利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法

摘要

本发明涉及一种利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法，其是利用硅溶胶、二氧化钛溶胶的成膜性、纳米氧化锌‑银的大比表面积及碳纳米管良好的电学性能，制备了复合修饰剂，基于此复合材料将联吡啶钌固定在热解石墨电极表面，建立了制备高性能电化学发光传感器的新方法，并基于苦参碱对Ru(bpy)32+增敏作用实现了对苦参碱栓的测定。在最佳实验条件下，苦参碱在1.0×10‑8～1.0×10‑5 mol/L范围内与相对发光强度呈线性关系，检出限为8.16×10‑10mol/L，连续平行测定1.0×10‑5 mol/L的苦参碱溶液10次，发光强度的相对标准偏差为4.25%。本方法用于苦参碱栓的测定具有较高的选择性和灵敏度，且实现了联吡啶钌的重复使用。

权利要求

1.一种利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：A、将纯化后的多壁碳纳米管配制成0.001mol/L 1.0mol/L的多壁碳纳米管溶液；

~

B、纳米二氧化钛溶胶的制备：将TiCl4通入乙醇中配制体积分数为3.5～4.5%的TiCl4-EtOH溶液，取TiCl4-EtOH溶液并用氨水调节pH=8.5～9.0，抽滤，滤饼用去离子水洗涤至中性，用H2O2溶解，再加入硅溶胶和水，于92～98℃回流3.5～4.5h得到纳米二氧化钛溶胶；

H2O2、硅溶胶、水的用量按TiCl4-EtOH溶液∶H2O2∶硅溶胶∶水的体积比为1∶1.4～1.6∶0.2～

0.3∶3.2～3.4计算；

C、纳米氧化锌-银核壳量子点的制备：

C-1、按0.1g硝酸银∶28～32mL乙醇计，将硝酸银加入快速搅拌的乙醇溶液中，并在38～

43℃下分散5～15min，得到硝酸银溶液；

C-2、按1g聚乙烯吡咯烷酮∶48～53mL乙醇计，将聚乙烯吡咯烷酮加入乙醇中并于58～

63℃溶解5～15min，得到聚乙烯吡咯烷酮溶液；

C-3、将硝酸银溶液逐滴加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，硝酸银溶液与聚乙烯吡咯烷酮溶液的体积比为1∶1～1.1，反应1.8～2.2h得银溶胶；

C-4、按0.01g NaOH∶22～28mL乙醇计，将NaOH在48～53℃下加入乙醇中分散15～

25min，得到NaOH溶液；

C-5、按0.1g无水醋酸锌∶20～25mL乙醇计，将无水醋酸锌加入乙醇中，在58～63℃下持续搅拌15～25min溶解，得到无水醋酸锌溶液；

C-6、将无水醋酸锌溶液和银溶胶混合均匀得混合溶液，无水醋酸锌溶液与银溶胶体积比为1∶1.9～2.2，混合溶液由最初的黄色逐步变为深灰色，最终稳定在灰色，此时加入混合溶液体积分数3.0～3.6%的聚乙二醇，在48～53℃条件下搅拌5～15min后，于30s内迅速加入步骤C-4制备好的NaOH溶液，NaOH溶液的加入量为混合溶液体积分数64～70%，在38～43℃下反应0.8～1.2h，得到ZnO@Ag核壳量子点；

D、传感器的制备：

D-1、热解石墨电极经过打磨、抛光、清洗后，室温晾干待用；

D-2、将0.001mol/L 1.0mol/L 的多壁碳纳米管溶液与0.0025 mol/L的ZnO@Ag核壳量~子点按体积比为1:19～21超声分散25～35min，制备出MWCNTs-ZnO@Ag复合材料，再与硅溶胶、纳米二氧化钛溶胶按MWCNTs-ZnO@Ag复合材料：硅溶胶：纳米二氧化钛溶胶体积比1:1:2超声混合均匀得到均一、稳定的Silica sol / MWCNTs- ZnO@Ag / TiO2 sol复合溶液，按联吡啶钌溶液:硅溶胶:MWCNTs-ZnO@Ag复合材料:纳米二氧化钛溶胶体积比为1:1:1:2向该Silica sol / MWCNTs- ZnO@Ag / TiO2 sol复合溶液中加入0.001mol/L联吡啶钌溶液，超声振荡使其混匀，然后取1 4 μL加入联吡啶钌溶液的Silica sol / MWCNTs- ZnO@Ag / ~TiO2 sol复合溶液，滴加在步骤D-1得到的热解石墨电极表面，于23～28℃下晾干，即可得到Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰的热解石墨电极；

