本发明公开了一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因的检测方法：利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而通过免疫组织化学技术检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况。本发明借助于ISET技术分离富集CTCs，依靠细胞免疫荧光技术鉴定CTCs，克服了单纯ISET技术鉴定CTCs存在的困难和单纯免疫学检测技术存在的假阴性。该技术设备要求不高，方法易于掌握，并能实时监测。通过该技术方法，不用取材乳腺癌组织即可检测到晚期乳腺癌患者PR表达情况。该技术属于微创甚至无创，并能实时检测。
1.一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因非诊断目的的检测方法，其特征在于，利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况；
所述的利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC，步骤如下：
2)将外周血样分别进行预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA，稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10分钟；
3)利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器(2)中，使其依靠重力自然过滤；
4)过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器(3)，PBS冲洗2-3次，外周血循环肿瘤细胞被截留在滤膜(7)上；
所述的鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞，步骤如下：
1)向分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器(3)中加入Cytoperm/Cytofix试剂300μl，固定、穿孔15min；
2)PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入wash buffer 300μl，封闭30min；
3)加入CK8/18/19、CD45一抗混悬液300μl，两种一抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；
4)Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液300μl，两种二抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:500，室温下避光孵育30min；
5)Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入Hoechst 300μl，洗染细胞核5min；
6)PBS漂洗2次，每次3分钟，之后取出滤膜(7)置于载玻片上，滴加10μl抗荧光淬灭封闭液封片；
7)荧光显微镜下2h内观察结果，拍照、记录CTC情况，确定是否存在CTC；
1)外周血过滤后，从过滤装置中取下滤器(3)，打开并移走滤器上口(6)，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器(3)中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜(7)，放置在载玻片上，适当干燥后在显微镜下观察,证实存在CTC；
A、脱色：将上述带有CTC的滤膜(7)从载玻片上取下，置于95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀的脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；
C、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；
D、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；
E、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为2-4μm的薄层切片；
所述的检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况，步骤如下：
1)烤片：CTC蜡块薄层切片在60℃恒温箱中烤片2小时；
3)水化：将切片依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别放置1分钟，自来水、蒸馏水冲洗；
4)抗原修复：将高压锅内的修复液EDTA煮沸，放入切片至完全没入修复液盖上高压锅盖及压力阀，800W加热至高压锅喷气后1.5分钟，离火，将高压锅稍冷却打开锅盖，切片在修复液中自然冷却；
6)去除内源性过氧化物酶：用3％H2O2作用切片10分钟；
9)滴加一抗，4℃冰箱中过夜，然后将其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分钟；
14)自来水冲洗，苏木精染液复染2分钟，盐酸酒精分化，氨水返蓝；
16)75％-95％-100％梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性快干胶封片；
2.根据权利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述的膜过滤装置包括滤器(3)、血样容器(2)、废液缸(5)和铁架台(1)，所述铁架台(1)设有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述血样容器(2)通过支架(13)设置于铁架台(1)上部，血样容器(2)的下方为滤器(3)，滤器(3)通过输液器(4)联通至废液缸(5)，废液缸(5)设置于底座(11)上。
3.根据权利要求2所述的晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述滤器(3)包括滤器上口(6)、滤膜(7)、载滤膜平台(8)和滤器下口(9)，滤膜(7)置于载滤膜平台8上；滤器上口(6)接血样容器(2)，滤器下口(9)通过输液器(4)接废液缸(5)。
4.根据权利要求3所述的晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述滤膜(7)为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔(10)。
晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种检测PR基因的新方法，尤其是通过外周血检测晚期乳腺癌患者PR基因的方法。
背景技术
[0002] 目前作为预后因子的孕激素受体(Progesterone Receptor，PR)是ER的产物，可以引起和增强雌激素对ER的反应，起到促进和协同的作用，其已成为制定乳腺癌患者内分泌治疗方案时最重要的指标，只有ER阳性时，内分泌治疗有效率为50％-60％，如果ER、PR均为阳性时，有效率可高达70％-80％，而同时阴性者有效率为10％。现有的乳腺癌PR的检测需要通过手术或穿刺活检等方式获得原发瘤或转移瘤的肿瘤组织标本，然而不是每一位患者都能获得肿瘤组织样本，而且不能在治疗过程中进行连续的检测，限制了其成为有效的疗效监测指标。但脱落入血的CTC可以给我们提供潜在的实时肿瘤标本，其突变状态同样可以用于指导治疗。
[0003] 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是从实体肿瘤脱落而进入外周血液循环的肿瘤细胞，它存在于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时等特点，被称为“液态活检”。
