温至冰晶消失，然后继续保温1.5～2小时；

[0025] ⑤.二次干燥：以0.8～1℃/min的速度将冻干机温度升至28～32℃，计时保温3～4小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

[0026] 本发明所述制备方法中步骤⑸所述冷冻干燥优选包括以下步骤：

[0027] ①.第一阶段预冻：冻干前药液D温度为2～3℃，搁板温度为0～2℃进箱；以3～4℃/min的降温速率将冻干机降温至-22～-23℃，保温1.5～2小时；

[0028] ②.第二阶段预冻：以0.3～0.4℃/min的降温速率将冻干机降温至-29～-27℃，保温1.5～2小时；

[0029] ③.第三阶段预冻：以3～4℃/min的降温速率将冻干机降温至-35～-32℃，保温1.5～2小时；

[0030] ④.一次干燥：将冷凝温度降至-43～-40℃，抽真空至10Pa以下，以0.6～0.7℃/min的速度将冻干机温度升至10～13℃，保温至冰晶消失，然后继续保温1.5～2小时；

[0031] ⑤.二次干燥：以0.8～0.9℃/min的速度将冻干机温度升至28～30℃，计时保温3～4小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

[0032] 本发明所述制备方法步骤⑸中所述冷冻干燥还可以优选包括以下步骤：

[0033] ①.第一阶段预冻：冻干前药液D温度为3～4℃，搁板温度为2～4℃进箱；以4～5℃/min的降温速率将冻干机降温至-23～-25℃，保温1.5～2小时；

[0034] ②.第二阶段预冻：以0.4～0.6℃/min的降温速率将冻干机降温至-29～-30℃，保温1.5～2小时；

[0035] ③.第三阶段预冻：以4～5℃/min的降温速率将冻干机降温至-35～-38℃，保温1.5～2小时；

[0036] ④.一次干燥：将冷凝温度降至-43～-45℃，抽真空至10Pa以下，以0.7～0.8℃/min的速度将冻干机温度升至13～15℃，保温至冰晶消失，然后继续保温1.5～2小时；

[0037] ⑤.二次干燥：以0.9～1℃/min的速度将冻干机温度升至30～32℃，计时保温3～4小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

[0038] 与现有技术相比，本发明提供的乌司他丁冻干粉制剂的制备方法具有以下特点：

[0039] ⑴.本发明先利用2～4℃的注射用水配制除乌司他丁以外的辅料溶液，并保温在这一温度范围内，再利用2～4℃的注射用水溶解乌司他丁，然后与配制好的辅料溶液混合。乌司他丁作为一种生物活性蛋白质，对温度敏感，而实际配置过程中辅料溶解需要一定时间，如果将乌司他丁与辅料一起溶解，其中的活性成分乌司他丁存在发生变性的可能性。发明人发现在配制冻干前药液时使用2～4℃的低温环境，并将辅料溶液与乌司他丁分开溶解，对乌司他丁现配现用，能够有效减少药液配置过程中乌司他丁的活性损失，从而提高其稳定性。

[0040] ⑵.预冻时降温速率越快，溶液的成核速率越快，越容易形成尺寸较小的细晶，冻干后复溶性越好，但干燥速率较慢，对于蛋白质原料来说不利于其活性的保持；预冻时降温速率越慢，越容易形成大颗粒冰晶，虽然复溶性相对较低，但有利于加快干燥速率，防止活性成分失效。目前冻干粉针剂在制备时为了提高复溶性，通常采用快速一步预冻。本发明在冷冻干燥的预冻过程中采用“快-慢-快”的三步预冻方式，一方面加快了乌司他丁冻干粉的干燥速率，减少其活性降低的可能性；另一方面，提高了乌司他丁冻干粉制剂的复溶性能。因此，利用本发明提供的配方与制备方法制备的乌司他丁冻干粉制剂，复溶性能与稳定性优异，均明显高于市售乌司他丁冻干粉针剂。

具体实施方式

[0041] 本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明的内容，并不对本发明的内容构成限制。

[0042] 实施例1：一种乌司他丁冻干粉制剂

[0043] 所述乌司他丁冻干粉制剂的配方为，每1000支：乌司他丁2500万单位，甘露醇1g，磷酸二氢钠0.17g，磷酸氢二钠0.32g。

[0044] 所述乌司他丁冻干粉制剂的制备方法为：

[0045] ⑴.按配方用量称取甘露醇、氯化钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠于配液桶中，用温度为2℃注射用水搅拌至溶解；加入平均粒径为2μm的医用活性炭搅拌混匀后，使用0.45μm滤膜2次过滤脱碳，并保持温度为2℃，此溶液为辅料溶液；用2℃的注射用水溶解乌司他丁，并与上述2℃辅料溶液混合均匀，得到药液A，下述步骤⑵-⑸中涉及的所有药液均保持在2℃；

