凹凸棒土固相萃取柱的固相萃取方法及其在碱性化合物的应用

摘要

凹凸棒土固相萃取柱的固相萃取方法，将填充酸化凹凸棒土的固相萃取小柱先用甲醇润洗，再用去离子水润洗；将待测样品通过已润洗的小柱，用pH 12的碱性有机溶液洗脱小柱并抽干，收集洗脱液，调节pH 7~8，定容待分析结果回收率达90%以上。本发明方法的上样和淋洗条件简单实用，具有吸附容量大，富集效果好、回收率高、重现性好和检出限低等优点，可用于食品中痕量有害物质的分析及其他行业中碱性化合物的分离分析。

权利要求

1.凹凸棒土固相萃取柱的固相萃取方法，其特征包括以下步骤：

a、酸化凹凸棒土的制备方法，凹凸棒土碾磨粉碎、筛分至200目以下，然后加入盐酸浓度0.5～12mol/L，凹凸棒土和盐酸的比例为1：2～1：30g/mL，处理温度20～85°C，处理时间

0.5～7h，用蒸馏水洗涤、过滤后，烘箱60～120°C烘干5°C10h，碾磨后得到酸化的凹凸棒土；

b、酸化凹凸棒土固相萃取小柱的制备方法：称取经a步制备的酸化的凹凸棒土0.03～

3.0 g，装入带5～20 μm孔径的筛板的3～50 mL固相萃取小柱中，填入5～20 μm微孔上筛板后用振动床震荡均匀，用压柱机压实；

c、将经b步制备的酸化凹凸棒土固相萃取小柱先用甲醇润洗，再用去离子水润洗；

d、将待测样品通过经c步润洗的固相萃取小柱，用pH<8的乙腈有机溶液淋洗小柱并抽干，弃去废液，pH<8的乙腈有机溶液中，乙腈有机溶剂的含量为0%～95%；

e、将经过d步乙腈有机溶液淋洗的固相萃取小柱，用pH>12的碱性有机溶液洗脱小柱并抽干，收集洗脱液，调节pH 7 8，定容待分析用，pH>12的碱性有机溶液中，有机溶剂含量为~

0%～95%，所述碱性有机溶液为氨水溶液或20%甲醇氨水溶液。

2.根据权利要求1所述的凹凸棒土固相萃取柱的固相萃取方法，其特征是用于三聚氰胺的萃取方法：填充酸化凹凸棒土的固相萃取小柱分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗；

然后将三聚氰胺待测样品1～200 mL过柱，用20%～80%乙腈溶液5 mL淋洗固相萃取小柱并抽干，弃去废液；再用1 mL氨水溶液洗脱固相萃取小柱并抽干，收集洗脱液；最后，用固体柠檬酸调洗脱液pH 7 8，过0.45 μm滤膜后，待高效液相色谱检测。

~

3.根据权利要求1所述的凹凸棒土固相萃取柱的固相萃取方法，其特征是用于组胺的萃取方法：填充酸化凹凸棒土的固相萃取小柱分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，然后将组胺待测样品5 mL过柱，用20%～80%乙腈溶液5 mL淋洗固相萃取小柱并抽干，弃去废液，再用1 mL 20%甲醇氨水溶液洗脱小柱并抽干，收集洗脱液，最后，用固体柠檬酸调洗脱液pH 

7 8，过0.45 μm滤膜后，待高效液相色谱检测。

~

说明书

凹凸棒土固相萃取柱的固相萃取方法及其在碱性化合物的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及样品预处理技术领域，特别涉及一种凹凸棒土的固相萃取方法及其在碱性化合物的应用。

