血液中激素的检测方法

摘要

本发明提供了一种血液中激素的检测方法，属于激素检测领域。该检测方法包括以下步骤：将血液与含有激素同位素内标的内标液混合并保存于滤纸片上，制成干血片。通过萃取从干血片得到提取液，并通过衍生化处理提取液得到检测液。通过液质联用检测检测液中的激素。本发明提供的检测方法中，将血液保存于滤纸片上，再通过萃取、衍生化过程，运用液质联用方法，实现了快速、有效地对血液中的激素进行定性和定量检测的目的。由于将血液保存于滤纸片上，以固体的形式保存，避免运输过程中可能带来的生物安全问题，并且可大大提高稳定性，从而避免微生物污染检测样品。

权利要求

1.一种血液中激素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将血液与含有激素同位素内标的内标液混合并保存于滤纸片上，制成干血片；

通过萃取从所述干血片得到提取液，并通过衍生化处理所述提取液得到检测液；以及通过液质联用检测所述检测液中的激素；

所述内标液是通过将所述激素同位素内标溶于乙腈溶液中，并由甲醇溶液定容制得；

所述衍生化处理的步骤包括：干燥所述提取液，并用盐酸羟胺水溶液复溶，于30～80℃衍生15～60分钟，得到所述检测液；

通过所述液质联用检测所述检测液中的激素包括以下步骤：取激素标准品，用甲醇溶解，得到标准液；

将所述内标液加入所述标准液中并用甲醇定容，然后加入胎牛血清和乙腈，离心取上清液，干燥后通过盐酸羟胺水溶液复溶进行衍生化处理，得到待测标准液；

将所述待测标准液和所述检测液通过液质联用检测，得到激素的种类和含量；

所述液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液，B为乙腈溶液，流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度：

0～0.5min，A：97％、B：3％；

0.5～3min，A：97％～5％、B：3％～95％；

3～3.01min，A：5％～97％、B：95％～3％；

3.01～11min，A：97％、B：3％；

所述液质联用检测的质谱条件为：ESI离子源，正离子MRM模式扫描，雾化气流速8-20L/min，气帘气流速8-20L/min，碰撞气流速5-15L/min，离子源电压2-4KV，离子源温度200-400℃；

所述键合相色谱柱为C18或C8色谱柱；

所述激素包括孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇，所述激素同位素内标包括d9-孕酮和d8-17α-羟孕酮，d5-11-脱氧皮质醇，d4-皮质酮，d5-皮质醇。

2.根据权利要求1所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，所述萃取的步骤包括：将所述干血片置于甲醇和乙腈的混合溶液中经超声、离心取上清液作为所述提取液，所述混合溶液中甲醇的体积百分数为20％～80％。

3.根据权利要求1所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，干燥所述提取液的方法为冷冻干燥或者氮气吹干。

4.根据权利1至3之一所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，制成所述干血片是将保存有混合所述内标液和所述血液的所述滤纸片并于室温下风干3小时以上。

说明书

血液中激素的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及激素检测领域，具体而言，涉及一种血液中激素的检测方法。

背景技术

[0002] 激素对机体的各种生理过程如代谢、生长、发育、繁殖等起重要的调节作用，是生命中的重要物质。激素在人体内的含量很低，但调节作用极为显著，且在机体内的变化对健康有很大的影响。目前临床激素检测亦已广泛开展。然而，涉及血液中的激素检测时，由于血液存在长距离运输、保存极为不便的问题，而且存在运输、保存过程中受到生物安全问题的影响，导致现有的血液激素检测方式受到较大的限制，而且现有的传统方法稳定性不高、灵敏度低、特异性差、易产生交叉污染等不足。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种血液中激素的检测方法。针对血液运输过程中可能带来的生物安全问题，同时易受微生物污染、不易存储和远距离运输的缺点，将血液制作为干血片，以提高其安全性、稳定性，避免微生物的污染，有效解决了激素检测中血液无法长距离运输、保存的问题，且该检测方法还具有灵敏度高、稳定性好的优点。

[0004] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

[0005] 一种血液中激素的检测方法，包括以下步骤：

[0006] 将血液与含有激素同位素内标的内标液混合并保存于滤纸片上，制成干血片；通过萃取从干血片得到提取液，并通过衍生化处理提取液得到检测液；以及通过液质联用检测检测液中的激素；

[0007] 所述内标液是通过将所述激素同位素内标溶于乙腈溶液中，并由甲醇溶液定容制得；

[0008] 所述衍生化处理的步骤包括：干燥所述提取液，并用盐酸羟胺水溶液复溶，于30～80℃衍生15～60分钟，得到所述检测液；

[0009] 通过所述液质联用检测所述检测液中的激素包括以下步骤：

[0010] 取激素标准品，用甲醇溶解，得到标准液；

[0011] 将所述内标液加入所述标准液中并用甲醇定容，然后加入胎牛血清和乙腈，离心取上清液，干燥后通过盐酸羟胺水溶液复溶进行衍生化处理，得到待测标准液；

[0012] 将所述待测标准液和所述检测液通过液质联用检测，得到激素的种类和含量；

[0013] 所述液质联用检测的液相色谱条件为：

[0014] 色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液，B为乙腈溶液，流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度：

