幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒

摘要

本申请涉及幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒。具体而言，本申请涉及一种胶乳增强免疫比浊法测定人血清、血浆样本中幽门螺杆菌抗体含量的试剂盒，其包含反应缓冲液、交联有幽门螺杆菌抗原的胶乳颗粒和校准品。本申请的试剂盒利用交联在胶乳颗粒表面的幽门螺杆菌抗原与样本中的幽门螺杆菌抗体发生免疫反应形成浊度，通过浊度的上升程度来检测幽门螺杆菌抗体含量。本申请的试剂盒能应用于临床常用的生化分析仪器，操作简便、快速、特异性强。试剂盒稳定性得到提高，灵敏度和检测范围均能满足临床应用的要求。

权利要求

1.一种制备天然来源的幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒的方法，包括步骤：

1)将0.5mL浓度为按重量/体积计10％的直径150nm聚苯乙烯胶乳溶液加入4.5mL的

0.05M MES缓冲液pH6.0中；再加入0.5mg/ml的交联剂EDAC，活化30分钟；

2)将含有0.2％氨基修饰的PEG-20000的0.5mg幽门螺杆菌抗原用5mL 0.05M MES缓冲液pH6.0稀释；

3)将步骤2)所得溶液立即加入到步骤1)所得溶液中，在37℃反应3小时；

4)加入1mL 0.1M的甘氨酸缓冲液pH7.0搅拌1h终止反应，离心去掉上清；

5)用33mL 50mM的甘氨酸缓冲液pH8.0洗涤3次；

6)收获包被有抗原的胶乳颗粒；

其中所述步骤1)和步骤2)的顺序可互换。

说明书

幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒

技术领域

[0001] 本公开涉及医学免疫体外诊断领域；提供了一种利用免疫比浊方法测定人血清、血浆样本中幽门螺杆菌抗体含量的试剂盒。

背景技术

[0002] 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)由巴里·马歇尔(Barry J.Marshall)和罗宾·沃伦(J.Robin Warren)在1983年首次报道发现。此二人因此获得2005年的诺贝尔生理学或医学奖。

[0003] 幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的格兰氏阴性菌，长2.5-4.0μm，宽0.5-1.0μm。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。幽门螺杆菌对营养要求高，且需要在厌氧的条件下生长，体外难于培养，环境氧要求5至8％，在大气或绝对厌氧环境下不能生长。

[0004] 幽门螺杆菌可产生多种毒力因子，如尿素酶、粘附素、蛋白酶、细胞毒素和内毒素。其中，尿素酶被认为不仅是重要的致病因子，而且是幽门螺杆菌最有效的抗原，可在感染者体内诱发很强的免疫应答。

[0005] 幽门螺杆菌对临床微生物实验中常用于鉴定肠道细菌的大多数经典生化实验不起反应。氧化酶、触酶、尿素酶、碱性磷酸酶、r－谷氨酰转肽酶、亮氨酸肽酶这七种酶反应是作为幽门螺杆菌生化鉴定的依据。

[0006] 幽门螺杆菌进入胃后，借助鞭毛提供动力穿过黏液层。研究表明，幽门螺杆菌在粘稠的环境下具有极强的运动能力，强动力性是幽门螺杆菌致病的重要因素。幽门螺杆菌到达上皮表面后，通过粘附素牢牢地与上皮细胞连接在一起，避免随食物一起被胃排空。并分泌过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶，以保护其不受中性粒细胞的杀伤作用。幽门螺杆菌富含尿素酶，通过尿素酶水解尿素产生氨，在菌体周围形成“氨云”保护层，以抵抗胃酸的杀灭作用。HP感染胃进入十二指肠后，在正常粘膜上不断繁殖，逐渐侵害粘膜，出现褶皱和肥厚，抑制胃液及十二指肠液的正常分泌，破坏了粘膜正常的防御功能。尿素酶能迅速水解尿素后产生大量氨，氨能够直接或间接地使粘膜细胞受损，导致胃及十二指肠的病变。