背景技术

[0002] 凹凸棒土（Attapulgite，以下简称凹土）是一种层链状结构的含水富镁铝硅酸盐矿物，理想的分子式为：[(OH2)4 (Mg, Al, Fe)5 (OH).2Si8O20]·4H2O，含有丰富的吸附水、结合水、结构水和硅羟基、镁羟基、铝羟基等结构羟基。其晶体呈针状、纤维状集合，单根纤维晶的直径在10   25 nm左右，长约500   1000 nm，孔道横截面约为0.38 nm × 0.63 ~ ~nm，符合纳米材料的尺度标准，属于天然纳米材料。由于凹凸棒土具有比表面积大和表面活性、多孔性和吸附能力强、阳离子交换性等表面和界面性质，特别是成本低廉，使其在重金属和有机化合物的吸附中得到广泛地应用。

[0003] 通过对凹凸棒土表面进行有机改性，表面修饰上具有特异性能的功能团，可以提高有机化合物的选择性和吸附量。例如，3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰的凹凸棒土利用强静电相互作用去除含磺酸基的活性染料（A. Xue, S. Zhou, Y. Zhao, X. Lu, P. Han, J. Hazard. Mater. 2011, 194, 7-14）；十八烷基三甲基氯化铵修饰的凹凸棒土利用氢键、静电相互作用和疏水相互作用吸附丹宁酸（J. Huang, Y. Liu, X. Wang, J. Hazard. Mater. 2008, 160, 382-387）；凹凸棒土表面合成分子印记聚合物作为固相萃取填料应用于苏丹红染料的分析（C. Zhao, T. Zhao, X. Liu, H. Zhang, J. Chromatogr. A 2010, 1217, 6995-7002）；硼酸改性的磁性凹凸棒土对含有顺式二醇结构的核苷具有富集效果（T. Cheng, H. Li, Y. Ma, X. Liu, H. Zhang, Anal. Bioanal. Chem. 2015, 407, 
3525-3529）。如上有机化合物改性的凹凸棒土虽然提高了选择性，但是修饰的步骤繁琐，且局限于含有羟基和酸根离子的有机化合物的吸附和萃取。

[0004] 凹凸棒土原土被用于去除废水中的Cd（比表面积为112 m2/g），最大吸附量为4.54 mg/g（E. Álvarez-Ayuso, A. García-Sánchez, J. Hazard. Mater. 2007, 147, 594-600）。凹凸棒土经过盐酸处理之后，比表面积增加到267.5 m2/g，对Cd的最大吸附量增加至
52.58 mg/g，该吸附的主要机理为阳离子交换作用（W. Wang, H. Chen, A. Wang, Sep. Purif. Technol. 2007, 55, 157-164）。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是根据凹凸棒土经过酸化处理后具有阳离子交换的作用机理，提供一种以酸化凹凸棒土作吸附剂的固相萃取柱，用于复杂基质中碱性化合物特别是三聚氰胺和组胺的净化预处理。

[0006] 本发明采用以下技术方案实现上述目的：

[0007] 凹凸棒土固相萃取柱的固相萃取方法，其特征包括如下步骤：

[0008] a、将填充酸化凹凸棒土的固相萃取小柱先用甲醇润洗，再用去离子水润洗；

[0009] b、将待测样品通过经a步润洗的固相萃取小柱，用pH<8的有机溶液淋洗小柱并抽干，弃去废液；

[0010] c、将经过b步有机溶液淋洗的固相萃取小柱，用pH>12的碱性有机溶液洗脱小柱并抽干，收集洗脱液，调节pH 7 8，定容待分析用。~

[0011] 所述的酸化凹凸棒土的制备方法，凹凸棒土碾磨粉碎、筛分至200目以下，然后加入盐酸浓度0.5～12 mol/L，凹凸棒土和盐酸的比例为1：2～1：30 g/mL，处理温度20～85 °C，处理时间0.5～7 h，用蒸馏水洗涤、过滤后，烘箱60～120 °C烘干5～10 h，碾磨后得到酸化的凹凸棒土。

[0012] 所述的填充酸化凹凸棒土的固相萃取小柱的制备方法，称取酸化的凹凸棒土0.03～3.0 g，装入带5～20 μm孔径的筛板的3～50 mL固相萃取小柱中，填入5～20 μm微孔上筛板后用振动床震荡均匀，用压柱机压实。

