HbCS3基因在提高原核表达菌生长速率、研究橡胶树抗逆境胁迫和产胶能力中的应用

摘要

本发明提供了HbCS3基因在提高原核表达菌生长速率、研究橡胶树抗逆境胁迫和产胶能力中的应用、以及携带HbCS3基因的重组体和重组大肠杆菌。HbCS3基因转入原核表达菌株后，能够显著提高菌株在正常及重金属胁迫下培养条件下的生长速率，在微生物的基因工程中具有良好的应用前景。HbCS3基因在雄花、树皮及种子中高表达，同时受乙烯利、割胶、高温和低温胁迫诱导上调表达，与橡胶树产量性状及抗逆境胁迫密切相关，可作为橡胶树转基因育种的重要靶基因，有望通过调控该基因的表达来合理挖掘橡胶树的产胶及抗逆潜力。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他植物的基因工程中得到应用。

权利要求

1.一种基因重组体，其特征在于，为携带HbCS3基因的重组体，所述HbCS3基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的基因重组体，其特征在于，所述重组体的载体为表达质粒或病毒载体，其中，所述病毒载体选自腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、反转录病毒载体、腺伴随病毒载体、慢病毒载体中的一种。

3.一种快速生长的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有权利要求2所述的基因重组体，且所述重组体的载体为表达质粒。

4.如权利要求3所述的重组大肠杆菌在基因工程菌中的应用。

5.HbCS3基因在提高原核表达菌生长速率中的应用，所述HbCS3基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，HbCS3基因应用于提高原核表达菌在重金属胁迫下的生长速率。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重金属为铜、和/或铅、和/或锌、和/或锡、和/或镍、和/或钴、和/或锑、和/或汞、和/或镉、和/或铋。

8.根据权利要求5-7中任意一项所述的应用，其特征在于，所述原核表达菌为大肠杆菌。

9.HbCS3基因作为靶基因在研究橡胶树抗逆境胁迫能力中的应用，所述HbCS3基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

10.HbCS3基因作为靶基因在研究橡胶树的产胶能力中的应用，所述HbCS3基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

说明书

HbCS3基因在提高原核表达菌生长速率、研究橡胶树抗逆境胁

迫和产胶能力中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及HbCS3基因在提高原核表达菌生长速率中的应用、HbCS3基因作为靶基因在研究橡胶树抗逆境胁迫和产胶能力中的应用，还涉及一种携带HbCS3基因的重组体及重组大肠杆菌。

背景技术

[0002] 柠檬酸合酶(citrate synthase,CS,EC4.1.3.7)几乎存在于所有的生物体中，是细胞内多种代谢途径的关键限速酶及代谢变化的标志酶(葛亚东,潘蔚,汪劼,朱国萍.柠檬酸合酶的分子生物学研究进展.生物学杂志.2010,27(3):59-62.)。CS具有高度的底物特异性，仅催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成柠檬酸和辅酶A。CS具有多种同工酶，根据其存在于不同的亚细胞结构中，CS分为线粒体CS(mCS)和过氧化物酶体CS(gCS)(Schnarrenberger C,Martin William.Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyoxylate cycle of higher plants.A case study of endosymbiotic gene transfer.European Journal of Biochemistry.2002,269(3):868-883.)。mCS是线粒体中三羧酸循环(TCA)起始的关键酶，参与细胞内主要的能量代谢；pCS是过氧化物体中的关键酶之一，参与细胞内脂肪酸的氧化以及细胞解毒过程。CS的活性变化直接导致细胞内乙酰辅酶A池的变化，而乙酰辅酶A是脂肪酸合成的主要原料来源，乙酰辅酶A池的变化将直接影响脂肪酸的合成。近年来，研究发现CS参与多种生理过程，如线粒体能量代谢、种子萌发和抗逆等(Schmidtmann E, AC,Orwat A,Leister D,Hartl M,Finkemeier I.Redox regulation of Arabidopsis mitochondrial citrate synthase.Mol Plant.2014,7(1):156-69.Pracharoenwattana I,Cornah JE,Smith SM.Arabidopsis peroxisomal citrate synthase is required for fatty acid respiration and seed germination.Plant Cell.2005,17(7):2037-48.Koyama H,Kawamura A,Kihara T,Hara T,Takita E,Shibata D.Overexpression of mitochondrial citrate synthase in Arabidopsis thaliana improved growth on a phosphorus-limited soil.Plant Cell Physiol.2000,41(9):
1030-7.童晋,詹高淼,王新发,刘贵华,华玮,王汉中.油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达.作物学报.2009,35(1):33-40.)。

