一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法

摘要

本发明公开了一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，包括配制培养基、选取外植体、消毒外植体、接种外植体、组培苗培养、配制幼苗移栽培养基、幼苗的分离与移栽。本发明可完成愈伤组织诱导、愈伤组织分化生芽和生根，同时优化了培养基成分，提高了诱导效率，优化了培养基成分，提高了茎节掖芽愈伤组织诱导效率(按最初接种外植体数量计，最高可达88.3％)；采用一次接种培养即可完成三个培养环节(愈伤组织诱导、愈伤组织分化生芽和不定芽生根)，中间不需要进行转接，减少了杂菌污染的机会，提高了成苗率(按最初接种外植体数量计，成苗率超过70％，最高可达73.3％)。

权利要求

1.一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，其特征在于，所述利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法包括：配制培养基：培养基成分包括1×MS营养元素，30g/L蔗糖、7g/L琼脂、2mg/L6-BA、

0.2mg/LIBA；培养基用5mol/L的氢氧化钠调至pH＝5.5～6.5，高温湿热灭菌20～30分钟，后冷却至50℃时，分装在无菌组配瓶内，自然冷却凝固后备用；

组培苗培养：将接种的培养瓶密封瓶口，然后放置在25±1℃培养室内先暗培养3天，然后在16h/8h光暗交替下继续培养，在培养的第30天在掖芽基部切口处形成愈伤组织，第50天愈伤组织分化形成丛状新芽，第70天在新芽周围长出新根，形成高3cm的丛状香根草幼苗；

所述配制培养基后需要：

选取外植体：从生长健壮、无病虫害的香根草基部剪取具4个以上茎节的茎，去除叶、叶鞘和顶芽，在茎节上下1cm处用剪刀剪断，留下带掖芽的茎段作为外植体；

消毒外植体：取所修剪后茎段，放入去污液中并浸泡2h，然后用流水清洗浸泡后的茎秆

2h；接着在工作台内再依次分别用75％酒精、0.1％升汞和5％的多菌灵浸没茎段消毒0.5、6和10分钟，最后用无菌水冲洗茎段4-6遍，于无菌滤纸上晾干后备用；

接种外植体：取消毒晾干后的茎段，在超净工作台内用无菌剪刀将掖芽基部0.1-0.3cm以上顶端部分剪去；用无菌解剖刀在茎节基部等距离纵切3个伤口，伤口深度0.1cm，伤口长度均为0.3cm；用无菌镊子将去除掖芽顶端且切伤后的茎段按自然生长方向插入培养基中，扎入深度为茎节基部刚好接触培养基上平面。

2.如权利要求1所述的利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，其特征在于，所述去污液为1％洗衣粉的蒸馏水。

3.如权利要求1所述的利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，其特征在于，所述组培苗培养后需要：配制幼苗移栽培养基：营养土培养基由花土、壤土和沙按照1：1：1的比例配制，营养钵选用高度为25cm，钵底和钵口直径不小于5cm，混匀的营养土盛装在营养钵内，营养土培养基用量为营养钵高度的1/2，移栽前将装有营养土培养基的营养钵放置在自来水内，使营养土饱和吸水，然后再将营养钵自然控水5小时后备用；

幼苗的分离与移栽：从培养瓶内取出丛状香根草幼苗，去除连带在幼苗上的培养基残渣，用剪刀或镊子轻轻将具有独立根系的单个幼苗从丛状香根草幼苗上分离出来，然后将单个幼苗移栽到装有营养土培养基的营养钵内；

移栽苗的培养：剪取比营养钵口径稍大的透明薄塑料布块，并将其展开轻轻覆盖在移栽后的营养钵口上；然后将覆盖有塑料布的营养钵放置培养室内保湿培养7天，然后去掉塑料布继续培养60天，幼苗即可长至10-15cm大小，培养是条件是25±1℃、16h/8h光暗交替。

说明书

一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物繁殖技术领域，尤其涉及一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法。