E、测定药物中苦参碱含量：使用步骤D制备得到的Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / 

2+

TiO2 sol - Ru(bpy)3 修饰的热解石墨电极，按照常规方法测定药物中苦参碱含量。

2.根据权利要求1所述的利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法，其特征在于：步骤A的具体操作为：取部分多壁碳纳米管置于浓硫酸与浓硝酸体积比为3:1的溶液中，于60℃回流反应12h，使用0.22μm微孔滤膜过滤，滤饼用去离子水洗涤至中性，烘干后以二甲基甲酰胺为溶剂配制成1mol/L多壁碳纳米管溶液。

3.根据权利要求1所述的利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法，其特征在于：所述聚乙二醇为PEG200的聚乙二醇。

4.根据权利要求1所述的利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法，其特征在于：步骤A配制的多壁碳纳米管溶液和步骤D-2所述的多壁碳纳米管溶液的浓度为0.008mol/L 0.012mol/L。

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说明书

利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药

物中苦参碱含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种测定药物中苦参碱含量的方法，特别涉及一种利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法。

背景技术

[0002] 苦参碱是由豆科植物苦参的根、株及果实经乙醇等有机溶剂提取制成的，是生物碱。苦参碱具有清热、利尿、杀虫、祛湿等功效，同时还具有抗病毒、抗肿瘤、抗过敏等多种作用，各类制剂已被广泛用于临床，因此测定药物中苦参碱的含量，对临床用药安全具有重要意义。目前，有关苦参碱的测定方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、高效液相-质谱法（HPLC-MS）、反相高效色谱法（RP-HPLC）、离子对色谱法、毛细管电泳法、薄层扫描法、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法、荧光淬灭法等。但这些方法或操作烦琐或使用贵重的仪器设备或灵敏度不高，不能完全满足临床痕量分析的要求。因此，建立简单、快速、灵敏的分析新方法具有重要的意义。

[0003] 目前公开的文献中，以下2篇论文是本发明最接近的现有技术：

[0004] (1)李利军，罗应，李彦青等前期关于“联吡啶钌体系电化学发光法测定苦参碱的研究”中，采用裸电极（金电极）为工作电极，在联吡啶钌浓度为4.0×10-4mol/L的苦参碱测定体系中，其线性范围为 1.5×10-7 1.5×10-4mol/L，检出限为7.3×10-9mol/L。该技术不~足之处一方面在于每次测定均需要添加昂贵的联吡啶钌，测量成本高，同时易造成环境污染；另一方面与修饰电极体系相比，苦参碱测定操作相对复杂，且易造成因操作引起测量误差。

[0005] （2）罗应，李利军，李彦青等在“硅溶胶-纳米金修饰金电极电化学发光法测定苦参碱的研究”中，采用以纳米金为增敏材料，通过联吡啶钌固定技术，实现了联吡啶钌的高效利用，但硅溶胶成膜时易龟裂，需添加合适的助膜剂聚乙烯醇和L-半胱氨酸，而该成膜技术相对传统，所以在电极修饰技术方面缺乏足够创新，且在苦参碱检出限方面也较本技术处于劣势。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是：提供一种利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法，该方法利用硅溶胶（Silica sol）、二氧化钛溶胶（TiO2 sol）的成膜性、纳米氧化锌-银（ZnO@Ag）的大比表面积及碳纳米管（MWCNTs）良好的电学性能，制备了Silica sol / MWCNTs- ZnO@Ag / TiO2 sol复合修饰剂，并通过传感器修饰技术将联吡啶钌（Ru(bpy)32+）负载在热解石墨电极表面，制备出稳定性好、灵敏度高的用于测定苦参碱的电致化学发光传感器，实现了对苦参碱的简单、快速测定，该方法用于苦参碱栓的测定具有较高的选择性和灵敏度，且实现了联吡啶钌的重复使用。

[0007] 解决上述技术问题的技术方案是：一种利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法，包括以下步骤：