[0004] 目前CTCs检测的主要方法包括依赖肿瘤相关标志物检测的免疫学检测技术及基于形态学富集的膜过滤技术(Isolating by size of epithelial tumor cells，ISET)。前者是基于细胞表面表达不同抗原标志，将针对肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成肿瘤细胞的特异性识别，借助外加磁场筛选富集CTCs。该技术的优势在于特异度较高，已有商品化的半自动检测设备(CellSearch)；但肿瘤特异性抗原表达的缺失会造成假阴性结果。后者是根据细胞大小的差异，利用过滤的方法将体积较大的肿瘤细胞筛选富集。该技术的优势在于方法简单、价格低廉，分离获得的CTCs具有活性可用于后续研究；但由于缺乏形态学诊断金标准，该富集技术特异性相对较差。
发明内容
[0005] 为了克服传统循环肿瘤细胞检测技术及晚期乳腺癌患者不适宜组织标本取材--进而无法评估患者PR状态的不足，本发明提供了一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因的检测方法：利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而通过免疫组织化学技术检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况。
[0006] 该方法具体步骤如下：
[0007] 一、利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞：
[0008] 1、采集晚期乳腺癌症患者外周血：肘正中静脉10ml，均分为2管编写相同编号后，分别命名为实验1组和实验2组；
[0009] 2、将2管外周血样分别进行预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10分钟；
[0010] 3、利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
[0011] 4、过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器，PBS冲洗2-3次，外周血循环肿瘤细胞被截留在滤膜上。
[0012] 二、利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞：
[0013] 1、向实验1组分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器中加入Cytoperm/Cytofix试剂300μl，固定、穿孔15min；
[0014] 2、PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入wash buffer 300μl，封闭30min；
[0015] 3、加入CK8/18/19、CD45一抗混悬液300μl，两种一抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；
[0016] 4、Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液300μl，两种二抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:500，室温下避光孵育30min；
[0017] 5、Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入Hoechst 300μl，洗染细胞核5min；
[0018] 6、PBS漂洗2次，每次3分钟，之后取出滤膜置于载玻片上，滴加10μl抗荧光淬灭封闭液封片；
[0019] 7、荧光显微镜下2h内观察结果，拍照、记录CTC情况，确定是否存在CTC；如观察到CTC则继续进行下一步检测，否则停止检测。
[0020] 三、运用细胞蜡块技术制作CTC细胞蜡块：
[0021] 1、从过滤装置中取下实验2组相同血样编号的滤器，打开并移走滤器上口，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜，放置在载玻片上，适当干燥后在显微镜下观察,证实存在CTC；
[0022] 2、制作CTC细胞蜡块；
[0023] A、脱色：将上述载玻片上的滤膜取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀；
[0024] B、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用吸水纸包裹；
[0025] C、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；
[0026] D、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；
[0027] E、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为2-4μm的薄层切片。
[0028] 四、通过免疫组织化学技术检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况：
[0029] 1.烤片：切片在60℃恒温箱中烤片2小时；
[0030] 2.脱蜡：切片于两瓶二甲苯中分别放置5分钟；
[0031] 3.水化：将切片依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别放置1分钟(视室内温度情况稍作调整)：自来水、蒸馏水冲洗；
[0032] 4.抗原修复：将高压锅内的修复液EDTA煮沸，放入切片至完全没入修复液盖上高压锅盖及压力阀，800W加热至高压锅喷气后1.5分钟，离火，将高压锅稍冷却打开锅盖，切片在修复液中自然冷却；
[0033] 5.蒸馏水冲洗；
[0034] 6.去除内源性过氧化物酶：用3％H2O2作用切片10分钟；
[0035] 7.蒸馏水冲洗；
[0036] 8.PBS浸洗5次各1.5分钟；
[0037] 9.滴加一抗，4℃冰箱中过夜，然后将其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分钟；
[0038] 10.滴加二抗；
[0039] 11. 37℃水浴锅中孵育20分钟；
[0040] 12.PBS浸洗5次各1.5分钟；
[0041] 13.显微镜下控制，DAB显色；
[0042] 14.自来水冲洗，苏木精染液复染2分钟，盐酸酒精分化，氨水返蓝；
[0043] 15.自来水冲洗5分钟；
[0044] 16. 75％-95％-100％梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性快干胶封片；
[0045] 17.细胞病理学专家阅片，判读PR表达情况。
[0046] 利用细胞免疫荧光技术鉴定外周血循环肿瘤细胞步骤中所述的膜过滤装置：包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。
[0047] 所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。
[0048] 所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔。
[0049] 有益效果：借助于ISET技术分离富集CTCs，依靠细胞免疫荧光技术鉴定CTCs，不仅能够克服单纯ISET技术鉴定CTCs存在的困难，亦能捕获上皮抗原表达减弱或缺失的肿瘤细胞，即克服单纯免疫学检测技术存在的假阴性。同时，该技术设备要求不高，方法易于掌握，并能实时监测，具有临床推广应用可能。通过该技术方法，不用取材乳腺癌组织即可检测到晚期乳腺癌患者PR表达情况。该技术属于微创甚至无创，并能够实时检测。
