一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置

摘要

本发明提供了一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，从上而下分别包括上盖板、通道板和基底板；采用场流分离和特异分子亲和识别两步分离法，其中场流分离采用声表面波和介电泳驱动两种模式，分别实现横向的细胞分组迁移和垂直面内的细胞分层，将红细胞从其他细胞群内初步分离；余下的白细胞混合液则经过细胞识别区域，由识别配体将循环肿瘤细胞固定于识别区域，最后经过释放操作获得肿瘤细胞样品；该装置可以实现快速、无标记的循环肿瘤细胞分离，对于患者疾病诊断、治疗监控、病理学研究等都具有重要意义，亦可用于其他细胞、大分子蛋白、以及微颗粒的分离过程。

权利要求

1.一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，其特征在于：采用三层式结构，从上而下分别包括上盖板(1)、通道板(2)和基底板(3)；上盖板上加工有流体注入口(11)和两个出口，通道板(2)上制作有微通道，并作为分离腔，三层结构叠加后，流体注入口(11)与微通道一端连通，两个出口与微通道另一端连通，上盖板(1)的下表面上制作有介电泳电极(12)，电极布置方向与微通道倾斜，实现垂直方向和横向的驱动作用，基底板(3)的上表面制作有声表面波换能器(32)，声表面波换能器平行于微通道布置，声波场垂直于流动方向，基底板(3)上还制作有用于细胞捕获的表面结构；

基底板(3)上的表面结构，为制作于基底板(3)上表面的纳米粗糙度表面，并利用表面化学改性方法，在其上依次布置有连接体和细胞识别配体，纳米粗糙度表面采用化学刻蚀法获得，并进行表面修饰改性，连接体包括生物素、链霉亲和素和树形大分子，细胞识别配体包括anti-EpCAM、EGFR和核酸适配体。

2.如权利要求1所述的组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，其特征在于：上盖板(1)为玻璃材质，并在其上采用剥离或刻蚀法加工有介电泳用叉指微电极，叉指微电极与微通道倾斜布置，利用介电泳力驱动细胞横向和垂直分离。

3.如权利要求1所述的组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，其特征在于：通道板(2)为PDMS材质，利用SU-8胶光刻及模塑工艺制成，其上制作了微通道，通道板(2)并与上盖板、基底板键合成一体，实现微通道封闭。

4.如权利要求1所述的组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，其特征在于：基底板为铌酸锂压电材料，并采用剥离或刻蚀法制作了声表面波驱动的叉指电极。

说明书

一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置

【技术领域】

[0001] 本发明涉及一种能够快速进行外周血细胞分离的微流体装置，尤其涉及一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置。【背景技术】

[0002] 循环肿瘤细胞是从原有肿瘤组织脱落后内渗进入血液循环系统，并随血液在体内循环的肿瘤细胞。尽管人们对癌转移的机理和过程仍缺乏清楚的认识，但循环肿瘤细胞的作用与癌变转移有着直接的联系，已经得到了一致确认。因此，循环肿瘤细胞的数量和形态都可作为患者的病情发展预判依据，如病情的确诊、术后监测、病理学研究等。然而，要从外周血样中获取肿瘤细胞却是非常困难的。主要原因有两个：数量稀少、表面特异分子异构。因此，使用过滤法、梯度离心法、免疫磁珠分选法都无法获得满意的细胞回收率和纯度。

[0003] 循环肿瘤细胞的分离过程包含了富集和分离两个方面，需要满足三个要求：大通量处理、识别与捕获、高效释放。大通量处理解决的是目标细胞的数量问题，而准确捕获和释放是获取高纯度细胞的关键。然而，大通量处理与准确捕获也存在矛盾，前者要求细胞快速地流动以提高通量，后者则要求低速流动以提高识别效率。对于细胞识别，存在有标记识别和无标记识别两类，前者需要在对样品进行标记预处理才能用于分离，如磁珠、荧光标记等。后者则无需外加标记物，直接利用细胞自身特性进行操作。因而更符合实际需求。研究结果也证明，采用细胞表面特异分子识别的方法，具有更高的效率和选择性，也代表了技术发展的趋势。