[0008] A、将纯化后的多壁碳纳米管配制成0.001mol/L 1.0mol/L的多壁碳纳米管溶液；~

[0009] B、纳米二氧化钛溶胶的制备：将TiCl4通入乙醇中配制体积分数为3.5～4.5%的TiCl4-EtOH溶液，取TiCl4-EtOH溶液并用氨水调节pH=8.5～9.0，抽滤，滤饼用去离子水洗涤至中性，用H2O2溶解，再加入硅溶胶和水，于92～98℃回流3.5～4.5h得到纳米二氧化钛溶胶；H2O2、硅溶胶、水的用量按TiCl4-EtOH溶液∶H2O2∶硅溶胶∶水的体积比为1∶1.4～1.6∶0.2～0.3∶3.2～3.4计算；

[0010] C、纳米氧化锌-银核壳量子点的制备：

[0011] C-1、按0.1g硝酸银∶28～32mL乙醇计，将硝酸银加入快速搅拌的乙醇溶液中，并在38～43℃下分散5～15min，得到硝酸银溶液；

[0012] C-2、按1g聚乙烯吡咯烷酮∶48～53mL乙醇计，将聚乙烯吡咯烷酮加入乙醇中并于58～63℃溶解5～15min，得到聚乙烯吡咯烷酮溶液；

[0013] C-3、将硝酸银溶液逐滴加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，硝酸银溶液与聚乙烯吡咯烷酮溶液的体积比为1∶1～1.1，反应1.8～2.2h得银溶胶；

[0014] C-4、按0.01g NaOH∶22～28mL乙醇计，将NaOH在48～53℃下加入乙醇中分散15～25min，得到NaOH溶液；

[0015] C-5、按0.1g无水醋酸锌∶20～25mL乙醇计，将无水醋酸锌加入乙醇中，在58～63℃下持续搅拌15～25min溶解，得到无水醋酸锌溶液；

[0016] C-6、将无水醋酸锌溶液和银溶胶混合均匀得混合溶液，无水醋酸锌溶液与银溶胶体积比为1∶1.9～2.2，混合溶液由最初的黄色逐步变为深灰色，最终稳定在灰色，此时加入混合溶液体积分数3.0～3.6%的聚乙二醇，在48～53℃条件下搅拌5～15min后，于30s内迅速加入步骤C-4制备好的NaOH溶液，NaOH溶液的加入量为混合溶液体积分数64～70%，在38～43℃下反应0.8～1.2h，得到ZnO@Ag核壳量子点；

[0017] D、传感器的制备：

[0018] D-1、热解石墨电极经过打磨、抛光、清洗后，室温晾干待用；

[0019] D-2、将0.001mol/L 1.0mol/L 的多壁碳纳米管溶液与0.0025 mol/L的ZnO@Ag核~壳量子点按体积比为1:19～21超声分散25～35min，制备出MWCNTs-ZnO@Ag复合材料，再与硅溶胶、纳米二氧化钛溶胶按MWCNTs-ZnO@Ag复合材料：硅溶胶：纳米二氧化钛溶胶体积比
1:1:2超声混合均匀得到均一、稳定的Silica sol / MWCNTs- ZnO@Ag / TiO2 sol复合溶液，按联吡啶钌溶液:硅溶胶:MWCNTs-ZnO@Ag复合材料:纳米二氧化钛溶胶体积比为1:1:1:
2向该Silica sol / MWCNTs- ZnO@Ag / TiO2 sol复合溶液中加入0.001mol/L联吡啶钌溶液，超声振荡使其混匀，然后取1 4 μL加入联吡啶钌溶液的Silica sol / MWCNTs- ZnO@Ag ~
/ TiO2 sol复合溶液，滴加在步骤D-1得到的热解石墨电极表面，于23～28℃下晾干，即可得到Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰的热解石墨电极；

[0020] E、测定药物中苦参碱含量：使用步骤D制备得到的Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰的热解石墨电极，按照常规方法测定药物中苦参碱含量。

[0021] 本发明的进一步技术方案是：步骤A的具体操作为：取部分多壁碳纳米管置于浓硫酸与浓硝酸体积比为3:1的溶液中，于60℃回流反应12h，使用0.22μm微孔滤膜过滤，滤饼用去离子水洗涤至中性，烘干后以二甲基甲酰胺为溶剂配制成1mol/L多壁碳纳米管溶液。