[0046] ⑵.用2M盐酸或2M氢氧化钠溶液调节步骤⑴所得药液A的pH值至5.5，得到药液B；

[0047] ⑶.用2℃注射用水将步骤⑵所得药液B补足体积至1500mL，混匀，得到药液C；

[0048] ⑷.0.22μm滤膜对步骤⑶所得药液C进行两次过滤除菌，得到冻干前药液D；

[0049] ⑸.分装步骤⑷所得药液D，半加塞；于冻干机中冷冻干燥：

[0050] ①.第一阶段预冻：冻干前药液D温度为2℃，搁板温度为0℃进箱；以3℃/min的降温速率将冻干机降温至-22℃，保温1.5小时；

[0051] ②.第二阶段预冻：以0.3℃/min的降温速率将冻干机降温至-27℃，保温1.5小时；

[0052] ③.第三阶段预冻：以3℃/min的降温速率将冻干机降温至-32℃，保温1.5小时；

[0053] ④.一次干燥：将冷凝温度降至-40℃，抽真空至10Pa以下，以0.6℃/min的速度将冻干机温度升至10℃，保温至冰晶消失，然后继续保温1.5小时；

[0054] ⑤.二次干燥：以0.8℃/min的速度将冻干机温度升至28℃，计时保温4小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

[0055] 实施例2：一种乌司他丁冻干粉制剂

[0056] 所述乌司他丁冻干粉制剂的配方为，每1000支：乌司他丁5000万单位，甘露醇5g，氯化钠1g，磷酸二氢钠0.34g，磷酸氢二钠0.64g。

[0057] 所述乌司他丁组合物冻干粉针剂的制备方法为：

[0058] ⑴.按照上述配方用量称取甘露醇、氯化钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠于配液桶中，用温度为3℃注射用水搅拌至溶解；加入平均粒径为4μm的医用活性炭搅拌混匀后，使用0.45μm滤膜2次过滤脱碳，并保持温度为3℃，此溶液为辅料溶液；用3℃的注射用水溶解乌司他丁，并与上述3℃辅料溶液混合均匀，得到药液A，下述步骤⑵-⑸中涉及的所有药液均保持在3℃；

[0059] ⑵.用2M盐酸或2M氢氧化钠溶液调节步骤⑴所得药液A的pH值至5.8，得到药液B；

[0060] ⑶.用3℃注射用水将步骤⑵所得药液B补足体积至1500mL，混匀，得到药液C；

[0061] ⑷.0.22μm滤膜对药液C进行两次过滤除菌，得到冻干前药液D；

[0062] ⑸.分装药液D，半加塞，于冻干机中冷冻干燥：

[0063] ①.第一阶段预冻：冻干前药液D温度为3℃，搁板温度为2℃进箱；以4℃/min的降温速率将冻干机降温至-23℃，保温1.5小时；

[0064] ②.第二阶段预冻：以0.4℃/min的降温速率将冻干机降温至-29℃，保温1.5小时；

[0065] ③.第三阶段预冻：以4℃/min的降温速率将冻干机降温至-35℃，保温1.5小时；

[0066] ④.一次干燥：将冷凝温度降至-43℃，抽真空至10Pa以下，以0.7℃/min的速度将冻干机温度升至13℃，保温至冰晶消失，然后继续保温1.5小时；

[0067] ⑤.二次干燥：以0.9℃/min的速度将冻干机温度升至30℃，计时保温3.5小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

[0068] 实施例3：一种乌司他丁冻干粉制剂

[0069] 所述乌司他丁冻干粉制剂的配方为，每1000支：乌司他丁10000万单位，甘露醇10g，氯化钠5g，磷酸二氢钠0.51g，磷酸氢二钠0.93g。

[0070] 所述乌司他丁冻干粉制剂的制备方法为：

[0071] ⑴.按照上述配方用量称取甘露醇、氯化钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠于配液桶中，用温度为4℃注射用水搅拌至溶解；加入平均粒径为5μm的医用活性炭搅拌混匀后，使用0.45μm滤膜２次过滤脱碳，并保持温度为4℃，此溶液为辅料溶液；用4℃的注射用水溶解乌司他丁，并与上述4℃辅料溶液混合均匀，得到药液A，下述步骤⑵-⑸中涉及的所有药液均保持在４℃；

