一株分离自叶际的植物促生菌及其菌剂的生产方法

摘要

本发明涉及一株高效植物促生菌——枯草芽孢杆菌，及其菌剂的低成本生产方法和使用方法，属于微生物肥料和节能减排技术领域。本发明采用的菌株是从松树叶片分离筛选出来的一株具有促进植物生长功能的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11菌株，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8188。本发明利用甘薯淀粉废水作为液态发酵培养基，大规模培养枯草芽孢杆菌，并制备农用微生物菌剂，该工艺能耗低、生产成本低廉，操作简单，还可以使甘薯淀粉废水得到资源化利用，减少污染排放。本发明生产的菌剂用于茶叶和蔬菜的生产，不仅可以显著提高产量，而且可以明显改善农产品的品质，显示出广阔的应用前景。

权利要求

1.一种枯草芽孢杆菌农用微生物菌剂的生产方法，包括如下步骤：

(1)甘薯淀粉废水预处理：在高浓度甘薯淀粉废水中按照重量比加入0.1％～1％的草木灰，重复混合均匀，再用石灰水调节废水的pH到7.0～8.5，于95～110℃微波加热3～15分钟；所述草木灰来自于生物质热电厂的固态废弃物，其主要成分为碳酸钾；

(2)液体种子制备：向装有预处理好的甘薯淀粉废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于45～55℃，120～200转/分振荡培养24～36小时，得到液体种子；

(3)液态发酵：向装有预处理好的甘薯淀粉废水发酵罐中接种体积比为2％～15％的液体种子，于35～50℃，通无菌空气培养12～30小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到2×109CFU/毫升以上，所得发酵液可以作为液体菌剂直接使用；

(4)固体菌剂制备：以过30目筛的生物碳为载体，按照发酵液：生物碳为1：1～1：3的重量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，在55～60℃下，通风干燥至菌剂含水量按重量比为15％～25％，包装，存放在阴凉干燥处，备用；所述生物碳为生物质热解后剩余的固体物质，主要成分是碳；

其中，所述枯草芽孢杆菌为具有促进植物生长、拮抗植物病原菌功能的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8188。

2.权利要求1所述的农用微生物菌剂的使用方法，其特征在于：将发酵液或固体菌剂用灌溉用水稀释到活菌数为3×106CFU/毫升～3×107CFU/毫升，混合均匀，按照每亩0.3～3立方米稀释液的用量对作物整株均匀喷施或沟施入作物根部附近的土壤中。

3.权利要求1所述的农用微生物菌剂的使用方法，其特征在于：将发酵液或固体菌剂加入有机肥中，混合均匀，使有机肥中的枯草芽孢杆菌活菌数为2×107CFU/克～2×108CFU/克，按照每亩1～3吨的用量作为基肥施入土壤中。

说明书

一株分离自叶际的植物促生菌及其菌剂的生产方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及一株从松树叶片分离的高效植物促生菌(枯草芽孢杆菌SZX11菌株)，及其菌剂的低成本生产方法，属于微生物肥料和节能减排技术领域。背景技术：

[0002] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，大小(0.8～1.2)μm×(1.5～4.0)μm，革兰氏染色阳性，可产荚膜，芽孢中生或近中生，菌落粗糙，能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性。枯草芽孢杆菌可通过成功定殖于植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而具有生防的效果。枯草芽孢杆菌还能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长。例如：美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000年通过美国环保局(EPA)的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。枯草芽孢杆菌MBI600在英国的MicroBio Group Ltd.、日本的IdemistuKosanCo.,Ltd.等均已获得注册登记，并进行产业化生产，用于防治叶部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)。枯草芽孢杆菌FZB24在德国、美国等国家进行了注册，并在德国Bayer公司投入生产，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。随着对枯草芽孢杆菌研究的不断深入，发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖等方面具有广泛应用价值。

[0003] 中国发明专利(申请号：201210328716.5)中公开了一枯草芽孢杆菌T-500菌株，保藏编号为CGMCC No.6058，对水稻稻瘟菌、水稻纹枯菌、水稻白叶枯病菌、水稻稻曲病菌、水稻细菌性条斑病菌、禾谷镰刀菌、黄曲霉及黑曲霉菌等病原菌，表现出较强的抑菌活性，并对其引起的病害有较好的防控作用，发酵培养基组成包括：碳源(蔗糖或淀粉)、氮源(黄豆粉、豆饼粉、玉米桨中的一种或几种种混合)、微量元素(牛肉浸出膏、酵母膏或者鱼粉中一种或两种混合)。中国发明专利(申请号：201210229066.9)中公开了一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌CX31菌株，保藏编号为CCTCC No.M2012138，该菌株的培养采用牛肉膏蛋白胨培养基。中国发明专利(申请号：201110205587.6)中公开了一株内生枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.4844，对胡椒瘟病有良好的防治效果，培养该菌株采用的培养基为：PDA培养基。

