一种控制高粱芒有无基因SbAn-1以及SNP突变位点和应用

摘要

本发明公开了一种控制高粱有芒无芒基因SbAn‑1的功能，属于分子生物学和高粱育种领域，本发明的控制高粱有无基因SbAn‑1是通过全基因组关联分析所获得，该技术能够一次性检测到多个核苷酸多态位点，从而有利于大批量地挖掘与简单性状的基因。选择基因以PCR技术为基础，可以直接用于高粱芒的有无基因SbAn‑1及其等位基因的鉴别，从而实现分子标记辅助育种。

权利要求

1.一种控制高粱芒有无的基因SbAn-1，其特征在于：其核苷酸序列为SEQNO.1: ATGTTGCGGTATTGGTAAGAAGACCGATTTATATACATATAATGATTAAAAAAATATAATGTGAATATTTCCC TCAGCAACTAAAATATATAATTTGGATATATATACAGAGGGACAAAAGACTGATATTTTCCCGACAAGCTGTATATT TAACAATTAGAAAGACGAATAAAATGTAGGGCCACAATTTTTTGTTTTATATTTATGGAATCATTAACATGTATGGT ATGGTGTGGTGGACAACTTCAGTTGCCCTACCTCTTGACATAACATGGTACACTTTTTTTGAGAGAACCAAGAAAGT TCAAGGAACAAGTCAAAAAAGCCTTTGTGTGTCTCTATGCGTAAACAAGGCTTACCTTCACTTCAAAACAGTCGGAA TTGAAGATAGCTTTGTGTCCTAAGCATGAGGCTATATAGCCTGTGGAGGTTTTGCCCAATCAAGACAGCCTCAACCC CAAAGCCACTCTATGGCATCAAGTTCAACCACACAGGATGCCAACAATGGTGTTAGGCATGACAACAACCTCCTGCC CATTGCCAACGTTGGGCGGATCATGAAGGATGCCCTCCCTCCACAGGCCAAGATTTCAAAGCATGCTAAGGAGACCA TCCAGGAGTGTGCAACTGAGTTTGTGGGCTTCGTCACTGGCGAGGCCTCCGAGCGGTGCCGCCGAGAGCGGCGGAAG ACCATCAACGGTGATGACATCTGTCATGCTATGAGGAGCCTTGGCCTCGACCACTACGCCGACTCCATGCACAGGTA CCTGCAGAGGTATCGCGAGACTGAGGAGCTAGCGGCAACACTCAACAACGGCGGCGGCGGCCGTGATGGACGGGCCA TTCAGATTGATGTGAGGGCTGAGCTGTCCATTTTCAAGGGCAGCAACCAGCAAGATGGTAGAGACTAA。

2.如权利要求1所述的一种控制高粱芒有无的基因SbAn-1，其特征在于：由引物对 Sb03g045130F和Sb03g045130R从高粱基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经电泳检测测序后，区分高粱芒的有无；所述引物对的核苷酸序列如下所示： 上游引物：Sb03g045130F，ATGGCATCAAGTTCAACCACACA 下游引物：Sb03g045130R，TTAGTCTCTACCATCTTGCTGGTTG。

3.如权利要求1所述的一种控制高粱芒有无的基因SbAn-1的应用，其特征在于：包括对高粱种质资源的筛选和鉴定，以及作为分子标记辅助育种。

说明书

一种控制高粱芒有无基因SbAn-1以及SNP突变位点和应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及保护控制高粱有芒无芒基因SbAn-1和该基因的应用，属于分子生物学和高粱育种领域。

背景技术

[0002] 高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)属于单子叶植物纲禾本科高粱属，是一年生高大草本植物，表皮覆盖蜡质，具典型的C4植物特化光合作用器官、高光合效率功能和高产潜力，具有耐旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱，种植面积在世界粮食作物中占第5位(前4位依次为玉米、小麦、水稻、大麦)，主要分布在非洲、亚洲、美洲的干旱和半干旱地区，是世界上最古老的栽培作物之一。高粱的主要产物籽粒除用作食品和饲料外，还可以制酒、制淀粉、制醋、制饴糖等。因为穗的各项表型特征都有可能影响到高粱籽粒的产量，所以与穗型相关的研究在高粱各项研究中占很大比例。芒是高粱上的性状之一，并且高粱芒位于小花内稃顶端中肋延伸而成，位于籽粒最顶部，接受充足的光能和CO2，并且防止鸟类的侵害，可间接提高籽粒的收获量。