[0003] 巴西橡胶树是四大工业原料之一天然橡胶的主要来源，天然橡胶(橡胶烃)具有合成橡胶不可比拟的综合优良性状，具有极高的经济价值及应用前景。乙酰辅酶A是橡胶烃合成的前体物质，直接参与橡胶树天然橡胶的生物合成，CS的活性变化直接影响胞内乙酰辅酶A池的变化，进而影响橡胶树产胶能力(邹智,杨礼富,王真辉,袁坤.橡胶树中橡胶的生物合成与调控.植物生理学通讯.2009:45(12):1231-1238.张福城,陈守才.巴西橡胶树天然橡胶生物合成中关键酶及相关基因研究进展.热带农业科学,2006,26(1):42-46.)。另外，橡胶树产胶能力与抵抗外界不良环境因素能力密切相关，如寒害，风害及病害均直接影响橡胶树产量。因此，橡胶树CS在橡胶树的生长发育(橡胶烃生物合成)以及抵御生物与非生物胁迫中具有重要作用，分析CS将有助于进一步了解胞内乙酰辅酶A池的调控机制及在橡胶树代谢中的重要作用。目前橡胶树柠檬酸合酶(CS)基因及酶活特性未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，对橡胶树柠檬酸合酶基因HbCS3基因进行了基因表达分析和功能研究，发现其对该基因转入原核表达菌株后获得的转基因菌株在正常及重金属胁迫下培养条件下生长速率均明显提高，且与橡胶树胶乳产量相关，可应用于提高细菌生长速率，可作为靶基因应用在橡胶树产胶和抗逆境胁迫能力的研究中。

[0005] 本发明的第一个方面是提供一种基因重组体，为携带HbCS3基因的重组体，所述HbCS3基因的序列如SEQIDNO：1所示。

[0006] 其中，所述重组体的载体为表达质粒或病毒载体。

[0007] 其中，所述病毒载体选自腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、反转录病毒载体、腺伴随病毒载体、慢病毒载体中的一种，优选为腺病毒载体。

[0008] 本发明的第二个方面是提供一种快速生长的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有本发明第一个方面所述的任意一种基因重组体。

[0009] 本发明的第三个方面是提供本发明第二个方面所述的重组大肠杆菌在基因工程菌中的应用。

[0010] 本发明的第四个方面是提供HbCS3基因在提高原核表达菌生长速率中的应用。

[0011] 进一步地，HbCS3基因应用于提高原核表达菌在重金属胁迫下的生长速率。

[0012] 其中，所述重金属为铜、和/或铅、和/或锌、和/或锡、和/或镍、和/或钴、和/或锑、和/或汞、和/或镉、和/或铋。

[0013] 进一步地，所述原核表达菌为大肠杆菌。

[0014] 本发明的第五个方面是提供HbCS3基因作为靶基因在研究橡胶树抗逆境胁迫能力中的应用。

[0015] 本发明的第六个方面是提供HbCS3基因作为靶基因在研究橡胶树的产胶能力中的应用。

[0016] 本发明的有益效果：

[0017] HbCS3基因转入原核表达菌株后，能够显著提高菌株在正常及重金属胁迫下培养条件下的生长速率，将携带HbCS3基因的原核表达菌株应用于工程菌，工程菌生长速度快，能显著提高效率，降低成本等，在微生物的基因工程中具有良好的应用前景。另外，HbCS3基因在雄花、树皮及种子中高表达，同时受乙烯利及割胶诱导上调表达，与橡胶树胶乳产量呈正相关，该基因还同时受高温和低温胁迫诱导上调表达，因此该基因可能与橡胶树产量性状及抗逆境胁迫密切相关，可作为橡胶树转基因育种的重要靶基因，有望通过调控该基因的表达来合理挖掘橡胶树的产胶及抗逆潜力。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他植物的基因工程中得到应用。