[0072] ⑵.用2M盐酸或2M氢氧化钠溶液调节步骤⑴所得药液A的pH值至6.0，得到药液B；

[0073] ⑶.用4℃注射用水将步骤⑵所得药液B补足体积至1500mL，混匀，得到药液C；

[0074] ⑷.0.22μm滤膜对药液C进行两次过滤除菌，得到冻干前药液D；

[0075] ⑸.分装药液D，半加塞，于冻干机中冷冻干燥：

[0076] ①.第一阶段预冻：冻干前药液D温度为4℃，搁板温度为4℃进箱；以5℃/min的降温速率将冻干机降温至-25℃，保温2小时；

[0077] ②.第二阶段预冻：以0.6℃/min的降温速率将冻干机降温至-30℃，保温2小时；

[0078] ③.第三阶段预冻：以5℃/min的降温速率将冻干机降温至-38℃，保温1.5小时；

[0079] ④.次干燥：将冷凝温度降至-45℃，抽真空至10Pa以下，以0.8℃/min的速度将冻干机温度升至15℃，保温至冰晶消失，然后继续保温2小时；

[0080] ⑤.次干燥：以1℃/min的速度将冻干机温度升至32℃，计时保温3小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

[0081] 实施例4：复溶性能对比试验

[0082] 考察本发明中实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂与市售乌司他丁冻干粉针剂的复溶性能，结果如下表：

[0083] 表1 乌司他丁冻干粉制剂复溶性能对比

[0084]

[0085] 本发明涉及的实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂的孔隙率在96.1%～98.2%之间，溶解速度≤4s，且溶解后澄清度良好。

[0086] 孔隙率测定方法：取实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂以及市售乌司他丁冻干粉针剂各一支，采用孔隙率仪测定粉末的孔隙率。

[0087] 复溶速度测定方法：取实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂以及市售乌司他丁冻干粉针剂各一支，用50毫升5%葡萄糖注射液溶解，用计时器记录从加入溶液到完全溶解所用时间。

[0088] 溶解后澄清度判定方法：对比完全溶解后的药液与5%葡萄糖等渗溶液的澄清度。

[0089] 实施例5：存放稳定性对比试验

[0090] 考察本发明涉及的实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂与市售乌司他丁冻干粉针剂在温度为30℃、相对湿度为75%的条件下存放过程中的稳定性，结果如下表：

[0091] 表2 乌司他丁冻干粉制剂存放稳定性对比结果

[0092]

[0093] 本发明涉及的实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂在温度为30℃、相对湿度为75%的条件下，存放6个月乌司他丁活性几乎不变，溶解速度≤4s，能够保持无菌；存放8个月，乌司他丁活性残留率>96%，溶解速度≤5s，能够保持无菌；存放24个月后，乌司他丁活性残留率>93%，溶解速度≤6s，能够保持无菌。本发明涉及的实施例所述乌司他丁冻干粉制剂在温度为30℃、相对湿度为75%的条件下的稳定性明显高于市售乌司他丁粉针剂。

[0094] 试验方法：

[0095] 取实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂以及市售乌司他丁冻干粉针剂各一支在温度为30℃、相对湿度为75%的条件下放置。在试验期间第0、6、12、18、24个月末分别取样，对复溶速度、是否无菌以及乌司他丁活性残留率进行测定。

[0096] 复溶速度测定方法：取供试样品1支，用50毫升5%葡萄糖等渗溶液溶解，用计时器记录从加入溶液到完全溶解所用时间。

[0097] 无菌检测方法：采用2005版《中华人民共和国药典》中推荐的薄膜过滤法进行无菌检测。

[0098] 乌司他丁活性残留率测定：

[0099] 按照下式计算乌司他丁的活性残留率：活性残留率＝放置x个月后的活性/放置0个月的活性×100％，x为0、6、12、18、24个月。

[0100] 采用以下方法测定乌司他丁的活性：

[0101] 1.溶液配制

[0102] 标准品溶液：精密称取乌司他丁标准品适量，加0.2M三乙醇胺缓冲液配制成浓度为50单位/1mL的乌司他丁标准品溶液。

[0103] 上述0.2M乙醇胺缓冲液的配制方法：称取三乙醇胺29.8g，加蒸馏水900ml溶解，用4M盐酸溶液调pH值至7.8，加蒸馏水定容至1000mL，摇匀，即得。

[0104] 待测品溶液：精密称取本发明涉及地实施例1-6和对比例1-6所述乌司他丁注射液适量，加0.2M三乙醇胺缓冲液配制成浓度为50单位/1mL的乌司他丁待测品溶液。