[0007] 幽门螺旋杆菌感染普遍存在，发展中国家70-90％人群携带，发达国家是50％，通常是在儿童时期开始的，携带HP的人群中1-10％会发生病变。幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。

[0008] 目前幽门螺杆菌的诊断检测方法包括侵入性和非侵入性两大类。侵入性方法需通过内镜获取活组织进行检测，主要包括细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验和药敏试验。而非侵入性方法则不需进行内镜检查，主要包括：

[0009] (1)C13和C14尿素呼气试验(UBT)，幽门螺杆菌产生的尿素酶可将内源性或外源性尿素分解成NH3和CO2，后者在小肠上段吸收，进入血后随呼气排出。口服一定量的C13和C14尿素后，通过高灵敏度质谱仪或液闪仪分别测定呼气中C13和C14的量可判断有无幽门螺杆菌感染。C13为稳定同位素，无放射性，但价格昂贵；C14为放射性同位素，辐射量较小，也有较高的安全性，其价格较廉，但孕妇及儿童仍不宜采用，且大规模使用可能给环境污染带来隐患。尿素呼气试验有较高的敏感性和特异性，但仍受诸如药物、上消化道出血、胃内其它产生尿素酶细菌等因素影响，可能出现假阴性或假阳性。该法还受临界值高低的影响，因此临界值的确定非常重要；此外，也受服药至呼气收集间隔时间长短的影响，得到被检者的配合亦很重要。

[0010] (2)15N尿氨排泄试验，口服含15N尿素后，利用15N尿素可被幽门螺杆菌产生的尿素酶分解产生NH3和CO2，NH3经吸收在肝脏代谢而经尿中排出的原理，通过色质联用仪器检测尿中15N尿氨而判断有否幽门螺杆菌感染。该法无创、无放射性，敏感性和特异性高，但检测结果受机体吸收、代谢、排泄等众多因素干扰，且设备昂贵，临床应用受到一定限制。

[0011] (3)粪便幽门螺杆菌抗原检测，由于定居在胃上皮细胞表面的幽门螺杆菌，随着胃粘膜上皮的快速更新脱落，幽门螺杆菌也随之脱落，并通过胃肠道从粪便排出。幽门螺杆菌粪便抗原检测试检采用酶联免疫分析双抗体夹心法和化学发光免疫分析法等，能够特异性诊断人体内幽门螺杆菌感染。该方法操简便、省时、不需昂贵仪器，适用于婴幼儿、儿童幽门螺杆菌感染的检测，幽门螺杆菌根治疗效评价，以及幽门螺杆菌感染的流行病学调查等。

[0012] (4)血清及分泌物抗体检测，幽门螺杆菌菌体表面存在多种抗原，如尿素酶、脂多糖、粘附素等。这些抗原均可刺激宿主产生免疫反应，产生IgG、IgA、IgM抗体。传统的血清学检测主要是检测可长期存在于血清中的IgG抗体。常用的方法主要有酶联免疫吸附法、免疫酶试验、免疫印迹技术、胶乳凝集试验、化学发光检测等。尿液、唾液等分泌物抗体检测方法，取样简便，无痛苦，其敏感性、特异性与血清学试验相似，但结果可能会受某些因素影响。

[0013] 传统的检测幽门螺杆菌抗体的方法，存在自动化程度低、手工操作、耗时长的缺点。因此，提供一种特异性检测人血清、血浆中幽门螺杆菌抗体，同时能够应用到自动化仪器上的试剂盒成为非常之需。

发明内容

[0014] 本公开的第一方面涉及一种测定幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其包含：

[0015] 1)R1试剂；

[0016] 2)R2试剂；以及任选地

[0017] 3)校准品；

[0018] 所述R1试剂包括缓冲液、稳定剂、促凝剂和防腐剂；

[0019] 所述R2试剂包含幽门螺杆菌抗原包被的胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂；