附图说明

[0018] 图1为HbCS3的原核表达分析；

[0019] 图2为HbCS3重组蛋白酶活检测；

[0020] 图3为转基因菌株在正常条件下的生长速率测定；

[0021] 图4为转基因菌株在重金属铜离子胁迫下的生长速率测定；

[0022] 图5为HbCS3基因的组织特异性表达分析；

[0023] 图6为割胶对HbCS3基因表达的影响；

[0024] 图7为乙烯利对HbCS3基因表达的影响；

[0025] 图8为高温胁迫对HbCS3基因表达的影响；

[0026] 图9为低温胁迫对HbCS3基因表达的影响。

具体实施方式

[0027] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步地描述，以更好地理解本发明。

[0028] 1.橡胶树柠檬酸合酶编码基因(HbCS)的获得

[0029] 分析已在NCBI登陆的拟南芥、水稻、杨树及蓖麻的柠檬酸合酶(CS)的核苷酸序列，通过搜索我们建立的橡胶树胶乳EST序列数据库，筛选并拼接一条1900bp左右的橡胶树柠檬酸合酶基因组装后序列(contig)，设计一对特异引物扩增得到包含完整读码框的cDNA全长序列。

[0030] cDNA克隆具体方法如下：

[0031] 特异性引物设计如下：

[0032] F(5’端)：5’-AATCGACTATCGGTTTCGCTT-3’；

[0033] R(3’端)：5'-GCCACGAATTGCAAAATAGTAGAT-3'。

[0034] 以巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)叶片cDNA为模板(以随机引物反转录获得)，F和R为引物，其终浓度为0.4μmol/L，在20μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45S，68℃退火3min，共30次循环；72℃延伸10min。

[0035] 将该PCR获得的片段连接到pMD18-T载体(TaKaRa)进行测序，测序表明上述获得的片段即为本发明的柠檬酸合酶(CS)基因，该片段具有序列表中SEQIDNO：1的核苷酸序列，序列表中SEQIDNO：1全长为1779个核苷酸，包含一个长度为1536个核苷酸的开放阅读框(ORF，自序列2的5’端第45-1580位核苷酸序列)、44个核苷酸的5’-UTR(自序列2的5’端第1-44位核苷酸序列)和219个核苷酸的3’-UTR(自序列2的5’端第1581-1799位核苷酸序列)，编码一个长度为511个氨基酸(序列表中SEQIDNO：2)、分子量约为56kDa的蛋白，即为柠檬酸合酶(CS)，将该柠檬酸合酶基因命名为HbCS3。将上述含有SEQIDNO：1的核苷酸的pMD18-T重组载体命名为pMD18-HbCS3。除此之外，利用亚细胞定位预测软件(ProtComp Version 9.0)在线分析该蛋白的氨基酸序列，将该蛋白定位于过氧化物体中，因此HbCS3属于橡胶树过氧化物体型柠檬酸合酶。

[0036] 2.原核表达与HbCS3基因的功能验证

[0037] 利用pMAL-c5E表达载体(pMAL-c5E(质粒)表达载体购自New England Biolabs公司)构建了HbCS3基因的原核表达载体(应当理解的是，本实施例中表达载体仅为举例，本发明也可以采用其他表达质粒和病毒载体等)，同时利用大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)(菌株购自TransGen Biotech公司)诱导重组蛋白，测定重组蛋白活性及其对BL21生长速率的影响，具体方法如下：

