一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法

摘要

一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法，属于分子生物学领域，所述方法利用化学法和超声波破碎物理学方法相结合获得卵母细胞中含有的总RNA，并保证RNA完整性，可以用于下一步基因克隆、mRNA表达和高通量测序等研究。本发明在微量卵母细胞中加入1ml RNAiso Plus，可有效去除卵母细胞中核糖体等成分；分别在加入氯仿和异丙醇后，离心时间均延长了5min，有利于去除蛋白质等，并提高所获的RNA纯度与质量。

权利要求

1.半滑舌鳎卵母细胞总RNA提取方法，其特征在于它的具体步骤如下：

1)半滑舌鳎卵母细胞样品超声波破碎

①取于-80℃保存在无RNA酶1.5mL EP管中的半滑舌鳎成熟卵母细胞30粒，迅速将EP管安放于用液氮预冷的EP管盒中，加入1ml RNAiso Plus；

②超声波处理器用之前将变幅杆及超声破碎头用焦碳酸二乙酯水溶液浸泡24h，然后高压灭菌，消除RNA酶污染；

③将盛有半滑舌鳎成熟卵母细胞的无RNA酶EP管转移至冰水混合的EP管盒中，超声波处理器变幅杆浸入RNAiso Plus深度为1.0cm，探头要居中，不要贴壁；

④连接电源，设定处理器超声模式，Pattern键是选择超声波模式键，按Pattern键设定

4s超声和4s间隔，超声五次；然后设定1s超声和1s间隔，超声十次；总用时为60秒；确保门关闭后，ON启动超声操作，用完后，OFF关闭仪器；

⑤将匀浆化样品移到新无RNA酶EP管，室温静置10min，以12000g转速4℃离心5min，吸取上清液700ul，移入新的无RNA酶EP管中，切勿吸取沉淀；

2)总RNA的提取

①在上述离心管中加入RNAiso Plus1/5体积的氯仿，样品剧烈振荡20s，溶液无分相现象后，再室温静置10min，以12000g转速4℃离心20min；从离心机取出离心管，此时样品分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取上清液，转移至另一新的无RNA酶EP管中；切勿吸入中间蛋白层；

②加入等体积预冷的异丙醇，使用涡旋混匀器充分混匀，室温静置15min；以12000g转速4℃离心15min，管底出现沉淀；

3)RNA沉淀清洗

小心弃去上清，缓慢地沿EP管壁加入1ml75％的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤EP管的管壁，以12,000g转速，4℃离心10min后除净乙醇；

4)RNA溶解与检测

室温干燥沉淀2-5min，加入20ul的RNase-free水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后、放于-80℃保存。

说明书

一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法。技术背景

[0002] 卵母细胞是一类重要的生殖细胞，其良好的发育和成熟是雌性动物繁殖能力的重要指征。要想得到更多优质的卵母细胞，就要了解雌性动物卵母细胞发育过程的分子调控机理。纯度高、完整性好的卵母细胞总RNA是采用实时荧光定量RT-PCR技术或基于微量RNA的高通量测序技术分析卵母细胞的分子机理的非常重要的前提条件。RNA提取即将细胞破碎裂解，利用相关试剂去除多糖、酚类、蛋白质及DNA等的污染，通过一系列的抽提、洗涤和沉淀，最终获得纯净RNA。常用的提取总RNA的方法包括Trizol试剂快速提取法、RNAiso Plus试剂快速提取法、强变性剂法、热硼酸盐法及改良热硼酸盐法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法等。RNAiso Plus是广谱型总RNA提取试剂，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。RNAiso Plus试剂提取法也是一种较成熟的提取总RNA的方法，但该方法有一定局限性，特别是对于提取鱼类卵母细胞的总RNA样品时，存在提取步骤繁琐、样品转移损失严重直接导致提取浓度低、纯度差等问题。而且与体细胞相比，在卵母细胞发生过程中有大量的蛋白质、核糖体和其它细胞成分聚集以支持早期胚胎发育，这些物质也影响到提取的RNA质量。因此，需要建立一种快速简便、总RNA纯度高、杂质少、得率大，易于操作，便于掌握的微量鱼类卵母细胞总RNA提取的方法，以满足相应的分子生物学实验。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题在于提供一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法，[0004] 以提高母细胞总RNA的提取效率和提取质量，同时增加获得母细胞总RNA的总量，以满足分子生物学试验的需要。