[0004] 中国发明专利(申请号：201210215134.6)中公开了一株枯草芽孢杆菌RB菌株，保藏编号为CGMCC No.6268，并公开了该菌株在处理污泥、禽畜粪便或作物稿杆中的应用，该菌株的培养基采用玉米淀粉、红糖、麦麸、鱼粉、蔗糖和无机盐来制备。中国发明专利(申请号：201210127519.7)中公开了一株枯草芽孢杆菌)KW119菌株，保藏编号为CGMCC No.5789，其在鸡肠道内生境条件下产蛋白酶能力较高，其发酵培养基主要以豆粕为底物。中国发明专利(申请号：201110443948.0)中公开了一株枯草芽孢杆菌CH-001菌株，保藏编号为CCTCC No.M2011111，它对金黄色葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，具有益生菌特性，适用于动物蛋白饲料添加剂，其培养基主要成分为羽毛粉和无机盐。中国发明专利(申请号：201010129783.5)中公开了一株枯草芽孢杆菌ANSB060菌株，保藏编号为CGMCC No.3440，并公开了其在动物饲料中的应用，其培养基主要成分为蛋白胨、葡萄糖和无机盐。中国发明专利(申请号：200410101021.9)中公开了一株枯草芽孢杆菌B115菌株，保藏编号为CGMCC No.1210，并公开了其用于制备渔用微生态水质改良剂的方法，其培养基主要成分为豆饼粉、麸皮和玉米粉。

[0005] 综上所述，具有促进植物生长和拮抗植物病害的枯草芽孢杆菌的菌株较多，用于动物饲料的菌株也比较常见，其培养方法也各不相同，但是，未见分离自植物叶际的菌株，也未见采用高浓度甘薯淀粉废水培养枯草芽孢杆菌的报道。

[0006] 我国是世界上最大的甘薯生产国，总产量稳定在1亿吨以上，占全世界的80％左右。在全国的农作物主产中，红薯仅次于水稻、小麦和玉米，居第4位。甘薯种植投入少，产出多，单位面积可食用的干物质居各种作物之首。甘薯抗灾力强，耐旱，耐贫瘠，丘陵山区也能种植，在其他作物较难生长的地方也能获得较好的产量。甘薯易腐烂，不宜长期存放。甘薯的深加工，可以解决因贮存鲜薯不当而导致大量烂薯的现象，甘薯精制淀粉经过不同深度的加工，可生产出数百种有价值的产品，增值10-30倍左右。但是，目前的加工工艺，每生产1吨甘薯淀粉大约产出10吨左右高浓度有机废水，其中淀粉分离后的甘薯细胞液中有机物含量最高，COD可达20000mg/L以上，主要含有溶解性淀粉、蛋白质、果胶、有机酸及少量的油脂，处理不当，极易腐败发酵，使水质发黑发臭。而采用一般污水处理工艺将如此高浓度的废水处理达标排放，能源消耗非常大。从另一个角度考虑，甘薯淀粉废水中的有机质(包括：蛋白质、果胶、糖类等)是微生物生长的良好营养底物，可以做成微生物培养基进行资源化利用。
发明内容：

[0007] 本发明的目的是提供一株拮抗植物病原菌、促进植物生长的枯草芽孢杆菌，并提供一种能够资源化利用高浓度甘薯淀粉废水生产其菌剂的方法。

[0008] 本发明所使用的菌株是由发明人从松树的叶片上分离筛选出来的一株具有促进植物生长、拮抗植物病原菌功能的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11菌株，该菌株于2013年9月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8188，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

[0009] 本发明所述的枯草芽孢杆菌农用微生物菌剂的生产方法如下：

[0010] 1、甘薯淀粉废水预处理：在高浓度甘薯淀粉废水中按照重量比加入0.1％～1％的草木灰(来自于生物质热电厂的固态废弃物，其主要成分为碳酸钾)，重复混合均匀，再用石灰水调节废水的pH到7.0～8.5，于95～110℃微波加热3～15分钟。

[0011] 2、液体种子制备：向装有预处理好的甘薯淀粉废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于45～55℃，120～200转/分振荡培养24～36小时，得到液体种子。

[0012] 3、液态发酵：向装有预处理好的甘薯淀粉废水发酵罐中接种体积比为2％～15％的液体种子，于35～50℃，通无菌空气培养12～30小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到2×109CFU/毫升以上，所得发酵液可以作为液体菌剂直接使用。

[0013] 4、固体菌剂制备：以过30目筛的生物碳(生物质热解后剩余的固体物质，主要成分是碳)为载体，按照发酵液∶生物碳为1∶1～1∶3的重量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，在55～60℃下，通风干燥至菌剂含水量按重量比为15％～25％，包装，存放在阴凉干燥处，备用。

[0014] 本发明所述的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法如下：

[0015] 1、将发酵液或固体菌剂用灌溉用水稀释到活菌数为3×106CFU/毫升～3×107CFU/毫升，混合均匀，按照每亩0.3～3立方米稀释液的用量对作物整株均匀喷施或沟施入作物根部附近的土壤中；