[0105] 结晶胰蛋白酶溶液：精密称取结晶胰蛋白酶适量，加预冷氯化钙盐溶液制成浓度为0.1mg/1mL的结晶胰蛋白酶溶液，该溶液现配现用，且于4℃保存。

[0106] 上述胰蛋白酶的纯度为：7500-10000BAEE单位/1mg蛋白。

[0107] 上述氯化钙盐溶液的配制方法：称取氯化钙2.94g，加0.001M盐酸溶液1000mL溶解即得。

[0108] 苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐溶液：称取苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐适量，加蒸馏水制成浓度为1mg/mL的溶液，该溶液现配现用，并置暗处保存。

[0109] 2.测定方法

[0110] 取0.2M三乙醇胺缓冲液1.6mL，预热至25±0.1℃后，加至比色池中；加标准品溶液0.2mL，加结晶胰蛋白酶溶液0.2mL，混匀，25±0.1℃保温5分钟；加预热至25±0.1℃的苯甲酰-L-精氨酸-P-对硝基苯胺盐酸盐溶液1.0mL，立即计时并摇匀；以蒸馏水作为空白对照，依照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV)在405nm波长处测定吸光度，测定时间间隔为1分钟，共测定5分钟，吸光度的变化率应恒定。以反应时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，求出每1分钟的吸光度变化率(ΔAs)。

[0111] 取0.2M三乙醇胺缓冲液1.6mL，预热至25±0.1℃后，加至比色池中；加0.2M三乙醇胺缓冲液0.2mL，加结晶胰蛋白酶溶液0.2mL，混匀，25±0.1℃保温5分钟；加预热至25±0.1℃的苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐溶液1.0mL，立即计时并摇匀；以蒸馏水作为空白对照，依照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV)在405nm波长处测定吸光度，测定时间间隔为1分钟，共测定5分钟，吸光度的变化率应恒定。以反应时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，求出每1分钟的吸光度变化率(ΔA0)。

[0112] 取0.2M三乙醇胺缓冲液1.6mL，预热至25±0.1℃后，加至比色池中；加待测品溶液0.2mL，加结晶胰蛋白酶溶液0.2mL，混匀，25±0.1℃保温5分钟；加预热至25±0.1℃的苯甲酰-L-精氨酸-P-对硝基苯胺盐酸盐溶液1.0mL，立即计时并摇匀；以蒸馏水作为空白对照，依照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV)在405nm波长处测定吸光度，测定时间间隔为1分钟，共测定5分钟，吸光度的变化率应恒定。以反应时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，求出每1分钟的吸光度变化率(ΔAt)。

[0113] 按下式计算每1mg供试品中乌司他丁的单位数：

[0114] U/mg=[(ΔA0-ΔAt)/(ΔA0-ΔAs)]·B/W

[0115] 其中：ΔA0为三乙醇胺缓冲液对照管吸光度的变化；

[0116] ΔAt为待测品溶液吸收度的变化率；

[0117] ΔAs为标准品溶液吸收度的变化率；

[0118] B为每1mL标准品溶液中含乌司他丁单位数。

[0119] W为每1mL供试品溶液中含待测品的mg数。

[0120] 实施例6：模拟体温下的稳定性对比试验

[0121] 考察本发明涉及的实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂与市售乌司他丁冻干粉针剂在模拟体温，即36.7℃时的稳定性，结果如下表：

[0122] 表3 乌司他丁冻干粉制剂在36.7℃下的稳定性对比结果

[0123]

[0124] 本发明涉及的实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂在模拟体温下，即36.7℃时，无论利用5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液作为溶剂，均能在40分钟内保持>92%的乌司他丁活性残留率。而市售乌司他丁粉针剂，在同样条件下，乌司他丁活性残留率不足65%。人体内血液循环速度约为25秒一个循环，因此，本发明提供的乌司他丁冻干粉制剂能够在一定时间内在人体内保持相对更高的活性。

[0125] 试验方法：

[0126] 取实施例1-3所述乌司他丁冻干粉制剂以及市售乌司他丁冻干粉针剂各两支，一支用50毫升5％葡萄糖注射液溶解，一支用50毫升0.9％氯化钠注射液溶解。将上述溶液在36.7℃下放置，分别在0分钟、10分钟、20分钟、40分钟时取样，按下式计算乌司他丁的活性残留率：活性残留率＝放置x小时后的活性/放置0小时的活性×100％，x为0、10、20、40分钟。

[0127] 乌司他丁活性测定方法同实施例5。