[0013] 所述的pH<8的有机溶液中有机溶剂的含量可以为0%～95%。

[0014] 所述的pH>12的碱性溶液中碱性有机溶剂含量可以为0%～95%。

[0015] 所述的凹凸棒土固相萃取柱的固相萃取方法，将其用于三聚氰胺的分析：填充酸化凹凸棒土的固相萃取小柱分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，然后将三聚氰胺待测样品1～200 mL过柱，用20%～80%乙腈溶液5 mL淋洗固相萃取小柱并抽干，弃去废液，再用1 mL氨水溶液洗脱固相萃取小柱并抽干，收集洗脱液。最后，用固体柠檬酸调洗脱液pH 7 8，~过0.45 μm滤膜后，待高效液相色谱检测。

[0016] 所述的凹凸棒土固相萃取柱的固相萃取方法，将其用于组胺的分析：填充酸化凹凸棒土的固相萃取小柱分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，然后将组胺待测样品5 mL过柱，用20%～80%乙腈溶液5 mL淋洗固相萃取小柱并抽干，弃去废液，再用1 mL 20%甲醇氨水溶液洗脱小柱并抽干，收集洗脱液，最后，用固体柠檬酸调洗脱液pH 7 8，过0.45 μm滤膜~后，待高效液相色谱检测。

[0017] 本发明的优点和成果是：将天然纳米材料凹凸棒土制成固相萃取柱，利用酸化凹凸棒土晶格结构中阳离子交换的性能，建立凹凸棒土的固相萃取方法，省略了吸附剂有机改性的繁琐步骤，首次用于复杂基质中碱性化合物的样品预处理，该固相萃取方法成本低廉、机理简单，对碱性化合物的样品预处理有吸附容量大、富集效果好、回收率高、重现性好和检出限低等优点，相比于目前通用的预处理方法，该方法的上样条件和淋洗条件更加简单实用，大大减少样品预处理步骤，可用于食品中痕量有害物质的分析及其他行业中碱性化合物的分离分析。

附图说明

[0018] 图1为三聚氰胺的回收率和乙腈浓度变化图；

[0019] 图2为三聚氰胺的回收率和氯化钠浓度变化图；

[0020] 图3为三聚氰胺的回收率和pH变化图；

[0021] 图4为三聚氰胺的回收率和上样体积变化图。

具体实施方式

[0022] 凹凸棒土为市售晶质水合镁铝硅酸盐粘土矿物，实施例所用原材料为市售化学纯或分析纯化学试剂；固相萃取小柱为市售PVC塑料柱管。

[0023] 以下结合实施例对本发明作进一步说明。

[0024] 实施例1：按照以下步骤制备基于凹凸棒土的固相萃取小柱。

[0025] （1）凹凸棒土的酸化处理

[0026] 将凹凸棒土原土碾磨粉碎、筛分至200目以下，然后加入盐酸浓度4 mol/L，凹凸棒土和盐酸的比例为1：10 g/mL，75  °C下振荡4 h，然后用蒸馏水洗涤至中性，烘箱110 °C烘干8 h，碾磨后得到酸化的凹凸棒土。

[0027] （2）固相萃取小柱的制备

[0028] 称取步骤（1）处理的酸化凹凸棒土0.03 g，装入带5 μm孔径的筛板的3 mL固相萃取小柱中，填入20 μm微孔上筛板后用振动床震荡均匀，用压柱机压实。

[0029] 实施例2：以三聚氰胺为样品，对上样时乙腈浓度进行了优化。

[0030] 采用实施例1所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱，分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，然后含有一定比例的乙腈水溶液（与溶解三聚氰胺的溶剂比例相一致）置换，将三聚氰胺分别溶解在95%、75%、45%、20%和0%的乙腈水溶液中（v/v），浓度为1.0 μg/mL，上样1 mL，以1 mL/min的流速通过固相萃取小柱，收集流出的样品，过0.45 μm滤膜后用液相色谱分析。色谱分析条件：分析柱为岛津Inertsil-NH（2 4.6×150 mm, 5 μm），流动相为80%乙腈，流速1.0 mL/min，进样5 μL，柱温30  °C，检测波长214 nm。结果均未检测到三聚氰胺的色谱峰，即乙腈浓度对三聚氰胺的上样没有影响。