[0038] <1>含HbCS3基因编码区重组载体的获得

[0039] 设计HbCS3基因编码区引物(F：5'-CGG GGT ACC GAT GTC AGA ATC TGA TTC TTC CTT ATC CTC CG-3'，R：5'-CCG GAA TTC CTA AAT CCC AGA TCC AGC AAG TCG TCG-3'，该对引物分别带有Kpn I和EcoR I酶切位点)，以pMD18-HbCS3为模版，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性45s，68℃退火2min，共30次循环；72℃延伸5min。将扩增产物与pMAL-c5E表达载体进行Kpn I和EcoR I双酶切并连接，得到重组载体，利用基因特异引物(HbCS3基因编码区引物)进行PCR鉴定，确保柠檬酸合酶编码片段克隆到表达载体。重组载体进行测序鉴定，将鉴定表明正确的含有SEQIDNO：1的第45-1580位核苷酸序列、读框准确的重组表达载体命名为pMAL-c5E-HbCS3。

[0040] <2>HbCS3基因的原核表达

[0041] 将获得的重组载体pMAL-c5E-HbCS3以及对照载体pMAL-c5E-Empty(空载体)导入E.coli BL21(DE3)中(感受态购自天根生化科技有限公司)，得到重组表达菌，将鉴定正确的重组菌在含50μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的LB培养基中培养至OD600＝0.4～0.6，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃下诱导培养4h，离心收集菌体，菌体蛋白进行12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示。图1表明，在IPTG诱导下HbCS3基因实现了在胞质中的高效异源表达，且重组蛋白包含了HbCS3以及胞质融合蛋白MBP(麦芽糖结合蛋白)分子量大约在100kDa(HbCS3大约56kDa，MBP大约45kDa)。

[0042] <3>HbCS3重组蛋白酶活检测

[0043] 按照“<2>HbCS3基因的原核表达”上述方法收集菌体，低温超声破碎，离心收集上清测定柠檬酸合酶活性(柠檬酸合酶试剂盒购置苏州科铭生物技术有限公司)。测定结果如图2所示：酶活结果显示，含有pMAL-c5E-HbCS3菌株柠檬酸合酶的活性明显高于含有pMAL-c5E-Empty对照菌株(5倍)，这说明HbCS3基因编码的蛋白确实具有柠檬酸合酶的活性。

[0044] <4>HbCS3重组蛋白对菌株生长速率的影响

[0045] 按照“<2>HbCS3基因的原核表达”上述方法活化菌株，并将含有pMAL-c5E-HbCS3和pMAL-c5E-Empty的菌株培养至相同OD600＝0.5，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃下诱导培养0.5h、1h及2h后分别测定其OD(600nm)值，计算生长速率。结果如图3所示：含有pMAL-c5E-HbCS3菌株的生长速率高于pMAL-c5E-Empty对照菌株，且在诱导1h更为明显，说明HbCS3基因编码的蛋白可以提高菌株在正常条件下的生长速率。

[0046] 除此之外，测定了含有pMAL-c5E-HbCS3和pMAL-c5E-Empty菌株在重金属铜离子(Cu2+，600μm)下的生长速率，诱导时间分别为0h、1h、2h、3h、4h和5h，分别测定其OD(600nm)值，计算生长速率。结果如图4所示：含有pMAL-c5E-HbCS3菌株的生长速率高于pMAL-c5E-Empty对照菌株，且在诱导2h及3h更为明显，说明HbCS3基因编码的蛋白可以提高菌株在重金属铜离子胁迫下的生长速率。采用铅、锌、锡、镍、钴、锑、汞镉、铋等其他重金属进行胁迫试验，结果同重金属铜离子胁迫试验，HbCS3基因编码的蛋白可以提高菌株的生长速率。

[0047] 将HbCS3基因导入其他原核表达菌进行上述试验，结果同大肠杆菌，HbCS3基因编码的蛋白可以提高其他原核菌株在正常条件下和重金属胁迫条件下的生长速率。

