一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法

摘要

本发明公开了一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法，包括以下步骤：步骤一、制备琼胶寡糖；步骤二、菌种培养：制备MRS培养基，琼胶寡糖作为碳源，接种保加利亚乳杆菌OD600值为0.8的菌液，接种量为2％，无氧环境下，42℃，静置培养2‑3天；步骤三、液体菌保藏：在0D600值为1.2保加利亚乳杆菌液体中，添加浓度为1‑10g/L且聚合度为3‑8的琼胶寡糖，4℃下贮藏；步骤四、固体菌剂保藏：在0D600值为1.2保加利亚乳杆菌液体中，添加浓度为5g/L且聚合度为3的琼胶寡糖，喷雾干燥制备固体菌剂。本发明具有提高保加利亚乳杆菌液体和固态菌剂制备在保藏过程中活力的作用，可用于乳酸菌发酵企业及乳制品生产企业，以生产高活性乳酸菌制品以及高耐藏性的乳制品。

权利要求

1.一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、制备琼胶寡糖：将江蓠清洗除杂，烘干，加入江蓠重量30倍的水使江蓠充分溶胀，置于80℃的水浴中加热2h；高压灭菌，121℃灭菌20min；将江蓠趁热挤胶，用滤布包裹江蓠，并利用压力机挤压，收集挤胶滤出的多糖溶液，冷却、烘干、粉碎成颗粒，即得江蓠粗多糖；将冷却的粗多糖溶解水中，制成浓度为5g/L的多糖溶液，加入琼胶酶处理；加酶量为

15％(v/v)，酶活为300U/mL；酶解20-1280min，以制备寡糖溶液，冷冻干燥，或真空干燥成固体粉末，制得聚合度为3-8的琼胶寡糖；

步骤二、菌种培养：制备MRS培养基，琼胶寡糖作为碳源，接种保加利亚乳杆菌OD600值为

0.8的菌液，接种量为2％，无氧环境下，42℃，静置培养2-3天；

步骤三、液体菌保藏：在0D600值为1.2保加利亚乳杆菌液体中，添加浓度为1-10g/L且聚合度为3-8的琼胶寡糖，放置4℃下贮藏；

步骤四、固体菌剂保藏：在0D600值为1.2保加利亚乳杆菌液体中，添加浓度为5g/L且聚合度为3的琼胶寡糖，喷雾干燥制备固体菌剂，喷雾干燥条件为：麦芽糊精添加量25％，进风温度130℃，进风速度4m3/min，进料速度700mL/h，空气压力0.3Pa，制备固体菌剂，制备好的固体菌剂放置在常温或-20℃贮藏。

2.如权利要求1所述的一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法，其特征在于：所述步骤一中，酶解时间为20min，制得聚合度为8的琼胶寡糖。

3.如权利要求1所述的一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法，其特征在于：所述步骤一中，酶解时间为80min，制得聚合度为5的琼胶寡糖。

4.如权利要求1所述的一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法，其特征在于：所述步骤一中，酶解时间为1280min，制得聚合度为3的琼胶寡糖。

5.如权利要求1所述的一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法，其特征在于：所述步骤二中，MRS培养基的组成为：牛肉蛋白粉10g、鱼肉汁10g，酵母浸出汁粉5g，琼胶寡糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 0.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，蒸溜水

1000ml；121℃高压灭菌15min，调节pH6.2-6.4。

说明书

一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及菌种保藏的技术领域，尤其涉及一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法。

背景技术

[0002] 江蓠(Gracilaria)是多年生的大型红藻,属于红藻门,是我国广东、浙江、台湾沿海藻类养殖品种之一，主要作为渔业养殖饲料和生产食品胶原料。江蓠菜琼胶寡糖是一种非消化性低聚糖，对保加利亚乳杆菌的生长具有明显促进作用，并且具有抑制病原菌、腐败菌等有害菌的生长，能提高人体免疫力，改善内分泌系统，促进营养物质的吸收，对人体亚健康状态进行改善，对抗生素、激素、细胞毒性药物等所致的菌群失调所引起的肠炎、腹泻、便秘以及药物的副作用进行治疗，具有延年益寿的作用。因此江蓠菜琼胶寡糖是一种新型保健品以及食品添加剂或饲料添加剂。