[0022] 所述聚乙二醇为PEG200的聚乙二醇。

[0023] 步骤A配制的多壁碳纳米管溶液和步骤D-2所述的多壁碳纳米管溶液的浓度为0.008mol/L 0.012mol/L。
~

[0024] 电致化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）分析法具有线性范围宽、灵敏度高及仪器简单、可控性强、便于检测等优点，已被广泛应用于药物检测、分析，而化学修饰电极技术因可通过改变电极表面微结构，改善电化学发光分析特性，提高修饰电极表面对测定物质的选择性和仪器检测的灵敏度，所以将化学修饰电极技术与电化学发光分析方法相结合，有利于拓宽电致化学发光法在药物分析、测定中的研究深度和应用范围。

[0025] 纳米氧化锌（ZnO）因具有独特的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应，在催化、磁学、光学等方面展现出许多特殊功能。而金属Ag纳米粒子具有等离子体共振效应，当与ZnO结合为超微小ZnO@Ag核壳量子点时，能够直接影响界面电子的转移，使ZnO@Ag具有独特的电学、催化等性能。同时，利用多壁碳纳米管（MWCNTs）良好的导电性能和特殊的电学性质，将MWCNTs与ZnO@Ag复合制备出高活性复合修饰剂MWCNTs-ZnO@Ag。而在成膜剂方面，硅溶胶（Silica sol）为二氧化硅胶体粒子在水中均匀扩散形成三维网络结构的乳白色半透明胶体溶液，具有较高的粘结性、吸附性、化学惰性以及较好的生物相容性、催化活性及在水中几乎不溶胀等特点，已成为重要的电极修饰成膜剂，但因硅溶胶在成膜过程中体积收缩较大，膜易龟裂，需添加一定的辅助成膜物，如聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚苯乙烯磺酸钠（PSS）等，以改善硅溶胶成膜性能。为建立改善Silica sol成膜性能的新方法，本发明研究利用纳米二氧化钛溶胶（TiO2 sol）成膜时具有不易龟裂、稳定性好等优点，以TiO2 sol代替传统的PVA、PVP和PSS，并通过配比优化，制备出了稳定性好、耐腐蚀的热解石墨修饰电极。

[0026] 本发明利用Silica sol、TiO2 sol成膜性，并结合ZnO@Ag电催化性和多壁碳纳米管（MWCNTs）良好导电性，借助不同组分间的协同作用，可以改善其化学和电化学性质，用于固定联吡啶钌以建立一种新型、高效的电化学发光传感器，并用于对苦参碱的测定。该方法不仅操作简单、灵敏度高，而且实现了联吡啶钌的固定，从而解决了发光试剂不断消耗带来的分析成本高、环境污染等问题。

[0027] 本发明具有的有益效果再分述如下：

[0028] （1）本发明为克服硅溶胶成膜易龟裂，以二氧化钛溶胶（Silica sol）代替传统修饰剂聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯磺酸钠等，利用Silica sol成膜性能好的优点，制备出了性能稳定、灵敏度高的热解石墨修饰电极，创新了电极修饰技术，有利于电致化学发光技术应用范围的拓展。

[0029] （2）本发明通过固定联吡啶钌测定时，在修饰电极条件相同条件下，可以重复使用进行样品测定，而如果不修饰固定联吡啶钌，每次测定都要添加联吡啶钌溶液，联吡啶钌的使用量多。同时，本发明修饰电极用的联吡啶钌的量很少，一般复合溶液使用量为2μL左右，联吡啶钌浓度为1.0×10-3mol/L，而不固载联吡啶钌，反应溶液中每次添加浓度为1.0×10-4～1.0×10-3mol/L的联吡啶钌溶液至少为100μL，可见本发明通过联吡啶钌负载技术，实现对联吡啶钌的重复利用，减少环境污染，节约测试成本；另外，与非固载相比，固载联吡啶钌提高了传感器灵敏度。

[0030] （3）在增敏材料上，以多壁碳纳米管和ZnO@Ag核壳量子点复合修饰剂代替单一的多壁碳纳米管和ZnO@Ag核壳量子点，制备了纳米-纳米型复合纳米材料修饰电极。

[0031] （4）以热解石墨电极代替金电极，拓宽了电极选择的多样性，并利用复合修饰剂负载联吡啶钌修饰技术，实现了对苦参碱的灵敏测定，线性范围为 1.0×10-8 1.0×10-5mol/~L，检出限为8.16×10-10mol/L，表明该方法具有更低的检出限。

[0032] 下面结合附图和实施例对本发明之一种利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法的技术特征作进一步的说明。