[0020] 所述校准品包含幽门螺杆菌抗体、缓冲液、稳定剂和防腐剂。

[0021] 在一些实施方式中，胶乳颗粒是一种核壳结构；乳核是聚苯乙烯聚合物，乳壳由苯乙烯、丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸共聚物组成。在一些实施方式中，胶乳颗粒是聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0022] 在一些实施方式中，所述胶乳颗粒表面带有选自以下的化学基团：硫酸基、磺酸基、羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基及其组合。

[0023] 在一些实施方式中，所述胶乳颗粒直径范围为50至150nm(含端点值)；包括但不限于50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150nm、以及上述任意两个数值之间的范围。在一些具体的实施方式中，所述胶乳颗粒的粒径是150nm。此处应当强调的是，在本申请的上下文中“150nm”并不是指试剂中的每一个胶乳颗粒的粒径都刚好是150nm。实际上，150nm是一个统计学意义上的数值；由于胶乳颗粒在制造过程中是存在误差的，因此150nm规格的胶乳颗粒是指粒径范围在150nm左右，例如140至160nm范围内，再比如145至155nm范围内。

[0024] 在一些实施方式中，所述胶乳颗粒的浓度为0.025％至0.25％(按重量/体积计)。例如，0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25％以及上述任意两个数值之间的范围。在一些具体的实施方式中，幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒的浓度为按重量/体积计0.15％。

[0025] 在一些实施方式中，幽门螺杆菌抗原选自：幽门螺杆菌全菌体蛋白抗原、尿素酶B亚单位(UreB)、幽门螺杆菌粘附素(HpaA)、空泡毒素(VacA)、细胞毒素相关蛋白(CagA)、热休克蛋白(HspB)、鞭毛蛋白A亚蛋位(FlaA)、B亚单位(FlaB)及其组合。可以通过本领域公认的细菌培养后提取制备上述抗原，也可以购买商品化的产品，例如Calbioreagents、Biospacific等提供的抗原。

[0026] 在一些实施方式中，所述幽门螺杆菌抗原可以通过物理吸附或化学偶联结合在胶乳颗粒表面。优化，化学偶联交联方法将幽门螺杆菌抗原结合在胶乳颗粒表面上。

[0027] 在一些实施方式中，所述R1、R2和校准品中的缓冲液各自独立地选自：3-[N,N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液及其组合。在一些实施方式中，缓冲液的浓度是10-200mM；包括但不限于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM、以及上述任意两个数值之间的范围。在一些实施方式中，缓冲液的pH为7至8，例如7.2、7.3、7.4、7.5。R1、R2和校准品中的缓冲液类型可以相同或不同；R1、R2和校准品中的缓冲液浓度可以相同或不同。R1、R2和校准品中的缓冲液pH可以相同或不同。

[0028] 在一些实施方式中，试剂R1、R2和校准品中的稳定剂各自独立地选自：按重量/体积计0.1％-5％的牛血清白蛋白(优选0.5％至1％)、按重量/体积计1％-10％浓度范围的蔗糖、按重量/体积计0.5％-1％浓度范围的氯化钠、2-50mM的EDTA(优选10至20mM，)、按重量/体积计0.1％-1％浓度范围的吐温-20(优选0.1％-0.5％；更优选0.1％-0.2％)、按重量/体积计1％-10％浓度范围的丙三醇、及其组合。R1、R2和校准品中的稳定剂类型可以相同或不同；R1、R2和校准品中的稳定剂浓度可以相同或不同。

[0029] 在一些实施方式中，试剂R1、R2和校准品中的防腐剂各自独立地选自：叠氮钠、硫柳汞、苯酚、乙基汞硫代硫酸钠及其组合。在一些实施方式中，防腐剂浓度是0.02％-0.1％按重量/体积计；例如0.05％至0.15％。R1、R2和校准品中的防腐剂类型可以相同或不同；R1、R2和校准品中的防腐剂浓度可以相同或不同。