[0031] 实施例3：以三聚氰胺为样品，对洗脱乙腈浓度进行了优化。

[0032] 采用实施例1所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱，分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，将三聚氰胺溶解在45%乙腈水溶液中（v/v），浓度为1.0 μg/mL，上样1 mL，以1 mL/min的流速通过固相萃取小柱，用5 mL 45%乙腈淋洗，抽干，弃去废液，再分别用1 mL含有0%、10%、30%、40%、60%、80%和95%乙腈的10 mM乙酸铵溶液（pH=11.37）进行洗脱并抽干，收集洗脱液，加入固体柠檬酸调节pH 7 8，过0.45 μm滤膜后供高效液相色谱检测。色谱分析条~
件：分析柱为岛津Inertsil-NH（2 4.6×150 mm, 5 μm），流动相为80%乙腈，流速1.0 mL/min，进样5 μL，柱温30 °C，检测波长214 nm。结果如图1所示，随着乙腈浓度的增加，回收率反而降低。因此，洗脱液中不加入乙腈。

[0033] 实施例4：以三聚氰胺为样品，对洗脱盐的浓度进行了优化。

[0034] 采用实施例1所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱，分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，将三聚氰胺溶解在45%乙腈水溶液中（v/v），浓度为1.0 μg/mL，上样1 mL，以1 mL/min的流速通过固相萃取小柱，用5 mL 45%乙腈淋洗，抽干，弃去废液，再分别用1 mL含有0、20、50、100和200 mM氯化钠的10 mM乙酸铵溶液（pH=11.37）进行洗脱并抽干，收集洗脱液，加入固体柠檬酸调节pH 7 8，过0.45 μm滤膜后供高效液相色谱检测。色谱分析条件：分析~
柱为岛津Inertsil-NH（2 4.6×150 mm, 5 μm），流动相为80%乙腈，流速1.0 mL/min，进样5 μL，柱温30  °C，检测波长214 nm。结果如图2所示，随着氯化钠浓度的增加，回收率反而降低，因此，洗脱液中不加入盐。

[0035] 实施例5：以三聚氰胺为样品，对洗脱溶液的pH进行了优化。

[0036] 采用实施例1所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱，分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，将三聚氰胺溶解在45%乙腈水溶液中（v/v），浓度为1.0 μg/mL，上样1 mL，以1 mL/min的流速通过固相萃取小柱，用5 mL 45%乙腈淋洗，抽干，弃去废液，再分别用1 mL pH为1.76、3.50、5.50、8.00、9.64、10.54和11.37的10 mM乙酸铵溶液和纯氨水溶液（pH 12.98）进行洗脱并抽干，收集洗脱液，加入固体柠檬酸调节pH 7 8，过0.45 μm滤膜后供高效液相~
色谱检测。色谱分析条件：分析柱为岛津Inertsil-NH（2 4.6×150 mm, 5 μm），流动相为80%乙腈，流速1.0 mL/min，进样5 μL，柱温30  °C，检测波长214 nm。结果如图3所示，当pH<
10.54时，未见三聚氰胺被洗脱，当pH>10.54时，随着pH值的增加，回收率增加，当pH为12.98时，得到最佳回收率。因此，洗脱的pH值选为12.98，即用纯氨水溶液洗脱。