附图说明

[0033] 图1：本发明ZnO@Ag核壳量子点透射电镜（TEM）图。

[0034] 图2：苦参碱对Ru(bpy)32+电致化学发光强度增敏作用曲线图；其中a. Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰热解石墨电极在1.0×10-5 mol/L 苦参碱-5 和 0.2mol/L PBS(pH 8.5)混合溶液中测定；b. 裸热解石墨电极在1.0×10 mol/L 苦参碱和 0.2mol/L PBS(pH 8.5)混合溶液中测定；c. Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰热解石墨电极在0.2mol/L PBS(pH 8.5)溶液中测定。

[0035] 图3：缓冲溶液pH对电化学发光强度的影响曲线图。

[0036] 图4：修饰剂用量对ECL强度的影响曲线图。

[0037] 图5：Silica sol、TiO2 sol配比对ECL的影响曲线图，其中a. 硅溶胶 / 水 / 乙醇 - Ru(bpy)32+(1.0×10-3 mol/L) ( 1:2:1:1, V/V)修饰热解石墨电极，b. 硅溶胶 / 二氧化钛溶胶 / 乙醇 - Ru(bpy)32+(1.0×10-3 mol/L) ( 1:2:1:1, V/V) 修饰热解石墨电极，c. 水 / 二氧化钛溶胶 / 乙醇 - Ru(bpy)32+(1.0×10-3 mol/L) ( 1:2:1:1, V/V) 修饰热解石墨电极。

[0038] 图6：MWCNTs掺量对体系电致化学发光强度影响曲线图。

[0039] 图7：Ru(bpy)32+浓度对ECL的影响曲线图。

[0040] 图8：苦参碱的校正曲线。

[0041] 图9：连续测定10次的重现性示意图。

具体实施方式

[0042] 实施例1：一种利用复合修饰剂负载热解石墨电极电致化学发光行为测定药物中苦参碱含量的方法，包括以下步骤：

[0043] （1）多壁碳纳米管的纯化

[0044] 取部分多壁碳纳米管置于浓硫酸与浓硝酸体积比为3:1的溶液中，于60℃回流反应12h，使用0.22μm微孔滤膜过滤，滤饼用去离子水洗涤至中性，烘干后以二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂配制成0.01mol/L的多壁碳纳米管溶液。

[0045] （2）纳米二氧化钛溶胶的制备

[0046] 将4mLTiCl4通入100mL乙醇溶液，取20mL TiCl4-EtOH溶液并用37mL 2.5%的氨水调节pH=8.8，抽滤，滤饼用去离子水洗涤至中性，用30mL H2O2溶解，再加入5 mL硅溶胶和65 mL水，于95℃回流4h。

[0047] （3）ZnO@Ag核壳量子点的制备

[0048]  本发明在相对低温下于乙醇溶液中制备出ZnO@Ag核壳量子点。首先，在银种子的制备中，以硝酸银为前驱体，采用PVP为稳定剂和还原剂，即取0.169g硝酸银加入快速搅拌的50mL乙醇溶液中，并在40℃下分散10min；同时，将1g PVP加入50mL乙醇中并于60℃溶解10min，随后将硝酸银溶液逐滴加入到PVP溶液，反应2h得银溶胶。其次，取0.04g NaOH，并于
50℃下于100mL乙醇中分散20min；同理，将0.2195 g无水醋酸锌于60℃下持续搅拌20min溶于50mL乙醇。最后，将无水醋酸锌溶液和银溶胶混合均匀，可观察到混合溶液由最初的黄色逐步变为深灰色，最终稳定在灰色，此时加入5.0 mL PEG 200，待50℃下搅拌10min后，于
30s内迅速加入前期制备好的NaOH溶液，在40℃下反应1h，既可得到ZnO@Ag核壳量子点（如图1）。