[0016] 2、将发酵液或固体菌剂加入有机肥中，混合均匀，使有机肥中的枯草芽孢杆菌活菌数为2×107CFU/克～2×108CFU/克，按照每亩1～3吨的用量作为基肥施入土壤中。具体实施方式：

[0017] 由本发明提供的枯草芽孢杆菌能够促进作物对养分的吸收和利用，并且能有效防治多种植物病害，本发明提供的技术方案生产的微生物菌剂应用于农业生产可以减少化肥和农药的使用量，从而改善农田环境质量；而且生产成本很低，使高浓度废水得到资源化利用，减少污染物排放。具体实施方式如下：

[0018] 实施例1：甘薯淀粉废水生产枯草芽孢杆菌微生物菌剂

[0019] (1)甘薯淀粉废水预处理：在高浓度甘薯淀粉废水中按照重量比加入0.5％的草木灰(来自于生物质热电厂的固态废弃物，其主要成分为碳酸钾)，重复混合均匀，再用石灰水调节废水的pH到8.0，于100℃微波加热5分钟。

[0020] (2)液体种子制备：向装有预处理好的甘薯淀粉废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于50℃，150转/分振荡培养28小时，得到液体种子。

[0021] 3、液态发酵：向装有预处理好的甘薯淀粉废水发酵罐中接种体积比为5％的液体种子，于45℃，通无菌空气培养16小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到2×109CFU/毫升以上，所得发酵液可以作为液体菌剂直接使用。

[0022] 4、固体菌剂制备：以过30目筛的生物碳(生物质热解后剩余的固体物质，主要成分是碳)为载体，按照发酵液∶生物碳为1∶2的重量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，在55～60℃下，通风干燥至菌剂含水量按重量比为15％～25％，包装，存放在阴凉干燥处，备用。

[0023] 实施例2：枯草芽孢杆菌微生物菌剂应用于有机茶生产

[0024] 在有机茶园选择茶树长势均匀的试验地2亩左右，实验茶树与基地其他茶树管理保持一直，只是施肥有所不同。试验地划分为5块，分别对应5个处理，每个处理之间都有设有2米左右的隔离行，将菌剂用自来水稀释或直接将发酵液稀释使用，5个处理分别为清水对照(CK)、淀粉废水对照(FCK)、高浓度(2×107CFU/毫升)喷施(H)、中浓度(1×107CFU/毫升)喷施(M)、低浓度(5×106CFU/毫升)喷施(L)，按照每平方米2升的菌剂稀释液的量使用。各处理以相同的方式在冬季施用3次菌剂，春季采收茶叶，结果表明：施用废水稀释液的对照春茶产量与清水对照无显著差异，而使用菌剂的春茶产量显著增加，其中，施用中浓度和高浓度菌剂的春茶产量相当，都比清水对照增产35％以上，施用低浓度菌剂的春茶产量也比清水对照增产20％左右。而且施用菌剂的茶叶中茶多酚和氨基酸含量显著高于清水对照。

[0025] 实施例3：富含枯草芽孢杆菌的有机肥应用于茶叶生产

[0026] 在茶园选择一块茶树长势均匀的试验地，均匀划分为6个小区，每个小区约200平方米，分别设置为不施肥对照、施用有机肥和施用富含枯草芽孢杆菌(6×107CFU/克)的有机肥3种处理，每种处理2个平行，各处理之间都设有2米左右的隔离行，有机肥和富含枯草芽孢杆菌的有机肥按照每亩1吨的用量，在入冬前沟施1次，春季采收茶叶，结果表明：施用有机肥的春茶产量比对照增产15％左右，而施用生物有机肥的春茶产量比对照增产35％以上，而且施用生物有机肥的茶叶中水浸出物、茶多酚和氨基酸的含量显著高于对照。

[0027] 实施例4：枯草芽孢杆菌微生物菌剂应用于油菜生产

[0028] 采用蔬菜大棚小区实验，设置8个条件完全相同的实验小区，每个小区100m2，2个小区为1组平行试验，共分成4组，种植油菜，在油菜幼苗期，第1组2个小区不施肥作对照；第2组2个小区按照100公斤/亩的用量在油菜完全发芽后和3周后各喷施一次菌剂稀释液(2×
107CFU/毫升)；第3组2个小区按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次；第4组2个按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次，并在每次施用尿素后1天按照100公斤/亩喷施一次菌剂稀释液(2×107CFU/毫升)，各小区相同的灌溉和管理方式。油菜生长5周后调查产量和品质。单独施用菌剂和单独施用尿素的油菜产量基本一致，都比不施肥的对照小区增产50％左右；两种肥料都施用的小区比对照小区增产85％以上，而且油菜中硝酸盐和亚硝酸盐的含量显著低于单独施用尿素的小区。