[0037] 实施例6：以三聚氰胺为样品，对上样体积进行了优化。

[0038] 采用实施例1所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱，分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，保持三聚氰胺的上样量为1 μg不变，用45%乙腈水溶液（v/v）稀释成1、5、10、20、30、50、100、150和200 mL，分别通过固相萃取小柱，然后用5 mL 45%乙腈淋洗，抽干，弃去废液，再用1 mL纯氨水溶液（pH 12.98）进行洗脱并抽干，收集洗脱液，加入固体柠檬酸调节pH 7~
8，过0.45 μm滤膜后供高效液相色谱检测。色谱分析条件：分析柱为岛津Inertsil-NH（2 4.6×150 mm, 5 μm），流动相为80%乙腈，流速1.0 mL/min，进样5 μL，柱温30 °C，检测波长214 nm。结果如图4所示，随着上样体积的增加，回收率呈缓慢地下降趋势，当上样体积高达200 mL时，回收率仍然达到90%以上。因此，凹凸棒土的固相萃取三聚氰胺的方法富集倍数高达
200倍，可以对痕量三聚氰胺进行分析。

[0039] 具体应用实施例：

[0040] 实施例7：为了验证实施例1所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱对碱性化合物是否具有选择性吸附能力，将所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱对奶粉中三聚氰胺的提取液做固相萃取净化处理，再用高效液相色谱对三聚氰胺进行分析。

[0041] 奶粉提取液的制备：10 g奶粉加入15 mL浓度为1%的三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超声提取10 min，随后15,000 g离心10 min，取上清液于25 mL容量瓶中，加入相应体积的0.1 mg/mL三聚氰胺的标准溶液，使其定容后浓度分别为0.04、1.0和15 μg/mL。

[0042] 萃取条件：采用实施例1所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱，分别用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，然后将奶粉提取液25 mL过柱，用5 mL 45%乙腈淋洗，抽干，弃去废液，再用1 mL氨水溶液洗脱固相萃取小柱并抽干，收集洗脱液，加入固体柠檬酸调节pH 7 8，定容~至1 mL，过0.45 μm滤膜后供高效液相色谱检测。整个萃取过程控制流速在1 mL/min。

[0043] 色谱分析条件：分析柱为岛津Inertsil-NH（2 4.6×150 mm, 5 μm），流动相为80%乙腈，流速1.0 mL/min，进样5 μL，柱温30 °C，检测波长214 nm。

[0044] 结果表明，在奶粉提取液中，三聚氰胺的加标浓度为0.04、1.0和15 μg/mL时，回收率分别为93.6%、103%和90.1%，RSDs分别为4.12%、4.99%和4.96%，凹凸棒土填料的最大吸附率可以达到1000 μg/g，该方法适合于奶粉中三聚氰胺的分析。

[0045] 实施例8：为了验证实施例1所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱对碱性化合物是否具有选择性吸附能力，将所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱对鱼肉中组胺的提取液做固相萃取净化处理，用高效液相色谱对组胺进行分析。

[0046] 组胺提取液的制备：10 g鱼肉加入20 mL甲醇-磷酸盐（50/50，v/v），60 °C水浴振荡提取30 min，随后15,000 g离心10 min，取上清液于25 mL容量瓶中，加入相应体积的0.1 mg/mL组胺的标准溶液，使其定容后浓度分别为50 μg/mL。

[0047] 萃取条件：采用实施例1所制备的凹凸棒土的固相萃取小柱，先用5 mL甲醇和5 mL去离子水润洗，然后将组胺提取液5 mL过柱，用5 mL 45%乙腈淋洗，抽干，弃去废液，再用5 mL浓度为20%的甲醇氨水溶液洗脱，过0.45 μm滤膜后供高效液相色谱检测。整个萃取过程控制流速在1 mL/min。

[0048] 色谱分析条件：分析柱为岛津Inertsil ODS-SP（4.6×150 mm，5 μm），流动相为甲醇：磷酸盐缓冲液（35/65，v/v），流速1.0 mL/min，领苯二甲醛在线衍生，进样20 μL，柱温30 °C，荧光检测波长Ex：345 nm；Em：445 nm。

[0049] 结果表明，当提取液中组胺的加标浓度为50 μg/mL时，回收率分别为101.2%、103.9%和101.1%，RSDs为1.5%，凹凸棒土填料的最大吸附率可以达到800 μg/g，该方法适合于鱼肉中组胺的分析。