[0015] 0～0.5min，A：97％、B：3％；

[0016] 0.5～3min，A：97％～5％、B：3％～95％；

[0017] 3～3.01min，A：5％～97％、B：95％～3％；

[0018] 3.01～11min，A：97％、B：3％；

[0019] 所述液质联用检测的质谱条件为：ESI离子源，正离子MRM模式扫描，雾化气流速8-20L/min，气帘气流速8-20L/min，碰撞气流速5-15L/min，离子源电压2-4KV，离子源温度
200-400℃；

[0020] 所述键合相色谱柱为C18或C8色谱柱；

[0021] 所述激素包括孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇，所述激素同位素内标包括d9-孕酮和d8-17α-羟孕酮，d5-11-脱氧皮质醇，d4-皮质酮，d5-皮质醇。

[0022] 本发明的血液中激素的检测方法的有益效果：

[0023] (1)本发明将血液保存在滤纸片上制成干血片，以固体的形式固化进行保存，其稳定性大大提高，避免了血液样本的安全性问题及微生物对检测样品的污染，解决了血液中激素检测面临的长距离保存、运输的问题。

[0024] (2)本发明通过萃取和衍生化处理，可使得干血片中的各个组分充分溶出，从而真实地反应待测样品的中激素的情况，使得检测结果的准确性和稳定性大大提高。

[0025] (3)本发明采用液相分离和质谱分析联用的检测方法，实现对血液中激素的定性和定量分析，灵敏度高，并且精度高、速度快。

[0026] (4)本发明提供的检测方法中，采用激素一个代谢通路中的6种激素(包括孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇)的激素同位素内标，可对血液中的6种激素(包括孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇)同时进行定性和定量分析，满足实际检测的需要，具有较高的应用价值。

附图说明

[0027] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0028] 图1为本发明实施例的色谱图。

具体实施方式

[0029] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0030] 下面针对血液中激素的检测方法进行具体说明。

[0031] 一种血液中激素的检测方法包括以下步骤：

[0032] 步骤S1.将血液与含有激素同位素内标的内标液混合并保存于滤纸片上，制成干血片；

[0033] 步骤S2.通过萃取从干血片得到提取液，并通过衍生化处理提取液得到检测液；以及

[0034] 步骤S3.通过液质联用检测检测液中的激素。

[0035] 该血液中激素的检测方法是将血液用内标液保存在滤纸上制成干血片，再通过萃取和衍生化处理，运用液相分离-质谱联用检测的方法，实现对血液中激素进行检测的目的。血液以固体形式被固化保存，其稳定性高，保存和运输均更方便，并且可以有效地避免保存和运输过程中的生物安全问题。由于采用内标液与血液混合的方式保存，后续测量更便于进行定量分析，且激素同位素内标具有易被色谱柱分离、不易受干扰的特点。此外，通过衍生化处理，可以使激素发生结构上的改变，从而更利于提高检测的灵敏度和准确性。

[0036] 在检测过程中，不同的激素之间的离子化过程中的差异大，且离子化效率低，从而造成其检测灵敏度很差。在实际检测中，对不同激素的高精度和定量检测就相对比较困难。但是，经过衍生化处理后，激素的离子化效率得以提高，进而降低检测难度、提高精度。

[0037] 具体地，在步骤S1中，将血液保存于滤纸片上的方法为：向血液中加入内标液，混匀，然后转移至滤纸片上并于室温下风干3小时以上。

[0038] 较佳地，内标液可通过以下方法制作而成：将激素同位素内标溶解于乙腈溶液，并由甲醇溶液定容制得。乙腈溶液和甲醇溶液溶解更利于提取需要的激素，使得后续的检测结果能够更真实反映血液中的激素情况。在步骤S2中，萃取的步骤具体包括：将干血片置于甲醇和乙腈的混合溶液中，混匀，然后以10000～18000rpm的转速离心取上清液，得到提取液。为了将保存在干血片上的血液样本充分提取，将干血片放入甲醇和乙腈的混合溶液中并采用例如超声、恒温震荡、杂交炉混匀等方式，使得干血片上的血液的各个组分充分溶解到甲醇和乙腈的混合溶液中。