[0003] 目前，在现有技术中还未有江蓠菜琼胶寡糖对益生菌的促进效果的报导，国内外主要研究寡糖的抗病毒、抗炎症、抗癌症等作用。工业生产益生菌发酵产品，往往出现产品益生菌数量不达标的问题。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法，本案由此产生。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法，利用江蓠菜琼胶寡糖作为保加利亚乳杆菌的碳源，保护保加利亚乳杆菌在低温贮藏下的活性，保护保加利亚乳杆菌在人体胃肠液中存活率，提高保加利亚乳杆菌的菌活力。

[0005] 为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

[0006] 一种琼胶寡糖作为保护剂保藏保加利亚乳杆菌的方法，包括以下步骤：

[0007] 步骤一、制备琼胶寡糖：将江蓠清洗除杂，烘干，加入江蓠重量30倍的水使江蓠充分溶胀，置于80℃的水浴中加热2h；高压灭菌，121℃灭菌20min；将江蓠趁热挤胶，用滤布包裹江蓠，并利用压力机挤压，收集挤胶滤出的多糖溶液，冷却、烘干、粉碎成颗粒，即得江蓠粗多糖；将冷却的粗多糖溶解水中，制成浓度为5g/L的多糖溶液，加入琼胶酶处理；加酶量为15％(v/v)，酶活为300U/mL；酶解20-1280min，以制备寡糖溶液，冷冻干燥，或真空干燥成固体粉末，制得聚合度为3-8的琼胶寡糖；

[0008] 步骤二、菌种培养：制备MRS培养基，琼胶寡糖作为碳源，接种保加利亚乳杆菌OD600值为0.8的菌液，接种量为2％，无氧环境下，42℃，静置培养2-3天；

[0009] 步骤三、液体菌保藏：在0D600值为1.2保加利亚乳杆菌液体中，添加浓度为1-10g/L且聚合度为3-8的琼胶寡糖，放置4℃下贮藏；

[0010] 步骤四、固体菌剂保藏：在0D600值为1.2保加利亚乳杆菌液体中，添加浓度为5g/L且聚合度为3的琼胶寡糖，喷雾干燥制备固体菌剂，喷雾干燥条件为：麦芽糊精添加量25％，进风温度130℃，进风速度4m3/min，进料速度700mL/h，空气压力0.3Pa，制备固体菌剂，制备好的固体菌剂放置在常温或-20℃贮藏。

[0011] 作为实施例的优选方式，所述步骤一中，酶解时间为20min，制得聚合度为8的琼胶寡糖。

[0012] 作为实施例的优选方式，所述步骤一中，酶解时间为80min，制得聚合度为5的琼胶寡糖。

[0013] 作为实施例的优选方式，所述步骤一中，酶解时间为1280min，制得聚合度为3的琼胶寡糖。

[0014] 作为实施例的优选方式，所述步骤二中，MRS培养基的组成为：牛肉蛋白粉10g、鱼肉汁10g，酵母浸出汁粉5g，琼胶寡糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温800.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，蒸溜水1000ml；121℃高压灭菌15min，调节pH6.2-6.4。