[0049] （4）传感器的制备

[0050] 将热解石墨电极分别用金相砂纸打磨，A12O3 粉抛光至镜面，冲洗掉多余的抛光粉后依次用水、无水乙醇和水、水超声清洗，室温晾干待用。

[0051] 先将一定量0.01mol/L的多壁碳纳米管溶液与ZnO@Ag核壳量子点（0.0025 mol/L）按体积比1:20超声分散30min，形成MWCNTs-ZnO@Ag复合材料，再与Silica sol、TiO2 sol按体积比1:1:2振荡混合得到均一、稳定的Silica sol / TiO2 sol / MWCNTs- ZnO@Ag复合溶液。向该溶液中加入一定量0.001mol/L的联吡啶钌溶液（体积比，Silica sol / MWCNTs- 2+
ZnO@Ag / TiO2 sol/ Ru(bpy)3 =1:1:2:1），超声振荡使其混匀。然后用微量移液枪取2μL加入了联吡啶钌溶液的复合溶液，滴加在热解石墨电极表面，于25℃下晾干，即可得到Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰的热解石墨电极。同样方法，通过改变修饰剂用量，分别制得不同性质的修饰电极。

[0052] （5）测定药物中苦参碱含量：使用步骤（4）制备得到的Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰的热解石墨电极，实验在MPI-E型电致化学发光工作站上进行，采用CV扫描（0.2-1.25 V），光电倍增管负高压为800 V，扫描速度为100 mV/S，支持电解质为0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=8.5），于25℃下测定，测定前溶液用超声波除气5 min，记录电化学发光信号，以苦参碱-Ru(bpy)32+体系的发光信号的峰高I绘制峰高强度与苦参碱浓度的校正曲线，并进行苦参碱的定量分析。

[0053] 作为本实施例的一种变换，步骤（4）传感器的制备过程中，多壁碳纳米管溶液的浓度可以适当调整变化，可以是0.001mol/L、0.1mol/L或1.0mol/L，一般多壁碳纳米管溶液的浓度选择为0.001mol/L 1.0mol/L；相应的步骤（1）多壁碳纳米管纯化的过程中，配制的多~壁碳纳米管溶液的浓度根据步骤（4）的需要确定。

[0054] 在最佳实验条件下，苦参碱在1.0×10-8～1.0×10-5 mol/L范围内与相对发光强度呈线性关系（r2=0.9938），检出限(S/N=3)为8.16×10-10mol/L。连续平行测定1.0×10-5 mol/L的苦参碱溶液10次，发光强度的相对标准偏差（RSDs）为4.25%。对样品进行回收率试验，回收率在97.25～104.80%之间。本方法用于苦参碱栓的测定具有较高的选择性和灵敏度，且线性范围宽和检出限低，同时该方法不仅操作简单，且实现了联吡啶钌的重复使用，从而解决了发光试剂不断消耗带来的分析成本高、环境污染等问题。

[0055] 采用本发明如实施例1所述方法进行样品分析：取1粒苦参碱栓（规格：50mg/粒），超声溶解于5mL 0.1mol/L盐酸，并添加去离子水超声溶解，经反复冲洗过滤后定容于100mL棕色容量瓶中，后依据所需测量浓度进行稀释，并于25℃进行标准品回收分析和样品测定，其中回收率为97.25% 104.80%，试验结果如表1所示。~

[0056] 表1 样品测定及回收率试验(n=5)

[0057]

[0058] 本发明以热解石墨电极为工作电极，将TiO2 sol应用于化学修饰电极，制备了Silica sol / MWCNTs- ZnO@Ag / TiO2 sol 复合物，基于该复合材料负载联吡啶钌研制的固体电化学发光传感器具有良好的ECL行为。TiO2 sol的加入改善了修饰膜的稳定性，而MWCNTs- ZnO@Ag加入明显提高了传感器的催化活性和灵敏度。通过对联吡啶钌的固定，实现了联吡啶钌的循环使用，降低分析成本的同时提高了灵敏度。该传感器用于电化学发光法测定苦参碱栓具有方法灵敏度高、线性范围宽和检出限低等特点。

[0059] 本发明的研究过程如下：

[0060] 1、苦参碱的电化学发光行为

[0061] 用循环伏安法考察了1.0×10-5 mol/L的苦参碱在支持电解质pH=8.5的0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液中的电化学发光行为。当电位从0.2 V扫向1.25 V时，电化学发光图上没有观察到发光信号，因此苦参碱在热解石墨电极上不产生电化学发光。

[0062] 2、苦参碱对Ru(bpy)32+增敏作用

[0063] 实验分别考察了Ru(bpy)32+电化学发光及苦参碱对Ru(bpy)32+的增敏作用（如图2所示）。其中，图2中 a为修饰电极中Ru(bpy)32+在1.0×10-5 mol/L苦参碱溶液中电化学发光行为；图2中 b 为苦参碱- Ru(bpy)32+体系在裸电极表面的电化学发光行为；图3中c 为修饰电极中Ru(bpy)32+在空白溶液中的电化学发光行为。