[0039] 在实际检测过程中，可将保存有血液的干血片打孔，孔径为3mm，获得直径为3mm的取样圆片，取多片取样圆片置于离心管中，加入甲醇和乙腈的混合溶液后进行超声20～90分钟、离心操作。优选地，为了保证干血片上的血液中的各个组分能够充分溶解至甲醇和乙腈的混合溶液中，混合溶液中甲醇的体积百分数优选为20～80％。

[0040] 在步骤S2中，衍生化处理的步骤具体为：干燥提取液，然后用盐酸羟胺水溶液复溶，于30～80℃衍生15～60分钟，得到检测液。优选地，盐酸羟胺的水溶液浓度为80-120mg/mL。为了提高干燥效率，避免干燥过程中对激素的破坏，优选采用冷冻干燥或者氮气吹干提取液。盐酸羟胺与人体内激素如孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇进行衍生化反应，使得孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇的检测更容易。

[0041] 在步骤S3中，通过液质联用检测检测液中的激素包括以下步骤：

[0042] 取激素标准品，用甲醇溶解，得到标准液；

[0043] 将内标液加入标准液中并用甲醇定容，然后加入胎牛血清和乙腈，离心取上清液，干燥后通过盐酸羟胺水溶液复溶进行衍生化处理，得到待测标准液；以及

[0044] 将待测标准液和检测液通过液质联用检测检测，得到激素的种类和含量。

[0045] 在步骤3中通过液质联用采用内标法对血液中激素进行检测。在检测过程中，配置待测标准液和检测液，使用液相分离-质谱联用检测仪进行检测，以各激素的峰面积与激素同位素内标的峰面积之比对血液中各激素的浓度进行线性回归，得到各激素的线性方程，从而对血液中各激素进行定量检测。

[0046] 本发明提供的检测方法中，以孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇6种激素为激素标准品，可对血液中的孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇6种甾体激素通路中的激素进行定性和定量分析。相应地，内标液中的内标物选择为激素同位素内标d9-孕酮和d8-17α-羟孕酮，d5-11-脱氧皮质醇，d4-皮质酮，d5-皮质醇。

[0047] 为了确保液质联用检测结果的准确性，特采用下述的液相色谱条件和质谱条件，经过液相色谱和质谱检测后，可高效地对血液中的激素进行定性和定量分析。本方法分析速度快，完成一次分析只需10分钟。

[0048] 其中，液质联用检测的液相色谱条件为：

[0049] 色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液，较佳地，A为10-50％甲酸水溶液；B为乙腈溶液。流动相的流速为0.1-2.0mL/min；

[0050] 流动相的梯度(以体积百分比计)：

[0051] 0～0.5min，A：97％、B：3％；

[0052] 0.5～3min，A：97％～5％、B：3％～95％；

[0053] 3～3.01min，A：5％～97％、B：95％～3％；

[0054] 3.01～11min，A：97％、B：3％；

[0055] 较佳地，键合相色谱柱可采用C18色谱柱或C8色谱柱。

[0056] 液质联用检测的质谱条件为：ESI离子源，正离子MRM模式扫描，雾化气流速8-20L/min，气帘气流速8-20L/min，碰撞气流速5-15L/min，离子源电压2-4KV，离子源温度200-400℃。

[0057] 以下结合实施例对本发明的血液中激素的检测方法作进一步的详细描述。

[0058] 实施例1

[0059] 仪器和材料：

[0060] 美国Agilent公司6495串联质谱仪，Angilent 1290液相色谱仪；C18色谱柱，规格为50mm×3.0mm，2.7μm。

[0061] 药品与试剂：

[0062] 激素标准品：孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇，均购买自Sigma公司。

[0063] 激素同位素内标：d9-孕酮和d8-17α-羟孕酮，d5-11-脱氧皮质醇，d4-皮质酮，d5-皮质醇，均购买自Sigma公司。

[0064] 甲酸：色谱纯，Merck公司。

[0065] 乙腈：色谱纯，Merck公司。

[0066] 盐酸羟胺：色谱纯，Merck公司。

[0067] 双蒸水：Thermo公司。

[0068] 血样：志愿者血液。

[0069] 检测过程中，各种溶液的配置方法如下：

[0070] 标准液：

[0071] 将上述6种激素标准品(包括孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇)分别用甲醇溶解配成10mg·mL-1的甲醇溶液，再混合成各激素浓度均为10μg·-1mL 的标准液。

[0072] 内标液：

[0073] 取适量激素同位素内标(包括d9-孕酮和d8-17α-羟孕酮，d5-11-脱氧皮质醇，d4-皮质酮，d5-皮质醇)用乙腈溶解并稀释为1mg·mL-1的储备液，再用甲醇溶液稀释定容至含量为0.1mg·mL-1的内标液。