[0015] 采用本发明的技术方案后，具有以下有益效果：

[0016] 1.本发明利用江蓠菜琼胶寡糖作为保加利亚乳杆菌的生长碳源，有效提高了保加利亚乳杆菌在低温贮藏下和菌制剂下的活性以及在胃肠消化环境下的保护作用。

[0017] 2.本发明所使用的江蓠菜琼胶寡糖不会产生任何污染成分，更不会污染环境。本方法在实际生产中投资少见效快，适合推广应用。

[0018] 3.采用高压灭菌加热处理，可以有效的对江蓠菜进行加热处理，减少水浴加热时间，减少热能损耗，相应国家节能减排的号召。

附图说明

[0019] 图1为本发明不同聚合度琼胶寡糖对保加利亚乳杆菌在固态菌剂中的作用；

[0020] 图2为本发明不同浓度琼胶寡糖对保加利亚乳杆菌在固态菌剂中的作用；

[0021] 图3为本发明琼胶寡糖提高保加利亚乳杆菌在胃液模拟液中的耐受性作用；

[0022] 图4为本发明琼胶寡糖提高保加利亚乳杆菌在肠液模拟液中的耐受性作用。

具体实施方式

[0023] 酶活单位定义为每分钟产生1μg还原糖所需酶量。

[0024] 空白对照组：制备MRS培养基，MRS培养基的组成为：牛肉蛋白粉10g、鱼肉汁10g，酵母浸出汁粉5g，葡萄糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 0.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，蒸溜水1000ml；121℃高压灭菌15min，调节pH6.2-6.4；葡萄糖作为碳源，接种保加利亚乳杆菌OD600值为0.8的菌液，接种量为2％。无氧环境下，42℃，静置培养2-3天。

[0025] 江蓠菜琼胶寡糖组：制备江蓠菜琼胶寡糖，将琼胶寡糖代替MRS培养基中的葡萄糖，并利用不同聚合度的寡糖(DP3、DP5、DP8)和不同浓度寡糖(1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、10g/L)来对保加利亚乳杆菌进行培养。接种保加利亚乳杆菌OD600值为0.8的菌液，接种量为2％。无氧环境下，42℃，静置培养2-3天。

[0026] 实施例1：一种保加利亚乳杆菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法

[0027] 步骤一、江蓠除杂：将江蓠清洗除杂，至没有泥沙，水样清澈，烘干，加入江蓠重量30倍的水使江蓠充分溶胀，然后置于80℃的水浴中加热2h；

[0028] 步骤二、高压灭菌：对加热处理后的江蓠进行高压灭菌，将微生物杀灭，高压灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；

[0029] 步骤三、挤胶：将江蓠趁热挤胶，用滤布包裹江蓠，并利用压力机对装有江蓠的滤布进行挤压，收集挤胶滤出的多糖溶液；将收集的多糖溶液进行冷却、烘干、粉碎成颗粒装袋备用，放置在阴凉干燥处保存，即得江蓠粗多糖；

[0030] 步骤四、酶处理：将冷却的粗多糖溶解水中，制成浓度为5g/L的多糖溶液，加入琼胶酶处理；加酶量为15％(v/v)，酶活为300U/mL；酶解20-1280min，以制备寡糖溶液；

[0031] 步骤五、干燥：寡糖溶液进行冷冻干燥，或真空干燥成固体粉末，制得琼胶寡糖。

[0032] 作为实施例1的优选方式，所述步骤四中，酶解时间为20min，制得聚合度为8的琼胶寡糖。

[0033] 作为实施例1的优选方式，所述步骤四中，酶解时间为80min，制得聚合度为5的琼胶寡糖。

[0034] 作为实施例1的优选方式，所述步骤四中，酶解时间为1280min，制得聚合度为3的琼胶寡糖。

[0035] 实施例2：不同聚合度琼胶寡糖对提高保加利亚乳杆菌在低温贮藏下菌活力的影响

[0036] 利用以上制备寡糖方法制备出不同聚合度的琼胶寡糖，将其添加至已发酵达到OD600值为0.8的保加利亚乳杆菌的MRS培养基中，按照同一浓度的不同聚合度琼胶寡糖(DP3、DP5、DP8)添加至培养基中，培养条件为无氧环境下，4℃，静置培养，每隔3天取样至显微镜下观察活菌数量，如表1所示。

[0037] 表1不同聚合度琼胶寡糖提高保加利亚乳杆菌在低温贮藏下菌活力

[0038]