背景技术

[0002] 香根草(Vetiveria zizanioides L.)，又名培地茅、岩兰草，是一种禾本科多年丛生的草本植物，原产于印度等国，现主要分布于东南亚、印度和非洲等(亚)热带地区，我国主要分布在广东、云南等地。香根草极难结实或不结实，主要靠分蘖繁殖，即每年春季，上年留在田里的香根草根部会萌发新的分蘖，一般情况下，每兜香根草根部在春季可增生40株左右的分蘖。理论上讲，每个分蘖都可以长成独立的具有6-10节的茎，实际上，只有较大分蘖(平均有15株分蘖/兜)形成的茎节数可达6-10节。香根草具有适应能力强，生长繁殖快，根系发达，耐旱耐瘠等特性，在水土保持，改良生态环境、经济开发利用中有重要的应用，受到国内外的广泛重视并得到迅速的推广。目前国内对香根草的需求较大，种苗供不应求，而导致种苗缺乏的主要原因是繁殖速度过慢。目前生产上香根草种苗繁殖方式有三种，一是通过分离香根草新生分蘖苗法获得。该方法的优点是技术简单，存在的主要问题是种苗繁殖系数低，一般情况下1亩香根草种苗圃可以繁殖4-6亩种苗，限制了香根草的大规模开发利用。二是直接利用香根草外植体(如叶鞘、茎段、蘖节等)，通过体细胞发育形成完整植株。第三种方法是应用香根草愈伤组织再生新苗。其生产程序是，先选择外植体→外植体消毒→外植体接种在诱导培养基上诱导愈伤组织细胞形成→(或将愈伤组织细胞继代培养)→将愈伤组织块接种在生芽培养基上诱导生芽→将芽接种在生根培养基上诱导生根→成苗，形成一个完整的植株。后两种方法的优点是繁殖系数较低一种方法明显增高，但是存在培养过程污染率不容易控制的问题。污染的主要原因是诱导成苗过程需要转接3次，每一次转接都有可能引起污染。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，旨在解决现有的繁殖香根草种苗方法存在培养过程污染率不容易控制的问题。

[0004] 本发明是这样实现的，一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，所述利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法包括：

[0005] 配制培养基，培养基成分包括，1×MS营养元素，30g/L蔗糖、7g/L琼脂、2mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA；培养基用5mol/L的氢氧化钠调至pH＝5.5～6.5，高温湿热灭菌20～30分钟，后冷却至50℃时，分装在无菌组配瓶内，自然冷却凝固后备用；S102：选取外植体：从生长健壮、无病虫害的香根草基部剪取具4个以上茎节的茎，去除叶、叶鞘和顶芽，在茎节上下1cm处用剪刀剪断，留下带掖芽的茎段作为外植体；

[0006] 组培苗培养：将接种的培养瓶密封瓶口，然后放置在25±1℃培养室内先暗培养3天，然后在16/18光暗交替下继续培养，在培养的第30天在掖芽基部切口处形成愈伤组织，第50天愈伤组织分化形成丛状新芽，第70天在新芽周围长出新根，形成高3cm的丛状香根草幼苗。

[0007] 进一步，所述配制培养基后需要：

[0008] 选取外植体：从生长健壮、无病虫害的香根草基部剪取具4个以上茎节的茎，去除叶、叶鞘和顶芽，在茎节上下1cm处用剪刀剪断，留下带掖芽的茎段作为外植体；

[0009] 消毒外植体：取所修剪后茎段，放入去污液中并浸泡2h，然后用流水清洗浸泡后的茎秆2h；接着在工作台内再依次分别用75％酒精、0.1％升汞和5％的多菌灵浸没茎段消毒0.5、6和10分钟，最后用无菌水冲洗茎段4-6遍，于无菌滤纸上晾干后备用；

[0010] 接种外植体：取消毒晾干后的茎段，在超净工作台内用无菌剪刀将掖芽基部0.1-0.3cm以上顶端部分剪去；用无菌解剖刀在茎节基部等距离纵切3个伤口，伤口深度0.1cm，伤口长度均为0.3cm；用无菌镊子将去除掖芽顶端且切伤后的茎段按自然生长方向插入培养基中，扎入深度为茎节基部刚好接触培养基上平面。

[0011] 进一步，所述去污液为1％洗衣粉的蒸馏水。

[0012] 进一步，所述组培苗培养后需要：

[0013] 配制幼苗移栽培养基：营养土培养基由花土、壤土和沙按照1：1：1的比例配制，营养钵选用高度为25cm，钵底和钵口直径不小于5cm，混匀的营养土盛装在营养钵内，营养土培养基用量为营养钵高度的1/2，移栽前将装有营养土培养基的营养钵放置在自来水内，使营养土饱和吸水，然后再将营养钵自然控水5小时后备用；

[0014] 幼苗的分离与移栽：从培养瓶内取出丛状香根草幼苗，去除连带在幼苗上的培养基残渣，用剪刀或镊子轻轻将具有独立根系的单个幼苗从丛状香根草幼苗上分离出来，然后将单个幼苗移栽到装有营养土培养基的营养钵内；