[0064] 由图2中a和c分析可知，在Ru(bpy)32+空白试验中，由于Ru(bpy)32+湮灭发光机理，其电化学发光强度值较弱，但当1.0×10-5 mol/L的苦参碱与Ru(bpy)32+构成苦参碱- Ru(bpy)32+体系时，在修饰电极和裸电极上均有较强的电化学发光，苦参碱对Ru(bpy)32+的电化学发光有明显的增敏作用。同时，与裸电极相比，苦参碱- Ru(bpy)32+体系在修饰电极上不但有更强的发光信号，且可以实现重复测定，有利于节约Ru(bpy)32+用量，降低环境污染。

[0065] 3、缓冲体系及pH值对ECL的影响

[0066] 缓冲体系及pH值对胺类-Ru(bpy)32+体系电化学发光具有重要的影响。本发明考察了0.2 mol/L H3BO3-0.05 mol/L Na2B4O7·10H2O缓冲体系（BBS）和0.2 mol/L Na2HPO4-0.3 mol/L NaH2PO4缓冲体系（PBS）对苦参碱-Ru(bpy)32+体系的ECL强度和稳定性的影响（如图3所示）。结果表明，在修饰剂（Silica sol、TiO2 sol、 MWCNTs（1mol/L）-ZnO@Ag、Ru(bpy)32+(1.0×10-3 mol/L)体积比为1:2:1:1）用量为1μL条件下，磷酸盐缓冲液作为支持电解质时的发光强度相对高于硼酸盐缓冲体系，且pH 8.5的磷酸盐缓冲液作为支持电解质时，体系的发光强度较稳定。因此，实验选择pH 8.5的磷酸盐缓冲体系。

[0067] 4、修饰量的选择

[0068] 修饰剂在热解石墨电极表面的覆盖量对Ru(bpy)32+电致化学发光有重要影响，试验考察了修饰量在1～4μL之间对ECL的影响。图4表明，在Silica sol、TiO2 sol、 MWCNTs（1mol/L）-ZnO@Ag、Ru(bpy)32+(1.0×10-3 mol/L)体积比为1:2:1:1条件下，苦参碱-Ru2+
(bpy)3 体系电致化学发光强度值随着工作电极表面覆盖量的增加先增后减，并在2μL时出现最大值。这可能是因为当修饰剂用量少时，电极表面负载Ru(bpy)32+的量相对较少，体系电化学发光值低；而随着修饰剂用量的增多，电极表面膜厚度也不断增大，使电子在膜中的传递阻力变大。

[0069] 5、Silica sol、TiO2 sol配比优化

[0070] 作为成膜剂Silica sol、TiO2 sol，其配比对电极的稳定性及苦参碱在该修饰电极上对Ru(bpy)32+的增敏作用有重要影响。为更直接反应Silica sol、TiO2 sol对修饰电极性能的影响，试验以乙醇代替MWCNTs-ZnO@Ag溶液，而对Silica sol和TiO2 sol的空白样则以水代替。通过分析对修饰电极ECL强度和稳定性，研究了不同Silica sol、TiO2 sol配比对修饰电极ECL性能影响（图5）。图5中a表明，当无TiO2 sol时，苦参碱-Ru(bpy)32+体系在修饰电极表面电化学发光初值较强，而随测定次数增加，电化学发光强度呈先迅速下降后逐步平稳趋势。这可能是因为第1次测定时由于部分Ru(bpy)32+附着在修饰电极表面，体系有相对较强的ECL响应，而随着测定次数的增加，由于Silica sol成膜时存在收缩大、易龟裂的缺点，负载在修饰电极膜中Ru(bpy)32+会部分溶出，使测定初期体系电化学发光强度下降明显，而当Ru(bpy)32+溶出不明显时电化学发光强度趋于稳定。 同样，因初期测定时Ru(bpy)32+附着在修饰电极表面，b和c也均表现出第1次测定时电化学发光强度相对较强，但与a不同的是，由于TiO2 sol膜较为致密，不利于电极表面与溶液间的电子传递，从而影响ECL强度。所以c与a相比，由于未掺Silica sol，修饰电极表面电子传递速度受阻，使体系ECL强度相对较差，但测定时稳定性较好；当Silica sol、TiO2 sol复配时，不但有利于改善ECL强度，而且修饰电极表现出较好的稳定性，故试验选用Silica sol与TiO2 sol体积比为1:2。