[0074] 待测标准液：

[0075] 分别取5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL标准液于1.5ml离心管中，并分别加入20μL内标液，用甲醇分别定容至1mL，得到不同浓度的标准品溶液。各取标准品溶液20～100μL，并加入50～200μL的胎牛血清、600μL的乙腈，充分混匀，然后离心并分别取上清液，将上清液冻干后加入20～200μL、20～75％盐酸羟胺复溶并于37～75℃条件下衍生化处理，得到待测标准液。

[0076] 检测液：

[0077] 取待测血液50-1000μL，加入占血液体积的1/10的内标液，充分混匀，然后直接保存在滤纸片上，在室温下风干3小时以上，得到含有血液和激素同位素内标的干血片。在制得的干血片上打孔，孔径为3mm，获得直径为3mm的取样圆片，取1～5取样圆片置于1.5mL离心管中，向离心管中加入0.3～1.5mL的甲醇和乙腈的混液溶液(甲醇占混液溶液的体积百分数为20～80％)，并超声20～90分钟，之后以10000～18000rpm的转速离心5～20分钟后取上清液，将上清液冻干后用20～200μL、20～75％的盐酸羟胺复溶，并于37-75℃衍生化处理15～60分钟，得到检测液(待测定激素含量的样品溶液)。

[0078] 将制得的待测标准液和检测液进样至液相色谱-质联用仪中进行检测。

[0079] 其中，液相色谱的条件为：

[0080] 流动相：A相和B相的混合溶液，其中，A相为甲酸水溶液，甲酸占甲酸水溶液体积的10～50％；B相为乙腈液体。

[0081] 流动相的流速为0.1-2mL/min。

[0082] 流动相的梯度(以体积百分比计)为：

[0083] 0～0.5min，A：97％、B：3％；

[0084] 0.5～3min，A：97％～5％、B：3％～95％；

[0085] 3～3.01min，A：5％～97％、B：95％～3％；

[0086] 3.01～11min，A：97％、B：3％。

[0087] 色谱柱：C18色谱柱，规格为2.7μm，3.0×50mm；进样量：10μL。

[0088] 质谱条件为：

[0089] 采用ESI离子源，正离子MRM模式扫描，喷雾口位置3:7；雾化气流速：10L/min，气帘气流速：10L/min，碰撞气流速：8L/min，离子源电压：2500V，离子源温度：400℃。.[0090] 将待测标准液中检测到的各激素的峰面积与激素同位素内标的峰面积之比(x)对待测标准液中各激素的浓度(Y)进行线性回归，得到各激素的线性方程。其结果如表1所示。

[0091] 表1 6种激素的线性方程及在检测液中的激素含量

[0092]

[0093] 如表1所示，检测液中的激素含量是将检测液中各激素的峰面积与激素同位素内标的峰面积之比，分别代入表1中的线性方程，得到检测液中各激素的浓度。

[0094] 其检测结果如图1所示，图1中各数字表示的组分为：1为皮质醇；2为皮质酮；3为11-脱氧皮质醇；4为脱氧皮质酮；5为17α-羟孕酮；6为孕酮。

[0095] 从图1中可以看出，出峰顺序为：皮质醇；皮质酮；11-脱氧皮质醇；脱氧皮质酮；17α-羟孕酮；孕酮。

[0096] 试验例1

[0097] 本发明提供的检测方法的回收率分析

[0098] 取标准液200μL，并加入20μL内标液，并用甲醇溶液补足到1ml，使其充分混合后直接取10-100μL上清液滴到滤纸片上，风干3小时以上，萃取后进行盐酸羟胺衍生后，15000rpm离心取上清，利用液质联用检测仪进行检测，检测过程中的液质联用的液相色谱、质谱条件均与上述实施例1的检测待测标准液和检测液的条件相同。

[0099] 将检测到的标准液的各激素的峰面积与激素同位素内标的峰面积之比代入表1的线性方程，计算标准液中各激素的含量，进而计算绝对回收率，本试验例1所计算出的绝对回收率为80-110％。另将通过新鲜血液中添加标准液干血片处理后的检测结果中激素的峰面积与激素同位素内标的峰面积之比，与新鲜血液直接检测的结果中激素的峰面积与同位素内标的峰面积之比进行比较，计算得相对回收率，本试验例1计算出的相对回收率为83～105％。

[0100] 重复3次操作，结果相对标准偏差2.01％-3.47％，样品回收率在80.23％-107.56％，表明本发明检测方法的重现性好。

[0101] 本发明检测方法精密度准确度分析(日内差日间差分析)

[0102] 在同实施例1相同的液相色谱质谱条件下，取不同体积的混合标准品储备液进行检测，1天内连续进样3次，3天内每天进样一次，结果日内CV在1.94％-3.53％波动，日间CV在3.69％-13.35％波动，符合要求。

[0103] 由上述结果可以，本发明提供的血液中激素的检测方法，激素的损失少，检测的结果可以真实反应血液中的激素含量和种类。

[0104] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。