[0005] 本发明是通过如下技术方案来实现的：

[0006] 一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法，包括以下步骤：

[0007] 1)鱼卵母细胞样品超声波破碎

[0008] 取出-80℃保存卵母细胞，迅速放于用液氮预冷的无RNA酶EP管中，加入1mL RNAiso Plus，所述的EP管放置于冰水混合物中，提前将超声破碎头部分用焦碳酸二乙酯水溶液浸泡24h，然后高压灭菌，消除RNA酶污染，超声波处理器变幅杆浸入RNAiso Plus深度为0.8-1.2cm,依据实验样品发育阶段，进行超声波模式设定，超声处理后，将裂解匀浆液转移至无RNA酶EP管中，室温静置10min，以12000g转速4℃离心5min，吸取上清液，移入新的无RNA酶EP管中；

[0009] 2)总RNA的提取

[0010] 向上述裂解匀浆液中加入RNAiso Plus的1/5体积氯仿，样品剧烈振荡至溶液无分相现象后，再室温静置4-7min，以12000g转速4℃离心20min从离心机取出离心管，此时样品分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；取上清液转移至另一新的无RNA酶EP管中；加入等体积预冷的异丙醇，使用涡旋混匀器充分混匀，15-30℃静置，以12000g转速4℃离心15min，管底出现沉淀；

[0011] 3)RNA沉淀清洗

[0012] 小心弃去步骤2)最后一次离心的上清液，缓慢地沿管壁加入75％乙醇1ml洗涤沉淀，以12000g转速4℃离心5min，除去乙醇，得到RNA沉淀。

[0013] 4)RNA溶解

[0014] 室温干燥步骤3)得到的RNA沉淀，加入RNase-free水,60℃水浴5min后放置在碎冰上，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

[0015] 本发明的原理是：

[0016] 高丰度、高纯度、高完整性的卵母细胞RNA提取是在严格避免RNA酶污染情况下，利用化学法和超声波破碎物理学方法相结合获得卵母细胞中含有的总RNA，并保证RNA完整性，可以用于下一步基因克隆、mRNA表达和高通量测序等研究。本发明在微量卵母细胞(约30粒)中加入1ml RNAiso Plus，可有效去除卵母细胞中核糖体等成分；分别在加入氯仿和异丙醇后，离心时间均延长了5min，有利于去除蛋白质等，并提高所获的RNA纯度与质量。

[0017] 本发明优点和积极效果如下：

[0018] 1)本发明提取方法，可以提取不同种属、不同发育时相的鱼类卵母细胞中的总RNA,也可以提取不同发育时期受精卵的总RNA等，应用范围广泛。

[0019] 2)用超声波破碎仪破碎卵母细胞，代替研钵研磨样品，裂解细胞充分，具有快速简便，提取的RNA纯度高特点；并且在含有RNAiso Plus的离心管内完成细胞破碎，省去以往研钵研磨后样品干粉末直接暴漏在空气中并转移到离心管的步骤，减少了RNA降解和RNA酶污染，具有RNA损失少等优点，提高了获得的总RNA质量。

附图说明

[0020] 图1为半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)成熟卵母细胞(30粒)提取总RNA的电泳图谱。M为DNA分子量标准，大小从上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

[0021] 图2为斑马鱼(Danio rerio)卵黄生成后期的卵母细胞(30粒)提取的总RNA的电泳图谱。M为DNA分子量标准，大小从上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