[0039] 结果表明，在江蓠菜琼胶寡糖(DP3)的条件下，对保加利亚乳杆菌在低温贮藏下的保护作用最好。

[0040] 实施例3：不同浓度江蓠琼胶寡糖对提高保加利亚乳杆菌在低温贮藏下菌活力的影响

[0041] 利用以上制备寡糖方法制备出不同浓度的琼胶寡糖，将其添加至已发酵达到OD600值为1.2的保加利亚乳杆菌的MRS培养基中，将聚合度3的不同浓度的琼胶寡糖(1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、10g/L)添加至培养基中，培养条件为无氧环境下，4℃，静置培养，每隔3天取样至显微镜下观察活菌数量，如表2所示。

[0042] 表2不同浓度江蓠琼胶寡糖提高保加利亚乳杆菌在低温贮藏下菌活力[0043]

[0044]

[0045] 结果表明，在江蓠菜琼胶寡糖浓度为1-10g/L条件下，对保加利亚乳杆菌在低温贮藏下具有保护作用，而在5g/L的条件下，对保加利亚乳杆菌在低温贮藏下的保护作用最好。

[0046] 实施例4：不同聚合度琼胶寡糖对保加利亚乳杆菌在固态菌剂制备中的作用[0047] 利用以上制备寡糖方法制备出不同聚合度的琼胶寡糖添加至已发酵达到OD600值为1.2的保加利亚乳杆菌的菌液中，将浓度为5g/L的不同聚合度琼胶寡糖(DP3、DP5、DP8)添加至混合液中，通过利用喷雾干燥机制备固态菌剂，喷雾干燥机工作参数为麦芽糊精添加量25％，进风温度130℃，进风速度4m3/min，进料速率700mL/h，空气压力0.3MPa。称取制备的固态菌剂1g进行涂布平板测定活菌数，如图1所示。

[0048] 结果表明，提高固态菌剂菌活力的制备中聚合度3-8均有效果，但最优寡糖聚合度为3。

[0049] 实施例5：不同浓度琼胶寡糖对保加利亚乳杆菌在固态菌剂制备中的作用[0050] 利用以上制备寡糖方法制备出不同浓度的琼胶寡糖添加至已发酵达到OD600值为1.2的保加利亚乳杆菌的菌液中，将聚合度为5的不同浓度琼胶寡糖(1g/L-10g/L)添加至混合液中，通过利用喷雾干燥机制备固态菌剂，喷雾干燥机工作参数为麦芽糊精添加量25％，进风温度130℃，进风速度4m3/min，进料速率700mL/h，空气压力0.3MPa。称取制备的固态菌剂1g进行涂布平板测定活菌数，如图2所示。

[0051] 结果表明，提高固态菌剂菌活力的制备中浓度1-10g/L均有效果最优寡糖浓度为5g/L。

[0052] 实施例6：琼胶寡糖提高保加利亚乳杆菌在胃肠模拟液中耐受性作用工艺流程[0053] 利用以上制备寡糖方法制备出聚合度3-8的琼胶寡糖，将已发酵达到OD600值为1.2的保加利亚乳杆菌的菌液与不同浓度琼胶寡糖混合，再与胃肠液按1:1(v/v)混合，培养条件为37℃水浴加热反应3h，静置培养，从0时每隔45min取样进行稀释涂布平板，平板培养条件为无氧环境下，在42℃生物培养箱静止培养2天，数菌落数量，最优条件如图3及图4所示。

[0054] 结果表明，提高消化道耐受性能力中最优寡糖添加量是聚合度为3和浓度为5g/L。

[0055] 在本发明中，平均聚合度3-8和浓度1-10g/L江蓠菜琼胶寡糖具有提高保加利亚乳杆菌液体和固态菌剂制备在保藏过程中活力的作用。本发明首次利用江蓠菜琼胶寡糖对益生菌培养成分进行添加或替换，使保加利亚乳杆菌在低温贮藏下减缓了菌体的死亡，提高了保加利亚乳杆菌的活性。本发明延长了保加利亚乳杆菌的保藏时间，且琼胶寡糖作为益生元对保加利亚乳杆菌在低温、消化环境下的保护作用大大增强，从而提高了产品益生菌的品质和经济价值。本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。