[0030] 在一些实施方式中，所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000、葡聚糖T-40、葡聚糖T-70、葡聚糖T-500及其组合。促凝剂浓度范围是1％-10％按重量/体积计；例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、以及上述任意两个数值之间的范围。

[0031] 在一些实施方式中，通过在缓冲液中添加已知浓度的幽门螺杆菌抗体来制备校准品。在一些实施方式中，校准品包含至少两个浓度的幽门螺杆菌抗体；例如包含至少5个浓度的幽门螺杆菌抗体，例如但不限于0、10、20、40、70、100U/ml。

[0032] 在一些具体的实施方式中，所述的测定幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒包含：

[0033] R1包含：

[0034] 0.9％按重量/体积计氯化钠、

[0035] 2％按重量/体积计PEG-8000、

[0036] 1％按重量/体积计BSA、

[0037] 10mM EDTA、

[0038] 0.09％按重量/体积计叠氮钠、

[0039] 50mM HEPES缓冲液pH7.2；

[0040] R2包含：

[0041] 幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒0.15％按重量/体积计、

[0042] 150mM的甘氨酸缓冲液pH7.5、

[0043] 0.9％按重量/体积计氯化钠、

[0044] 0.5％按重量/体积计BSA、

[0045] 10mM EDTA、

[0046] 0.1％按重量/体积计吐温20、

[0047] 按重量/体积计0.09％叠氮化钠，

[0048] 其中所述聚苯乙烯胶乳颗粒直径为150nm，

[0049] 所述的幽门螺杆菌抗原是幽门螺杆菌全菌体蛋白抗原；

[0050] 校准品包含：

[0051] 浓度分别为0、10、20、40、70、100U/ml的幽门螺杆菌抗体、

[0052] 0.9％按重量/体积计氯化钠、

[0053] 1％按重量/体积计BSA、

[0054] 10mM EDTA、

[0055] 0.1％按重量/体积计叠氮钠、

[0056] 50mM HEPES缓冲液pH7.2。

[0057] 根据本公开的另一方面，提供一种制备幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒的方法，包括步骤：

[0058] 1)提供聚苯乙烯胶乳颗粒；

[0059] 2)提供幽门螺杆菌抗原；

[0060] 3)在PEG-20000存在的条件下，将幽门螺杆菌抗原交联至聚苯乙烯胶乳颗粒上；

[0061] 4)获得幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒；

[0062] 步骤1)和步骤2)可互换。

[0063] 在一些实施方式中，在缓冲液中提供聚苯乙烯胶乳颗粒。在一些实施方式中，缓冲液为pH 5至6.5的MES缓冲液；浓度为0.02至0.5M，例如0.05至0.01M；例如0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35M的缓冲液。在一些实施方式中，在缓冲液中提供按重量/体积计0.1％至2.0％的聚苯乙烯胶乳颗粒；例如0.1％、0.2％、
0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.5％、1.8％、2.0％；优选
0.5％至1.5％，更优选0.8％至1.2％。在一些实施方式中，聚苯乙烯胶乳颗粒的直径范围为
50至150nm；包括但不限于50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150nm、以及上述任意两个数值之间的范围。

[0064] 在一些实施方式中，在缓冲液中提供幽门螺杆菌抗原。在一些实施方式中，缓冲液为pH 5至6.5的MES缓冲液；浓度为0.02至0.5M，例如0.05至0.01M；例如0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35M的缓冲液。在一些实施方式中，幽门螺杆菌抗原在缓冲液中的浓度是0.05至0.5mg/ml，例如0.05、0.06、0.07、0.08、
0.09、0.1、0.12、0.13、0.14、0.15、0.2、0.25、0.30、0.35mg/ml，优选0.05至0.2mg/ml。