[0004] 微流体技术的进步为上述问题的解决提供了新的方向。微流体系统可显著提高细胞与器件结构接触的频率，相应的也提高了被捕获的机率，利用多通道并行处理解决大通量处理与准确捕获之间的矛盾，提高处理效率。利用声表面波和介电泳的驱动方式，已经实现对多种微颗粒的无标记聚集和分离，具有很高的处理效率。然而，对于外周血中循环肿瘤细胞的获取，则需要有全新的设计。

[0005] 声表面波驱动效率高，可实现对微小颗粒水平面横向的操纵。介电泳能够在水平面、垂直面内实现微粒操纵，但存在作用力小，效率差的缺点。因此，将二者组合起来使用，相互配合。声表面波用于横向细胞分离，介电泳则与之配合驱动垂直面内细胞移动，解决悬浮细胞不能与识别表面接触的问题。因此，采用组合式场流分离和特异分子亲和识别的两步分离法，可以实现对外周血中循环肿瘤细胞的有效分离。【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，具有处理通量大、效率高、选择性好的特点，实现对稀有循环肿瘤细胞的快速获取。

[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

[0008] 一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，采用三层式结构，从上而下分别包括上盖板、通道板和基底板；上盖板上加工有流体主入口和两个出口，通道板上制作有微通道，并作为分离腔，三层结构叠加后，流体主入口与微通道一端连通，两个出口与微通道另一端连通，上盖板的下表面上制作有介电泳电极，电极布置方向与微通道倾斜，实现垂直方向和横向的驱动作用，基底板的上表面制作有声表面波换能器，声表面波换能器平行于微通道布置，声波场垂直于流动方向，基底板上还制作有用于细胞捕获的表面结构。

[0009] 进一步，基底板上的表面结构，为制作于基底板上表面的纳米粗糙度表面，并利用表面化学改性方法，在其上依次布置有连接体和细胞识别配体。

[0010] 进一步，上盖板为玻璃材质，并在其上采用剥离或刻蚀法加工有介电泳用叉指微电极，叉指电极与微通道倾斜布置，利用介电泳力驱动细胞横向和垂直分离。

[0011] 进一步，通道板为PDMS材质，利用SU-8光刻及模塑工艺制成，其上制作了微通道，通道板并与上盖板、基底板键合成一体，实现微通道封闭。

[0012] 进一步，基底板为铌酸锂压电材料，并采用剥离或刻蚀法制作了声表面波驱动的叉指电极。

[0013] 进一步，所述连接体包括生物素、链霉亲和素和树形大分子。

[0014] 进一步，所述细胞识别配体包括anti-EpCAM、EGFR和核酸适配体。

[0015] 本发明的组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，采用声表面波和介电泳驱动的场流分离组合方式，将红细胞从血样中分离出来。再以特异分子识别法从剩余的细胞中捕获循环肿瘤细胞。最后经过释放操纵，即可获得所需的对象。组合式的场流分离方式，可以加快处理速度提高效率，适用于大通量的样品处理。特异性分子识别方法具有很高的选择性，能够获得高纯度的捕获结果。

[0016] 该装置可实现对外周血细胞的快速分离，并从中捕获循环肿瘤细胞。改变识别配体的类别，可实现多种类型细胞的识别和捕捉，亦可用于对其他生物对象分离。用于细胞分离时，外周血样通过注射泵、蠕动泵等注入微通道中。调整声表面波的高频信号源，在通道内形成一个稳定的声波场并驱动细胞横向分类聚集。同时对介电泳信号进行调节，使其能在垂直方向上实现细胞驱动。首先被分离出的红细胞经过出口一流出，白细胞群则经过识别区域，最后经由出口二流出。分离结束后，在释放液的作用下，可在出口二收集到循环肿瘤细胞。

[0017] 装置采用场流分离和特异分子亲和识别两步分离法，前者将红细胞快速去除，后者则将目标细胞从白细胞混合群中捕获。相比于其他分离法，该装置具有处理通量大、效率高、选择性好的特点，可以实现对稀有循环肿瘤细胞的快速获取，满足病情诊断、细胞分析、病理学研究的需要，并能提高检测分析的实时性和准确性。【附图说明】