[0003] 全基因组关联分析(Genome-wideAssociationStudy，GWAS)是一种对全基因组范围内的常见遗传变异(单核苷酸多态性和拷贝数)总体关联分析的方法，它能够在全基因组范围内进行整体研究，能够一次性对疾病进行轮廓性概览，适用于复杂疾病的研究。在全基因组层面上，开展大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，可以全面揭示疾病发生、发展与治疗相关的遗传基础。与图位克隆法(map-basedcloning)相比，全基因组关联分析具有以下几个方面优点：1)GWAS研究不再需要在研究之前构建任何假设；2)可用自然群体，无需一定是遗传群体，大大缩短了研究年限；3)能够一次性通过监测成千上万个SNPs，对全基因组范围内整体研究；4)GWAS研究的精度大大提高，例如由玉米的作图精度10-30cM(Salvi，2005)提高到GWAS的精度1500bp(Remington，2001)。随着基因组测序技术的提高及测序成本的降低，并结合生物信息学的高度发展，GWAS成为挖掘和剖析高粱有无芒基因及其相关遗传机制最有效的方法之一。

[0004] 芒是禾本科植物主要性状之一，基因组内发生何种变化导致芒的有无及长短等的变化呢？早在1898年，就有人对禾谷类作物的芒进行过研究，发现其具有气孔且可以固定CO2，相继禾谷类作物中大麦和水稻的芒基因研究则较多。2011年，Hu等精细定位水稻芒相关基因Awn4.1到第4号染色体一个330kb的区间范围内；2013年，Luo等克隆到基因SbAn-1，并证实该基因不仅控制水稻芒的有无，还影响水稻籽粒的数量和形状。2015年孙传清教授课题组发现，控制野生稻长、刺芒的基因LABA1(LONG AND BARBED AWN 1)，位于水稻第4染色体长臂上，编码一个细胞分裂素激活酶。该基因在芒原基的特异表达提高了芒原基活性细胞分裂素含量，增强了芒原基细胞分裂活性，最终引起芒的伸长和芒刺形成。高粱芒基因的精细定位国内外均鲜见报道，在2014年翟国伟等精细定位在第3条染色体115Kb范围内，但没有克隆到基因。

发明内容

[0005] 为解决上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种控制高粱芒的有无基因SbAn-1功能。

[0006] 本发明的另一目的在于提供上述控制高粱有芒或无芒的SbAn-1基因的检测方法。

[0007] 本发明的再一目的在于提供上述控制高粱芒的有无基因SbAn-1的应用。

[0008] 本发明目的是通过如下技术方案来实现的：

[0009] 本发明公开了一种控制高粱芒的有无基因SbAn-1，以BTx623参考基因组来看，当无芒时为Sobic.003G417700该基因正常序列，而有芒高粱该基因发生三个位点的突变，第一个点72367561，T突变为C即TTT(苯丙氨酸)突变为TTC(苯丙氨酸)为同义突变，另外两个位点发生了非同义突变。非同义突变SNP位点位于高粱基因组3号染色体第72367415位核苷酸和72367368位核苷酸，该两个位点核苷酸分别由G突变为A，C突变为T，氨基酸分别都由精氨酸(Arg/R)突变为组氨酸(His/H)和半胱氨酸(Cys/C)，由引物对Sb03g045130F和Sb03g045130R从高粱基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经电泳检测测序后，与区分高粱芒的有无。

[0010] 所述引物对的核苷酸序列如下所示：

[0011] 上游引物：Sb03g045130F  ATGGCATCAAGTTCAACCACACA

[0012] 下游引物：Sb03g045130R  TTAGTCTCTACCATCTTGCTGGTTG

[0013] 所述的控制高粱芒的有无基因SbAn-1鉴定方法，包含以下步骤：

[0014] (1)通过常规PCR法扩增，获得高粱有芒无芒基因SbAn-1基因序列；

[0015] (2)利用多序列比对软件工具(如MegAlign或DNAMAN软件)，将步骤(1)所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到高粱有芒无芒基因SbAn-1所特异的3处单碱基差异，该差异位于该基因的外显子，最终导致功能特异性氨基酸的改变；