[0065] 在一些实施方式中，在PEG-20000存在的条件下，将幽门螺杆菌抗原交联至聚苯乙烯胶乳颗粒上。所述的PEG-20000是氨基修饰的PEG-20000。氨基修饰的PEG-20000的浓度是按重量/体积计0.05％至0.15％，优选0.1％。

[0066] 在一些实施方式中，幽门螺杆菌抗原和聚苯乙烯胶乳颗粒在28至40℃交联反应1至4小时，优选在37℃反应2至3.5小时。

[0067] 任选地，步骤3)之后终止交联反应；优选通过0.1M pH7.0的甘氨酸缓冲液终止交联反应，优选地反应进行0.5至1.5小时。

[0068] 任选地，在终止反应步骤之后，冲洗胶乳颗粒。优选地，用50mM pH8.0的甘氨酸缓冲液冲洗胶乳颗粒，获得幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0069] 提供一种制备幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒的方法，包括步骤：

[0070] 1)在0.02M至0.1M pH 5.0至6.5的MES缓冲液中，提供按重量/体积计0.5％至1.5％的聚苯乙烯胶乳颗粒；

[0071] 2)在含有0.1％至0.5％氨基修饰性PEG-20000的0.02M至0.1M pH5.0至6.5的MES缓冲液中，提供0.05mg/ml至0.2mg/ml的幽门螺杆菌抗原；

[0072] 3)将步骤1)的溶液和步骤2)的溶液按照体积比1:1混合，在28℃至40℃，幽门螺杆菌抗原和聚苯乙烯胶乳颗粒交联反应1至4小时；

[0073] 4)任选地，终止交联反应；

[0074] 5)任选地，冲洗交联反应之后所得的颗粒；

[0075] 6)获得幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0076] 在具体的实施方式中，提供一种制备幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒的方法，包括步骤：

[0077] 1)将直径150nm的聚苯乙烯胶乳溶液溶于0.05M pH6.0的MES缓冲液，使得浓度为按重量/体积计1％；

[0078] 2)提供含有按重量/体积计0.2％氨基修饰性PEG-20000和0.1mg/ml幽门螺杆菌抗原的0.05M pH6.0的MES缓冲液，

[0079] 3)将步骤1)和步骤2)所得的溶液按照体积比1:1混合，在37℃反应3小时；

[0080] 4)加入0.1M pH7.0的甘氨酸缓冲液终止反应1h，离心去掉上清；

[0081] 5)用50mM pH8.0的甘氨酸缓冲液对步骤4)所得的胶乳颗粒洗涤1至3次；

[0082] 6)收获幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒；

[0083] 其中步骤1)和步骤2)可互换；

[0084] 其中所述的聚苯乙烯胶乳颗粒粒径为150nm。

[0085] 根据本公开的另一方面，提供一种幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒，其是通过本公开的方法制备获得的。

[0086] 根据本公开的另一方面，提供一种检测试剂，其包含本公开所述的幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0087] 根据本公开的另一方面，提供本公开的幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒在制备检测试剂中的用途。

[0088] 根据本公开的另一方面，提供一种测定幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，所述试剂盒包含采用本公开的方法所制备的幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0089] 不限于具体理论，本公开提供了一种优化的交联方法，通过加入特定浓度的氨基化修饰的PEG-20000，利用PEG-20000吸水特性，在胶乳表面形成好的水化层，从而使得所制作的R2试剂反应特异性和存放稳定性得到提高。

[0090] 在特定的反应体系中，幽门螺杆菌抗原包被的胶乳颗粒悬浮液与人血清、血浆中的幽门螺杆菌抗体发生抗原抗体反应形成一定的浊度，能够被分光光度计检测到，通过测定反应后体系浊度的上升程度来进行幽门螺杆菌抗体定量分析。

具体实施方式

[0091] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本公开，本领域技术人员公知，在不背离本公开精神的情况下，可以对本公开做出许多修改，这样的修改也落入本公开的范围。