[0015] 移栽苗的培养：剪取比营养钵口径稍大的透明薄塑料布块，并将其展开轻轻覆盖在移栽后的营养钵口上；然后将覆盖有塑料布的营养钵放置培养室内保湿培养7天，然后去掉塑料布继续培养60天，幼苗即可长至10-15cm大小，培养是条件是25±1℃、16/18光暗交替。

[0016] 本发明提供的利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，其优点在于1)优化了培养基成分，提高了茎节掖芽愈伤组织诱导效率(按最初接种外植体数量计，最高可达88.3％)；2)采用一次接种培养即可完成三个培养环节(愈伤组织诱导、愈伤组织分化生芽和不定芽生根)，中间不需要进行转接，减少了杂菌污染的机会，提高了成苗率(按最初接种外植体数量计，成苗率超过70％，最高可达73.3％)。

[0017] 本发明提供的方法就是在整个香根草组培苗培养过程中只进行一次接种，这样就杜绝了愈伤组织细胞和不定芽被真菌细菌污染的机会，减少培养过程中污染率，因为提高了成苗率。为进一步证明这种效果，设计实验来验证。实验用培养基为本发明优化的培养基(含1×MS营养元素、7g/L琼脂、2mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖)，香根草掖芽基部外植体的选择和消毒处理措施同本发明一样。

[0018] 实验处理措施有4个，分别是A：使用本发明的方法，用一个培养基，只接种一次，完成愈伤组织诱导、生芽、生根成苗；B：配置2个培养基，接种二次，第一次是将掖芽接种到培养基上培养至不定芽生成，第二次是将无菌不定芽转接到培养基上生根成苗；C：配置2个培养基，接种二次，第一次是将掖芽接种到培养基上培养至愈伤组织细胞生成，第二次是将无菌愈伤组织细胞接种到培养基上培养至生根成苗；D：配置3个培养基，接种三次，即第一次是将掖芽外植体接种到培养基上培养之愈伤组织生成，第二次是将愈伤组织转接到培养基上培养至生芽，第三次是将不定芽转接到培养基上培养至生根成苗。按照本发明的方法，每组培瓶这接种一个外植体(掖芽、愈伤组织块、不定芽)，分别在第30、50、70天统计产生无菌愈伤组织瓶数、分化形成无菌不定芽瓶数、分化出根的无菌苗瓶数和被污染瓶数，最后计算愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率和污染率。愈伤组织诱导率、生芽率、生根成苗率的计算同实验1，污染率＝被污染总瓶数/接种掖芽总数×100％。

[0019] 应用本发明的技术路线进行培养，香根草掖芽诱导成苗率为73.3％，而方式B、C、D的成苗率分别为53.3％、48.3％和56.8％，显著小于A，成苗率分别为A培养方式的70.％、65.9％和47.7％，而污染率则显著上升，说明减少转接次数可以显著降低污染的几率，提高组培苗成苗率。

附图说明

[0020] 图1是本发明实施例提供的利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法流程图。

具体实施方式

[0021] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0022] 本发明的方法在诱导成苗过程中只利用一种培养基可完成愈伤组织诱导、愈伤组织分化生芽和生根，中间不需要进行转接，因此减少了污染的几率。同时本方法也优化了培养基成分，提高了诱导效率。

[0023] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

[0024] 如图1所示，本发明实施例的利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法包括以下步骤：

[0025] S101：配制培养基，培养基成分包括，1×MS营养元素，30g/L蔗糖、7g/L琼脂、2mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA；培养基用5mol/L的氢氧化钠调至pH＝5.5～6.5，高温湿热灭菌20～30分钟，后冷却至50℃时，分装在无菌组配瓶内，自然冷却凝固后备用；

[0026] S102：组培苗培养：将接种的培养瓶密封瓶口，然后放置在25±1℃培养室内先暗培养3天，然后在16/18光暗交替下继续培养。在培养的第30天左右在掖芽基部切口处形成愈伤组织，第50天左右愈伤组织分化形成丛状新芽，第70天左右在新芽周围长出新根，形成高约3cm的丛状香根草幼苗；

[0027] S103：选取外植体：从生长健壮、无病虫害的香根草基部剪取具4个以上茎节的茎，去除叶、叶鞘和顶芽，在茎节上下1cm处用剪刀剪断，留下带掖芽的茎段作为外植体；

[0028] S104：消毒外植体：取所修剪后茎段，放入去污液(1％洗衣粉的蒸馏水)中并浸泡2h，然后用流水清洗浸泡后的茎秆2h；接着在超净工作台内再依次分别用75％酒精、0.1％升汞和5％的多菌灵浸没茎段消毒0.5、6和10分钟，最后用无菌水冲洗茎段4-6遍，于无菌滤纸上晾干后备用；