[0016] (3)对步骤(2)所获得的序列在不同的高粱自然群体中进行验证，从而确定高粱芒的有无基因SbAn-1的功能。经测定有芒样品236份和无芒高粱样品182份，有芒和无芒的基因序列三个位点发生突变从而区分高粱种质的有芒或无芒，该基因的功能正确率达72％以上。为了进一步证实该基因SbAn-1为控制芒的有无基因，利用有芒L361和无芒BTx623的F1表型为无芒，杂交后代F2代高粱株系，867株F2单株中，无芒为654株，有芒213株，卡方检验表明，F2群体中无芒与有芒单株数量符合3:1分离模型。从F1单株表型和F2群体的表型分离情况可以判定，本研究中双亲芒性受一核质单基因控制，且无芒对有芒为显性。该SbAn-1基因在这些F2群体中所有654株的该基因三个突变位点SNP为杂合(TC,AG,CT)或未突变(T,G,C)，213株有芒样品全部为纯合的(C,A,T)。因此，我们确定该基因SbAn-1即为控制芒的有无的功能。

[0017] 进一步的，所述SbAn-1的PCR扩增反应体系如下：

[0018] 高粱基因组DNA 1ul,上下游引物各1ul，2×Taq PCR Master Mix 12.5ul,ddH2O 9.5ul总体积25ul；

[0019] 反应在BIO-RAD T100TM Thermal cycler PCR仪进行扩增，反应流程如下：94℃预变性3分种；94℃30秒、55℃30秒、72℃50秒，34个循环；72℃5分种；4℃保存。

[0020] 所述高粱芒的有无基因SbAn-1的应用，包括对高粱种质资源的筛选和鉴定，以及作为分子标记辅助育种。

[0021] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的控制高粱有无基因SbAn-1是通过全基因组关联分析所获得，该技术能够一次性检测到多个核苷酸多态位点，从而有利于大批量地挖掘与简单性状的基因。选择基因以PCR技术为基础，可以直接用于高粱芒的有无基因SbAn-1及其等位基因的鉴别，从而实现分子标记辅助育种。

附图说明

[0022] 图1为全基因组关联分析cMLM方法获得高粱芒的有无基因定位的Mahattan图；

[0023] 图2为全基因组关联分析获得不同分析方法获得的QQ-plot图；

[0024] 图3为具有该基因功能特异性SNP的高粱芒有无基因SbAn-1的CDS序列比对图；

[0025] 图4为无芒BTx623与有芒L361高粱基因组SbAn-1氨基酸比对图。

[0026] 图5为具有该基因功能特异性SNP的高粱芒有无基因SbAn-1的氨基酸比对图；

[0027] 图6为高粱芒基因SbAn-1分离群体中的测序图。

[0028] 实施例1

[0029] 控制高粱芒的有无基因SbAn-1以BTx623参考基因组来看，当无芒时为Sobic.003G417700该基因正常序列，而有芒高粱该基因发生三个位点的突变，第一个点72367561，T突变为C即TTT(苯丙氨酸)突变为TTC(苯丙氨酸)为同义突变，另外两个位点发生了非同义突变。非同义突变SNP位点位于高粱基因组3号染色体第72367415位核苷酸和
72367368位核苷酸，该两个位点核苷酸分别由G突变为A，C突变为T，氨基酸分别都由精氨酸(Arg/R)突变为组氨酸(His/H)和半胱氨酸(Cys/C)，由引物对Sb03g045130F和Sb03g045130R从高粱基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经电泳检测测序后，与区分高粱芒的有无。

[0030] 所述引物对的核苷酸序列如下所示：

[0031] 上游引物：Sb03g045130F  ATGGCATCAAGTTCAACCACACA

[0032] 下游引物：Sb03g045130R  TTAGTCTCTACCATCTTGCTGGTTG

[0033] 所述的控制高粱芒的有无基因SbAn-1鉴定方法，包含以下步骤：

[0034] (1)通过常规PCR法扩增，获得高粱有芒无芒基因SbAn-1基因序列；_________________________________________________________________________[0035] (2)利用多序列比对软件工具(如MegAlign或DNAMAN软件)，将步骤(1)所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到高粱有芒无芒基因SbAn-1所特异的3处单碱基差异，该差异位于该基因的外显子，最终导致功能特异性氨基酸的改变；