[0022] 图3为半滑舌鳎成熟卵母细胞(60粒)研磨方法提取的总RNA的电泳图谱。M为DNA分子量标准，大小从上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

具体实施方式

[0023] 下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释，但是本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

[0024] 实施例1

[0025] 半滑舌鳎卵母细胞总RNA提取实验：

[0026] 1)半滑舌鳎卵母细胞样品超声波破碎

[0027] ①取于-80℃保存在无RNA酶EP管(1.5mL)中的半滑舌鳎成熟卵母细胞，约30粒，迅速将EP管安放于用液氮预冷的EP管盒中，加入1ml RNAiso Plus。

[0028] ②超声波处理器用之前将变幅杆特别是超声破碎头用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡24h，然后高压灭菌，消除RNA酶污染。

[0029] ③将盛有半滑舌鳎成熟卵母细胞的无RNA酶EP管转移至冰水混合的EP管盒中，超声波处理器变幅杆浸入RNAiso Plus深度为1.0cm左右，探头要居中，不要贴壁。

[0030] ④连接电源，设定处理器超声模式，Pattern键是选择超声波模式键，按Pattern键设定4s超声和4s间隔，超声五次；然后设定1s超声和1s间隔，超声十次；总用时为60秒。确保门关闭后，ON启动超声操作。用完后，OFF关闭仪器。

[0031] ⑤将匀浆化样品移到新无RNA酶EP管，室温静置10min，以12000g转速4℃离心5min，吸取上清液约700ul，移入新的无RNA酶EP管中，切勿吸取沉淀。

[0032] 2)总RNA的提取

[0033] ①在上述离心管中加入RNAiso Plus1/5体积的氯仿(约200ul)，样品剧烈振荡20s，溶液无分相现象后，再室温静置10min。以12000g转速4℃离心20min。从离心机取出离心管，此时样品分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；
吸取上清液(约300ul)，转移至另一新的无RNA酶EP管中；切勿吸入中间蛋白层。

[0034] ②加入等体积(约300ul)预冷的异丙醇，使用涡旋混匀器充分混匀，室温静置15min。以12000g转速4℃离心15min，管底出现沉淀。

[0035] 3)RNA沉淀清洗

[0036] 小心弃去上清，缓慢地沿EP管壁加入1ml75％的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤EP管的管壁，以12,000g转速，4℃离心10min后除净乙醇。

[0037] 4)RNA溶解与检测

[0038] 室温干燥沉淀2-5min，加入20ul的RNase-free水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后、放于-80℃保存。使用Nanodrop ND-1000检测提取的总RNA吸光度260nm/280nm比值的平均值为2.08，表明RNA纯度较好。提取的总RNA的平均浓度为9.37ug/ul，总RNA的提取量为187.4ug。电泳检测RNA完整性见图2，清楚看到二条条带包括
28SrRNA和18SrRNA，初步判定RNA完整性较好。

[0039] 实施例2

[0040] 斑马鱼卵母细胞总RNA提取实验

[0041] 1)斑马鱼卵母细胞样品超声波破碎

[0042] ①取于-80℃保存在无RNA酶EP管(1.5mL)中的斑马鱼卵黄生成后期的卵母细胞，约30粒，迅速将EP管安放于用液氮预冷的EP管盒中，加入1ml RNAiso Plus。

[0043] ②超声波处理器用之前将变幅杆特别是超声破碎头用DEPC水浸泡24h，然后高压灭菌，消除RNA酶污染。

[0044] ③将盛有斑马鱼卵母细胞的无RNA酶EP管转移至冰水混合的EP管盒中，超声波处理器变幅杆浸入RNAiso Plus深度为1.0cm左右，探头要居中，不要贴壁。

[0045] ④连接电源，设定处理器超声模式，Pattern键是选择超声波模式键，按Pattern键可设定8s脉冲超声和8s间隔，超声三次；然后设定1s超声和1s间隔，超声六次；总用时为60秒。确保门关闭后，ON启动超声操作。用完后，OFF关闭仪器。