[0048] 3.HbCS3基因表达模式分析

[0049] <1>HbCS3基因组织特异性表达

[0050] 以橡胶树7-33-97叶片、雌花、雄花、胶乳、种子及树皮RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbCS3基因特异引物(F:5'-CAA AGC CTC TGA TTT CAA AAA GAT-3'；R:5'-CAC TTC CAA AAA GGT GCT ACT-3')进行实时荧光定量PCR，结果如图5所示(相对表达量以胶乳的表达量为对照)，HbCS3基因在雄花、树皮及种子中高表达，雌花、叶片及胶乳中表达相对较低。

[0051] <2>割胶对HbCS3基因的表达影响

[0052] 以未开割巴西橡胶树热研7-33-97不同刀次的胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板(三天一刀，连续采样五刀)，用HbCS3基因特异引物(F:5'-CAA AGC CTC TGA TTT CAA AAA GAT-3'；R:5'-CAC TTC CAA AAA GGT GCT ACT-3')进行实时荧光定量PCR，结果如图6所示(相对表达量以第一刀胶乳的表达量为对照)。结果表明割胶影响HbCS3基因的表达，前两刀中HbCS3基因上调表达，在第三及第四刀中略有下降，随后的四刀中保持稳定的表达丰度不变。

[0053] <3>乙烯利对HbCS3基因的表达影响

[0054] 将乙烯利ET涂于橡胶树割线以及割线上方1cm割面处刺激橡胶树(0h、12h、24h及48h)，以胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbCS3基因特异引物(F:5'-CAA AGC CTC TGA TTT CAA AAA GAT-3'；R:5'-CAC TTC CAA AAA GGT GCT ACT-3')进行实时荧光定量PCR，结果如图7所示(相对表达量以诱导0h的表达量为对照)。结果表明：在乙烯利ET刺激下，HbCS3基因上调表达，且在48h到达峰值。

[0055] <4>高温胁迫对HbCS3基因的表达影响

[0056] 将橡胶树幼苗进行高温(45℃)胁迫处理(0、3h、6h、9h、12h及24h)，以叶片RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbCS3基因特异引物(F:5'-CAA AGC CTC TGA TTT CAA AAA GAT-3'；R:5'-CAC TTC CAA AAA GGT GCT ACT-3')进行实时荧光定量PC，结果如图8所示(相对表达量以诱导0h的表达量为对照)。结果表明：在高温胁迫下，HbCS3基因短时间内上调表达后又恢复至初始丰度，在3h达到峰值。

[0057] <5>低温胁迫对HbCS3基因的表达影响

[0058] 将橡胶树幼苗进行低温(4℃)胁迫处理(0、3h、6h、9h、12h及24h)，以叶片RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbCS3基因特异引物(F:5'-CAA AGC CTC TGA TTT CAA AAA GAT-3'；R:5'-CAC TTC CAA AAA GGT GCT ACT-3')进行实时荧光定量PCR，结果如图9所示(相对表达量以诱导12h的表达量为对照)。结果表明：在低温胁迫下，HbCS3基因短时间内上调表达后又恢复至初始丰度，在3h达到峰值，在12h降至最低。

[0059] 本发明首次克隆了橡胶树柠檬酸合酶HbCS3基因的全长cDNA(过氧化物体型)，经原核表达并测定重组蛋白活性表明，该基因编码的蛋白具有柠檬酸合酶的功能，该基因转入原核表达菌株后获得的转基因菌株在正常及重金属胁迫下培养条件下生长速率均明显提高。基因表达分析显示HbCS3基因在雄花、树皮及种子中高表达，同时受乙烯利及割胶诱导上调表达，与橡胶树胶乳产量呈正相关，另外，该基因同时受高温和低温胁迫诱导上调表达，因此该基因与橡胶树产量性状及抗逆境胁迫密切相关，可作为橡胶树转基因育种的重要靶基因，有望通过调控该基因的表达来合理挖掘橡胶树的产胶及抗逆潜力。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他植物或微生物的基因工程中得到应用。

[0060] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。