[0071] 6、MWCNTs掺量的选择

[0072] 为探究MWCNTs与ZnO@Ag对苦参碱-Ru(bpy)32+体系ECL强度的协同作用，考察了不同MWCNTs掺量下对该体系ECL的影响（如图6所示）。试验得知，在0～1.0mol/L之间，体系ECL强度随着MWCNTs摩尔浓度增加呈先增后减，并在1.0×10-2 mol/L时达最大值。与本节5（Silica sol、TiO2 sol配比优化）相比可知，MWCNTs与ZnO@Ag均有较好的电催化效果，但当MWCNTs掺量较大时，对体系ECL强度有较强的抑制作用，综合考虑，本试验选用1.0×10-2 mol/L MWCNTs为修饰电极的浓度。

[0073] 7、Ru(bpy)32+浓度的选择

[0074] 在制备Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰金电极时，作为修饰剂和发光试剂的Ru(bpy)32+，其浓度对苦参碱-Ru(bpy) 32+体系在工作电极上的电致化学发光行为有很大影响。研究通过考察1.0×10-4mol/L 1.0×10-2mol/L范围内Ru~
(bpy)32+浓度对测定体系电致化学发光行为的影响（如图7所示）。试验表明，Ru(bpy)32+浓度对苦参碱-Ru(bpy) 32+体系的电化学发光强度有显著影响，且体系电化学发光峰值随Ru(bpy)32+浓度增大而增加。为节约Ru(bpy)32+、减少环境污染，同时，为实现最佳信噪比，故试验选取1.0×10-3 mol/L Ru(bpy)32+进行苦参碱的电化学发光分析研究。

[0075] 8、仪器参数的优化选择

[0076] 在ECL仪器参数中，光电倍增管负高压是其灵敏度和线性范围的主要影响因素，为实现检测信号最佳，研究将Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag /TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰热-5 解石墨电极放入含有1.0×10 mol/L苦参碱的pH 8.5磷酸盐缓冲溶液中，考察了负高压
从-600 V变化到-900 V过程中对苦参碱-Ru(bpy) 32+体系电化学发光信噪比的影响，发现信噪比随负高压增加先增大后减小，并在-800 V达到最佳值，故选择-800 V。

[0077] 同时，在20 mV/s 120 mV/s扫描速率下，苦参碱-Ru(bpy) 32+体系的电化学发光峰~2+
高随扫描速率增加呈先增大后趋缓的趋势，这可能与体系中Ru(bpy) 3 氧化速率及苦参碱失电子后还原Ru(bpy) 33+的速率有关，兼顾到降低仪器损耗，以100 mV/s为最佳测试速率。

[0078] 9、ECL传感器的线性范围与检测线

[0079] 在最优条件下，考察不同浓度苦参碱溶液在Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / 2+
TiO2 sol - Ru(bpy)3 修饰热解石墨电极上的电化学发光强度响应曲线，苦参碱浓度在
1.0×10-8 1.0×10-5 mol/L范围内与相对峰高呈良好线性关系（R2=0.9938，n=16），其线性~
回归方程为：I（Counts）= 26.60×107C+1404.7，检出限(S/N=3)为8.16×10-10 mol/L（图 
8）。

[0080] 10、 ECL传感器的重现性及抗干扰性

[0081] 负载有Ru(bpy)32+的Silica sol / MWCNTs-ZnO@Ag / TiO2 sol - Ru(bpy)32+修饰热解石墨电极具有较好的重现性。在试验选定的最佳条件下，用修饰电极对1.0×10-5 mol/L苦参碱连续测定10次，其ECL强度值的RSD为4.25%（图9），表明该传感器用于电化学发光测定苦参碱具有很好的重现性。

[0082] 此外，固定苦参碱标准品的摩尔浓度为1.0×10-5 mol/L，考察了部分常见无机盐离子及其他类物质对体系ECL的影响。结果表明，保持相对测量误差≤±0.5%，1000倍的Na+、K+、Zn2+、SO42-、Cl-、CO32-；50倍的淀粉、葡萄糖；25倍的Fe2+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、Cu2+；2倍的蔗糖、麦芽糖对苦参碱的测定均不产生干扰。