[0092] 下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

[0093] 实施例

[0094] 实施例1：幽门螺杆菌抗体试剂盒1的制备

[0095] 1.制备R1试剂

[0096] 在50mM pH7.2的HEPES缓冲液中，添加按重量/体积计0.9％的氯化钠、按重量/体积计5％的PEG-8000、按重量/体积计1％的BS、10mM EDTA、按重量/体积计0.1％叠氮钠，搅拌均匀为R1试剂。

[0097] 2.制备R2试剂

[0098] 直径150nm的聚苯乙烯胶乳溶液(浓度10％按重量/体积计)(购自Merck)0.5mL，加入4.5mL的0.05M MES缓冲液(pH6.0)，再加入0.5mg/ml的交联剂EDAC(购自Merck)活化30分钟；

[0099] 将0.5mg幽门螺杆菌抗原(购自Calbioreagents)用5mL 0.05M MES缓冲液(pH6.0)稀释后，立即加入到上述胶乳溶液中，在37℃反应3小时；

[0100] 加入1mL 0.1M的甘氨酸缓冲液(pH7.0)搅拌1h来终止反应，离心去掉上清；

[0101] 用33mL 50mM的甘氨酸缓冲液(pH8.0)洗涤3次，收获包被有抗原的胶乳颗粒；

[0102] 用33ml含有按重量/体积计0.9％氯化钠、10mM EDTA、按重量/体积计0.5％BSA、按重量/体积计0.1％吐温20、按重量/体积计0.09％叠氮钠的150mM pH7.5的甘氨酸缓冲液，将包被有抗原的胶乳颗粒分散成乳白色悬浮液，制备成R2试剂；

[0103] 最终R2试剂中幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒浓度为按重量/体积计0.15％。

[0104] 3.制备校准品

[0105] 在50mM pH7.2的HEPES缓冲液中，加入浓度分别为0、10、20、40、70、100U/ml的幽门螺杆菌抗体，另外添加按重量/体积计0.9％氯化钠、按重量/体积计1％的BSA、10mM EDTA、按重量/体积计0.1％叠氮化钠，搅拌均匀为多点校准品。

[0106] 实施例2：幽门螺杆菌抗体试剂盒2的制备

[0107] 1.制备R1

[0108] 试剂R1的制备方法与实施例1中的相同。

[0109] 2.制备R2试剂

[0110] 直径150nm的聚苯乙烯胶乳溶液(浓度10％按重量/体积计)(购自Merck)0.5mL，加入4.5mL的0.05M MES缓冲液(pH6.0)；再加入0.5mg/ml的交联剂EDAC(购自Merck)活化30分钟；

[0111] 将含有0.2％氨基修饰的PEG-20000(购自Pierce)的0.5mg幽门螺杆菌抗原用5mL 0.05M MES缓冲液(pH6.0)稀释后，立即加入到上述胶乳溶液中，在37℃反应3小时；

[0112] 加入1mL 0.1M的甘氨酸缓冲液(pH7.0)搅拌1h来终止反应，离心去掉上清；

[0113] 用33mL 50mM的甘氨酸缓冲液(pH8.0)洗涤3次，收获包被有抗原的胶乳颗粒；

[0114] 用33ml含有按重量/体积计0.9％氯化钠、10mM EDTA、按重量/体积计0.5％BSA、按重量/体积计0.1％吐温20、按重量/体积计0.09％叠氮钠的150mM pH7.5的甘氨酸缓冲液，将包被有抗原的胶乳颗粒分散成乳白色悬浮液，制备成R2试剂；

[0115] 最终R2试剂中幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒浓度为0.15％按重量/体积计。