[0046] ⑤将匀浆液转移至新的无RNA酶EP管中，室温静置10min。以12000g转速4℃离心5min，小心吸取上清液(约700ul)，移入新的无RNA酶EP管中，切勿吸取沉淀。

[0047] 2)总RNA的提取

[0048] ①在上述离心管中加入RNAiso Plus1/5体积的氯仿(约200ul)，剧烈振荡15s，小心管盖突然弹开。待溶液充分乳化后，再室温静置5min。以12,000g转速，4℃离心15min。从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液(300ul左右)转移至另一新的无RNA酶EP管中，切勿吸出白色中间层。

[0049] ②向上清液中加入等体积(约300ul)预冷的异丙醇，上下颠倒EP管充分混匀后，在20-30℃下静置10min。以12,000g转速，4℃离心10min。一般离心后，管底会出现沉淀。

[0050] 3)RNA沉淀清洗

[0051] 小心弃去上清，缓慢地沿EP管壁加入1ml75％的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤EP管的管壁，12,000g 4℃离心5min后小心弃去乙醇，尽量除净乙醇。

[0052] 4)RNA溶解与检测

[0053] 室温干燥沉淀2-5min，加入20ul的RNase-free水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。使用Nanodrop ND-1000检测提取的总RNA吸光度260nm/280nm比值的平均值为2.10，表明RNA纯度较好。提取的总RNA的平均浓度为8.24ug/ul，总RNA的提取量为164.8ug。电泳检测RNA完整性见图2，清楚看到二条条带包括28SrRNA和18SrRNA，初步判定RNA完整性较好。

[0054] 实施例3

[0055] 半滑舌鳎卵母细胞总RNA提取实验—普通研磨方法：

[0056] 1)半滑舌鳎卵母细胞样品研磨和匀浆

[0057] ①取于-80℃冻存在无RNA酶EP管(1.5mL)中的半滑舌鳎成熟卵母细胞约60粒，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨卵粒，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；

[0058] ②将研磨成粉末状的样品用无RNA酶的小铁勺，从研钵壁上全部刮取下来，然后移入到含有1mL RNAiso Plus的玻璃匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。

[0059] ③将匀浆化样品移到新无RNA酶EP管，室温静置5min；然后以12000g转速4℃离心5min。

[0060] ④吸取上清液约500ul，移入新的无RNA酶EP管中，切勿吸取沉淀。

[0061] 2)总RNA的提取

[0062] ①在上述离心管中加入RNAiso Plus1/5体积的氯仿(约200ul)，样品剧烈振荡1min，溶液无分相现象后，再室温静置10min。以12000g转速4℃离心15min。从离心机取出离心管，此时样品分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；
吸取上清液(约220ul)，转移至另一新的无RNA酶EP管中，切勿吸入中间蛋白层。

[0063] ②加入等体积(约220ul)预冷的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置10min。以12000g转速4℃离心10min，管底出现沉淀。

[0064] 3)RNA沉淀清洗

[0065] 小心弃去上清，缓慢地沿EP管壁加入1ml75％的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤EP管管壁，以12,000g转速，4℃离心5min后小心弃去乙醇，尽量除净乙醇。

[0066] 4)RNA溶解与检测

[0067] 室温干燥沉淀2-5min，加入20ul的RNase-free水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后、放于-80℃保存。使用Nanodrop ND-1000检测提取的总RNA吸光度260nm/280nm比值的平均值为1.83，表明提取RNA中蛋白质等杂质的污染比较明显。提取的总RNA的平均浓度为5.15ug/ul，总RNA的提取量为103ug。电泳检测RNA完整性见图3，第一、三、四加样孔有亮带初步判定提取的RNA样品可能有杂质，第二个泳道提取RNA样品有降解。