[0036] _____________________________________________________________________[0037] (3)对步骤(2)所获得的序列在不同的高粱自然群体中进行验证，从而确定高粱芒的有无基因SbAn-1的功能。经测定有芒样品236份和无芒高粱样品182份，有芒和无芒的基因序列三个位点发生突变从而区分高粱种质的有芒或无芒，该基因的功能正确率达72％以上。为了进一步证实该基因SbAn-1为控制芒的有无基因，利用有芒L361和无芒BTx623的F1表型为无芒，杂交后代F2代高粱株系，867株F2单株中，无芒为654株，有芒213株，卡方检验表明，F2群体中无芒与有芒单株数量符合3:1分离模型。从F1单株表型和F2群体的表型分离情况可以判定，本研究中双亲芒性受一核质单基因控制，且无芒对有芒为显性。该SbAn-1基因在这些F2群体中所有654株的该基因三个突变位点SNP为杂合(TC,AG,CT)或未突变(T,G,C)，213株有芒样品全部为纯合的(C,A,T)。因此，我们确定该基因SbAn-1即为控制芒的有无的功能。图4注释:BTx623，9-5，L180为无芒，L361，L007，8-10位有芒。

[0038] _____________________________________________________________________[0039] BTx623样品序列Genomic Sequence 911bp第3染色体

[0040] >Sobic.003G417700|Chr03:72367285..72368195reverse蓝色区域为CDS区[0041] ATGTTGCGGTATTGGTAAGAAGACCGATTTATATACATATAATGATTAAAAAAATATAATGTGAATATTTCCCTCAGCAACTAAAA

[0042] TATATAATTTGGATATATATACAGAGGGACAAAAGACTGATATTTTCCCGACAAGCTGTATATTTAACAATTAGAAAGACGAATAA

[0043] AATGTAGGGCCACAATTTTTTGTTTTATATTTATGGAATCATTAACATGTATGGTATGGTGTGGTGGACAACTTCAGTTGCCCTAC

[0044] CTCTTGACATAACATGGTACACTTTTTTTGAGAGAACCAAGAAAGTTCAAGGAACAAGTCAAAAAAGCCTTTGTGTGTCTCTATGC

[0045] GTAAACAAGGCTTACCTTCACTTCAAAACAGTCGGAATTGAAGATAGCTTTGTGTCCTAAGCATGAGGCTATATAGCCTGTGGAGG

[0046] TTTTGCCCAATCAAGACAGCCTCAACCCCAAAGCCACTCTATGGCATCAAGTTCAACCACACAGGATGCCAACAATGGTGTTAGGC

[0047] ATGACAACAACCTCCTGCCCATTGCCAACGTTGGGCGGATCATGAAGGATGCCCTCCCTCCACAGGCCAAGATTTCAAAGCATGCT

[0048] AAGGAGACCATCCAGGAGTGTGCAACTGAGTTTGTGGGCTTCGTCACTGGCGAGGCCTCCGAGCGGTGCCGCCGAGAGCGGCGGAA

[0049] GACCATCAACGGTGATGACATCTGTCATGCTATGAGGAGCCTTGGCCTCGACCACTACGCCGACTCCATGCACAGGTACCTGCAGA

[0050] GGTATCGCGAGACTGAGGAGCTAGCGGCAACACTCAACAACGGCGGCGGCGGCCGTGATGGACGGGCCATTCAGATTGATGTGAGG

[0051] GCTGAGCTGTCCATTTTCAAGGGCAGCAACCAGCAAGATGGTAGAGACTAA

[0052] 上游引物：Sb03g045130F  ATGGCATCAAGTTCAACCACACA   退火温度69.8[0053] 下游引物：Sb03g045130R  TTAGTCTCTACCATCTTGCTGGTTG  退火温度67.4[0054] 所述SbAn-1的PCR扩增反应体系如下：高粱基因组DNA 1ul,上下游引物各1ul，2×Taq PCR Master Mix 12.5ul,ddH2O 9.5ul总体积25ul；反应在BIO-RAD T100TM Thermal cycler PCR仪进行扩增，反应流程如下：94℃预变性3分种；94℃30秒、55℃30秒、72℃50秒，34个循环；72℃5分种；4℃保存。