[0116] 3.校准品的制备与实施例1相同。

[0117] 测试例：

[0118] 测试例1.检测试剂盒的用法

[0119] 以日立7180生化分析仪为例：测定波长570nm，首先加入R1试剂180uL，37℃反应30秒后加入校准品3.5uL，再反应60秒后加入R2试剂60uL，测定反应第10秒、70秒的吸光度值(A1、A2)，计算吸光度差值△A＝A2-A1，每管重复测定2次，将各校准品管2次测得的吸光度差值△A为纵坐标，对应的浓度为横坐标，制作“浓度-吸光度差值”校准曲线，取待测样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中幽门螺杆菌抗体的含量。

[0120] 测试例2.本公开试剂盒与化学发光法检测临床样本的相关性比较

[0121] 用本公开的试剂盒与A公司的化学发光检测试剂盒、B公司的免疫比浊检测试剂盒分别对45例病人样本同时进行检测。

[0122] A公司的试剂盒基本分析原理是，采用捕获法测定血清中幽门螺杆菌抗体水平。用幽门螺杆菌抗原包被微孔板制成固相抗体，血清样本中的幽门螺杆菌抗体会被捕获到，在加入酶标记的抗IgG二抗体，温育后即形成固相包被抗原-幽门螺杆菌抗体-酶标记抗体的复合物，充分洗涤后加入底物，于5-10分钟内测定其发光强度，根据标准曲线即可算出样品中幽门螺杆菌抗体的含量，样品的发光强度值随幽门螺杆菌抗体浓度的增加而升高。

[0123] B公司的试剂盒基本分析原理是，幽门螺杆菌抗原包被的胶乳颗粒与样本中的幽门螺杆菌抗体发生反应，形成浊度，浊度的升高程度与样本中幽门螺杆菌抗体浓度呈正比。

[0124] 与A公司化学发光试剂检测比较计算阴、阳性符合率，检测结果见表1和表2。相比B公司试剂盒，本公开方法制备的试剂盒2同化学发光方法检测临床样本测值相关性良好，阴阳性符合率为89％，高于本公开方法制备的试剂盒1的80％，更高于B公司试剂盒的71％，间接表明本法制备的试剂盒检测特异性更好，能满足临床诊断的应用。

[0125] 表1.本公开试剂盒2和A公司的化学发光试剂盒检测样本相关性

[0126]

[0127]

[0128] 阴阳符合率：89％。

[0129] 表2.本公开试剂盒1和A公司的化学发光试剂盒检测样本相关性

[0130]

[0131]

[0132] 阴阳符合率：80％。

[0133] 表3.B公司试剂盒和A公司的化学发光试剂盒检测样本相关性

[0134]

[0135]

[0136] 阴阳符合率：71％。

[0137] 测试例3.本公开试剂盒与B公司试剂盒的稳定性比较

[0138] 用本公开的试剂盒1、试剂盒2、B公司试剂盒同时监测试剂的长期存放稳定性。检测试剂的空白吸光度和定标吸光度，以空白和定标吸光度变化幅度小于10％作为试剂稳定性合格的标准。

[0139] 从下面数据可以看出，本公开试剂盒1存放12个月后空白吸光度和定标吸光度变化大于10％，B公司试剂盒存放9个月后空白吸光度和定标吸光度变化大于10％，本公开试剂盒2存放18个月后空白吸光度和定标吸光度变化仍小于10％。

[0140] 表4.本公开试剂盒1长期存放稳定性

[0141]

[0142] 表5.本公开试剂盒2长期存放稳定性

[0143]

[0144] 表6.B公司试剂盒长期存放稳定性

[0145]

[0146] 本公开的技术方案与现有技术相比，具有如下特点：

[0147] 1)能够应用在自动生化分析仪器上，检测速度快；

[0148] 2)采用天然抗原偶联胶乳颗粒，与现有应用在生化分析仪上的方法和试剂盒相比，检测特异性强，与化学发光方法具有很高的相关性；采用优化的交联方式交联幽门螺杆菌抗原到胶乳颗粒上，试剂存放稳定性更好。