[0018] 图1为分离装置的原理图

[0019] 图2为分离装置的结构分解图

[0020] 图中：1上盖板，11流体主入口，12介电泳电极，13出口一，14出口二，2通道板，3基底板，31细胞捕获区，32声表面波换能器。【具体实施方式】

[0021] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

[0022] 如图1所示，本发明的分离装置的采用声表面波和介电泳驱动场流分离实现对红细胞的去除。当声表面波垂直于细胞流动方向时，声波场作用下的血细胞按照体积大小不同在横向分别聚集。选择适当的驱动信号，可使红细胞聚集于一边，而较大的白细胞聚集一边，实现红细胞分离。介电泳电极产生非均匀电场，可在垂直面内驱动细胞聚集，使各种细胞处于高度不同的区带。由于后续的识别区域位于通道下表面上，所以将通道上部的大细胞驱动下沉，靠近识别表面。同时将电极与细胞流动方向垂直布置，也可利用其介电泳力驱动细胞延横向移动，与声表面波分流相互配合。两种场流分离方式的配合使用，将血细胞分开成红细胞和白细胞两大群体，循环肿瘤细胞则混在较大的白细胞中间。接着白细胞经过识别区域，其上布置的细胞识别配体与循环肿瘤细胞表面的受体向结合，将目标细胞识别并固定在表面上。分离结束后，经过释放操纵即可获得循环肿瘤细胞样品，也可进行原位的培养和检测分析。

[0023] 参见图2，该分离装置采用三层式结构，分别为上盖板1、通道板2、基底板3。上盖板1为玻璃材质，其上加工有流体主入口11、出口一13和出口二14，并在上表面上安装相应的接口装置。上盖板1下表面上制作介电泳电极12，电极布置方向与通道倾斜，可同时实现垂直方向和横向的驱动作用。上盖板1的下表面上采用剥离或刻蚀法加工有介电泳用叉指微电极，叉指电极与微通道倾斜布置，利用介电泳力驱动细胞横向分离。

[0024] 通道板2为敞开式夹层板，其上的微通道结构需要与上盖板1和基底板3键合后密封。通道板2为PDMS材质，采用SU-8胶光刻和模塑工艺制作。

[0025] 基底板3为铌酸锂压电材料，键合表面上制作声表面波换能器32。采用剥离或刻蚀法制作声表面波驱动的叉指电极，表面波换能器32平行于微通道布置，声波场则垂直于流动方向。同时在基底板3上制作用于细胞捕获的纳米粗糙度表面，并在其上布置捕获用细胞识别配体，作为细胞捕获区31。

[0026] 分离装置的制作工艺简单，需要分别制作上盖板、基底板、通道板。上盖板制作叉指电极可采用剥离或刻蚀工艺，加工出流体出入孔。基底板上制作时先使用RIE工艺刻蚀纳米粗糙度结构，然后制作叉指换能器。接着对刻蚀出的纳米表面进行表面化学改性，依次固定连接体和识别配体。在通道板制作完成后，对其进行等离子表面氧化处理。接着将三层板依次键合起来，完成微通道的封闭。最后，安装微管道接口。

[0027] 连接体是在识别表面上布置识别配体的必要媒介，多以羟基羧基与氨基化学键缩合的方式固定于特定表面。分离装置可用的连接体有：纤维素、生物素、聚合链霉素、树形大分子等。识别配体是对目标细胞表面的特异分子受体有强烈亲和作用的物质，包括抗体、蛋白分子、核酸等。常用于循环肿瘤细胞识别的是anti-EpCAM、EPGR、核酸适配体等。根据不同的捕获目标需要进行不同的配体选择。

[0028] 该装置采用声表面波和介电泳驱动两种场流分离技术的组合，声表面波驱动下实现水平面内细胞的横向分离，介电泳驱动实现垂直面内细胞分层聚集，较大的白细胞群向下沉降，较小的红细胞则聚集在通道上部流动。预分离后的白细胞群经过识别区域，其中的循环肿瘤细胞被识别并固定于区域表面上。经过释放操作，即可得到所需的循环肿瘤细胞群。

[0029] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。