[0029] S105：接种外植体：①取消毒晾干后的茎段，在超净工作台内用无菌剪刀将掖芽基部0.1-0.3cm以上顶端部分剪去；②用无菌解剖刀在茎节基部等距离纵切3个伤口，伤口深度0.1cm，伤口长度均为0.3cm；③用无菌镊子将去除掖芽顶端且切伤后的茎段按自然生长方向插入培养基中，扎入深度为茎节基部刚好接触培养基上平面；

[0030] S106：配制幼苗移栽培养基：营养土培养基由花土、壤土和沙按照1：1：1的比例配制，营养钵选用高度为25cm，钵底和钵口直径不小于5cm，混匀的营养土盛装在营养钵内，营养土培养基用量为营养钵高度的1/2。移栽前将装有营养土培养基的营养钵放置在自来水内，使营养土饱和吸水，然后再将营养钵自然控水5小时后备用；

[0031] S107：幼苗的分离与移栽：从培养瓶内取出丛状香根草幼苗，去除连带在幼苗上的培养基残渣，用剪刀或镊子轻轻将具有独立根系的单个幼苗从丛状香根草幼苗上分离出来，然后将单个幼苗移栽到装有营养土培养基的营养钵内；

[0032] S108：移栽苗的培养：剪取比营养钵口径稍大的透明薄塑料布块，并将其展开轻轻覆盖在移栽后的营养钵口上(保证薄塑料布完全覆盖营养钵口)。然后将覆盖有塑料布的营养钵放置培养室内保湿培养7天，然后去掉塑料布继续培养60天左右，幼苗即可长至10-15cm大小，培养是条件是25±1℃、16/18光暗交替。

[0033] 下面结合实验对本发明的应用原理作详细的描述：

[0034] 实验1

[0035] 培养基中添加6-BA和IBA对愈伤组织诱导和成苗的影响

[0036] 在基本培养基(含1×MS营养元素和7g/L琼脂)基础上，研究培养基中添加不同浓度的6-BA和IBA对掖芽诱导愈伤组织、生芽和成苗的影响。IBA的浓度设置3个梯度，分别为0mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L；6-BA的浓度设置4个梯度，分别为0mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L；两个激素共组成12个激素组合(表1)。按照本发明的技术路线，每组培瓶这接种一个外植体(掖芽)，分别在第30、50、70天统计产生无菌愈伤组织瓶数、分化形成无菌不定芽瓶数、分化出根的无菌苗瓶数，最后计算愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率。其中，愈伤组织诱导率＝无菌愈伤组织块数/接种掖芽总数×100％，生芽率1＝无菌不定芽数/接种掖芽总数×100％，生芽率2＝无菌不定芽数/接种愈伤组织总数×100％，生根成苗率1＝无菌苗总数/接种掖芽总数×100％，生根成苗率2＝无菌苗总数/接种无菌不定芽总数×100％。结果表明(表
1)，在0.2mg/mL IBA浓度情况下，愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率最高，按最初接种掖芽外植体数量计算，其平均值分别为55.4％、41.7％和39.2％；在2mg/mL 6-BA浓度情况下，愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率最高，按最初接种掖芽外植体数量计算，其平均值分别为
40.0％、26.7％和21.7％；两个激素组合具有互作效应，共同使用可提高愈伤组织诱导和愈伤组织分化生芽生根成苗，在6-BA和IBA浓度分别为2mg/L和0.2mg/L组合下，愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率最高，按最初接种掖芽外植体数量计算，其平均值分别为63.3％、53.3％和48.3％。因此，在基本培养基中分别添加2mg/L的6-BA和0.2mg/L的IBA是提高愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率的最优组合。

[0037] 表1不同激素组合(6-BA和IBA)下的愈伤组织诱导率和成苗率

[0038]

[0039]