附图说明
[0050] 图1为本发明的膜过滤装置结构示意图；
[0051] 图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；
[0052] 图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；
[0053] 图4为晚期乳腺癌癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图；
[0054] 图5为晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞免疫组化PR染色图像。
[0055] 图中1.铁架台 2.血样容器 3.滤器 4.输液器 5.废液缸 6.滤器上口 7.滤膜 8.载滤膜平台、9.滤器下口、10.滤孔、11.底座、12.立架、13支架。
具体实施方式
[0056] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0057] 运用此技术方法分离获取并鉴定8例晚期乳腺癌癌患者(同时检测8例正常人样本做阴性对照)外周血循环肿瘤细胞，检测其PR表达情况。
[0058] 一、利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期乳腺癌患者外周血中的CTC：
[0059] 采集晚期乳腺癌患者外周血10ml，均分为2管，同一患者血样编写相同编号，分别命名为实验1组和实验2组；然后将2管外周血样分别进行预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA),稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10分钟；在固定的间期，组装膜过滤分离肿瘤细胞(ISET)简易装置(如图1、2、3所示)；该过滤装置由滤器3、滤膜7、血样容器2、废液缸5、铁架台1构成，利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：用10mlPBS润湿滤器3，然后将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器2中，使其依靠重力自然过滤；过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器3，PBS冲洗2-3次，外周血CTC被截留在滤膜7上。
[0060] 肿瘤细胞直径一般大于15微米，而血细胞(包括红细胞、白细胞)直径一般小于10微米，因此当含有CTC的外周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔10能够被滤过，而CTC因直径大于滤孔10被截留在滤膜7上。
[0061] 二、利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞：
[0062] 向分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器中(实验组1)加入Cytoperm/Cytofix试剂300μl，固定、穿孔15min；PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入wash buffer 300μl，封闭
30min；加入CK8/18/19、CD45一抗混悬液300μl，两种一抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液
300μl，两种二抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:500，室温下避光孵育30min；
Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入Hoechst 300μl，洗染细胞核5min；PBS漂洗2次，每次3分钟，之后取出滤膜置于载玻片上，滴加10μl抗荧光淬灭封闭液封片；荧光显微镜下
2h内观察结果，拍照、记录CTC情况(如实验组1观察到CTC则应用实验组2进行下一步检测)。
[0063] 检测结果：8例健康志愿者均未查到循环肿瘤细胞；在8例晚期乳腺癌患者外周血中有5例检测到CTC存在。
[0064] 三、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：
[0065] 从过滤装置中取下实验2组中检测到CTC编号的滤器3，打开并移走滤器上口6，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器3中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜7，放置在载玻片上，适当干燥后在显微镜下观察,证实存在CTC；
[0066] 将上述载玻片上的滤膜7取下，置于脱色液中浸泡4‐6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀；浸泡结束后取出滤膜7，用吸水纸包裹；将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为2-4μm的薄层切片。
[0067] 四、通过免疫组织化学技术检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况：
[0068] 将获取的石蜡切片应用行免疫组织化学法检测PR基因的表达情况，将切片在60℃恒温箱中烤片2小时，切片于两瓶二甲苯中分别放置5分钟，将切片依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别放置1分钟(视室内温度情况稍作调整)：自来水、蒸馏水冲洗；
[0069] 抗原修复：根据第一抗体说明书及具体实验操作经验，对实验切片使用不同的方法进行抗原修复，本实验使用EDTA(PH＝9.0)高压热修复：在电磁炉上将高压锅内的修复液(EDTA)煮沸，放入切片至完全没入修复液盖上高压锅盖及压力阀，800W加热至高压锅喷气后1.5分钟，离火，将高压锅稍冷却打开锅盖，切片在修复液中自然冷却，然后用蒸馏水冲洗，冲洗后去除内源性过氧化物酶：(采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源性过氧化物酶封闭处理，如果不进行处理，组织中的红细胞、粒细胞会干扰染色结果的判定)本实验用3％H2O2作用切片10分钟，对染色结果集抗原保存都没有影响，封闭效果比较显著，蒸馏水冲洗，PBS浸洗5次各1.5分钟，滴加PR一抗，4℃冰箱中过夜，然后将其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分钟；滴加二抗，37℃水浴锅中孵育20分钟，PBS浸洗5次各1.5分钟，显微镜下控制，DAB显色，自来水冲洗，苏木精染液复染2分钟，盐酸酒精分化，氨水返蓝，自来水冲洗5分钟，75％-95％-100％梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性快干胶封片，2-3名细胞病理学专家阅片，判读PR表达情况。
[0070] 检测结果：8例健康志愿者均未查到循环肿瘤细胞；在8例晚期乳腺癌患者外周血检测到的CTC，其中5例经免疫组化检测到其有PR表达，阳性率为62.5％(表1)。
[0071] 图4为乳腺癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图，其细胞核较大，细胞核形状不规则；高核质比。
[0072] 图5为乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR免疫组化染色图像，细胞膜和细胞浆黄染。根据其染色分布和强度判定阳性程度，细胞着色占细胞小于10％为(-)，着色10％-25％为(+)，着色25％-50％为(++)，着色大于50％为(+++)。表1实施例检测结果(PR)[0073]