[0040] 实验2

[0041] 培养基中添加蔗糖对愈伤组织诱导和成苗的影响

[0042] 在实验1优化的培养基(含1×MS营养元素、7g/L琼脂、2mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA)基础上，我们又研究在培养基中添加不同浓度的蔗糖对掖芽诱导愈伤组织、生芽和成苗的影响。蔗糖的浓度设置5个梯度，分别为10g/L、20g/L、30L、40g/L、50g/L(表2)。按照本发明的技术路线，每组培瓶这接种一个外植体(掖芽)，分别在第30、50、70天统计产生无菌愈伤组织瓶数、分化形成无菌不定芽瓶数、分化出根的无菌苗瓶数，最后计算愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率。其中，愈伤组织诱导率、生芽率、生根成苗率的计算方法同实验1。结果表明(表2)，在添加蔗糖的情况下，按最初接种掖芽外植体数量计算，其平均愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率分别为77.9％、59.2％和51.7％，特别是在30g/L蔗糖浓度情况下，愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率最高，按最初接种掖芽外植体数量计算，其平均值分别为88.3％、75.0％和71.7％，显著高于不添加蔗糖的比率(如表1示，其平均值分别为63.3％、
53.3％和48.3％)。以上结果表明，在培养基中添加蔗糖可促进香根草掖芽愈伤组织诱导以愈伤组织细胞分化成芽生根成苗，在优化的培养基基础上再添加30g/L蔗糖，最有利于提高愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率。

[0043] 表2不同蔗糖浓度下的愈伤组织诱导率和成苗率

[0044]

[0045] 实验3

[0046] 转接次数对成苗率的影响

[0047] 植物器官组织体细胞通过愈伤组织诱导培养的方法再生植物个体一般包括3次接种培养，即1)外植体组织接种到愈伤组织诱导培养基上生成愈伤组织、2)愈伤组织细胞转接到生芽培养基上生成不定芽、3)不定芽转接到生根培养基上生根成苗。外植体(包括愈伤组织和不定芽)在培养过程中被细菌特别是真菌污染是造成最终成苗率下降的主要原因之一。培养过程中的污染来源主要外植体自身带菌和接种过程中空气和器物带菌。外植体自身带的菌可以通过对外植体使用消毒剂处理来抑制或杀死细菌和真菌，以减少培养过程污染的发生，用作愈伤组织诱导的外植体可以通过这种方式来消毒。采用无菌培养形成的愈伤组织细胞和由愈伤组织生成不定芽在从组培瓶中取出之前是无菌状态，一旦取出就有可能被空气以及器皿上的真菌和细菌再次污染。这种污染一般不能用消毒剂来处理，因为愈伤组织细胞和不定芽非常娇嫩，很容易被消毒剂杀死。控制这种污染的办法就是减少从组培瓶中取出的次数，即减少转接的次数和尽可能的控制好转接中器皿的消毒工作，而较少转接次数是最理想的方法。

[0048] 本发明提供的方法就是在整个香根草组培苗培养过程中只进行一次接种，这样就杜绝了愈伤组织细胞和不定芽被真菌细菌污染的机会，减少培养过程中污染率，因为提高了成苗率。为进一步证明这种效果，设计实验来验证。实验用培养基为本发明优化的培养基(含1×MS营养元素、7g/L琼脂、2mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖)，香根草掖芽基部外植体的选择和消毒处理措施同本发明一样。实验处理措施有4个，分别是A：使用本发明的方法，用一个培养基，只接种一次，完成愈伤组织诱导、生芽、生根成苗；B：配置2个培养基，接种二次，第一次是将掖芽接种到培养基上培养至不定芽生成，第二次是将无菌不定芽转接到培养基上生根成苗；C：配置2个培养基，接种二次，第一次是将掖芽接种到培养基上培养至愈伤组织细胞生成，第二次是将无菌愈伤组织细胞接种到培养基上培养至生根成苗；D：配置3个培养基，接种三次，即第一次是将掖芽外植体接种到培养基上培养之愈伤组织生成，第二次是将愈伤组织转接到培养基上培养至生芽，第三次是将不定芽转接到培养基上培养至生根成苗。按照本发明的方法，每组培瓶这接种一个外植体(掖芽、愈伤组织块、不定芽)，分别在第30、50、70天统计产生无菌愈伤组织瓶数、分化形成无菌不定芽瓶数、分化出根的无菌苗瓶数和被污染瓶数，最后计算愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率和污染率。愈伤组织诱导率、生芽率、生根成苗率的计算同实验1，污染率＝被污染总瓶数/接种掖芽总数×
100％。结果表明(表3)，应用本发明的技术路线进行培养，香根草掖芽诱导成苗率为
73.3％，而方式B、C、D的成苗率分别为53.3％、48.3％和56.8％，显著小于A，成苗率分别为A培养方式的70.％、65.9％和47.7％，而污染率则显著上升，说明减少转接次数可以显著降低污染的几率，提高组培苗成苗率。

[0049] 表3不同培养方式下成苗率

[0050]

[0051] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含本发明的保护范围之内。