不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解方法

摘要

本发明提供针对不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解方法，包括：向不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水溶液中加入过氧化氢溶液与无机盐溶液对多糖进行水解，于50℃‑80℃反应3‑5小时，反应结束后，将含有不同大小多糖水解片段的反应混合物进行超滤浓缩，然后过Sepharose 4FF凝胶层析柱进行纯化，收集kD值0.2‑0.65的分离峰，经超滤浓缩、冻干后得到不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物。采用本方法可以实现对不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解，将荚膜多糖水解为不同大小的片段，所得水解片段均保留了抗原性，符合多价肺炎结合疫苗制备工艺的要求，可用于制备适合于2岁以下婴幼儿的多价肺炎结合疫苗。

权利要求

1.不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解方法，其特征在于，向不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水溶液中加入过氧化氢溶液与硫酸锌溶液对多糖进行水解，于50℃-80℃反应3-5小时，反应结束后，将含有不同大小多糖水解片段的反应混合物进行超滤浓缩，然后过Sepharose 4FF凝胶层析柱进行纯化，收集Kd 值0.2-0.65的分离峰，经超滤浓缩、冻干后得到不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物；

对于1、2、3、4、18C、23F血清型的荚膜多糖，反应体系中荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：9：0.161；过柱纯化后，收集Kd 值0.2-0.6的分离峰；

对于6A、7F、9N、14、19F血清型的荚膜多糖，反应体系中荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：6：0.161；过柱纯化后，收集Kd 值0.3-0.6的分离峰；

对于5、6B、9V、19A、22F、33F血清型的荚膜多糖，反应体系中荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：4.5：0.161；过柱纯化后，收集Kd 值0.35-0.65的分离峰。

说明书

不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解方法

技术领域

[0001] 本发明涉及疫苗制备领域，具体地说，涉及不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解方法。

背景技术

[0002] 肺炎链球菌肺炎或称肺炎球菌肺炎，是由肺炎链球菌或称肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)所引起的肺炎，通常急骤起病，以高热、寒战、咳嗽、血痰及胸痛为特征。在过去的两个世纪，没有几种传染性病原体在全球的发病率和死亡率可与肺炎链球菌相匹敌，每年导致全球一百万5岁以下儿童死亡。肺炎链球菌仍然是社区获得性肺炎的主要原因，在成人中主要引起大叶性肺炎，在儿童中常引发细菌性肺炎、脑膜炎、中耳炎、胸膜炎等疾病。在没有抗生素之前，约有70％以上因肺炎菌血症住院的病人死亡。婴幼儿中
20-48％的急性中耳炎和50％的化脓性中耳炎是由肺炎链球菌引起的，菌血症感染会引起较高的死亡率。据估计，肺炎链球菌性肺炎在成人的发病率每年为0.1-0.47％,病死率为
11％。我国肺炎发病率一直很高，近40多年来，其菌血症死亡率一直徘徊在25-29％之间，院外获得性肺炎中肺炎链球菌性肺炎可达46-76％。针对肺炎链球菌的感染，多年来一直采用抗生素治疗，然而目前耐药菌株多达96％以上，且呈现多重耐药性状。因此，开发疫苗以预防该菌引起的疾病至关重要。

[0003] 已发现的肺炎链球菌有90多个血清型，是建立在荚膜抗原的微少差异及家兔免疫器官对荚膜化学成份之间的微小差异加以识别的，并产生对每种抗原的特异性抗体基础上进行分型的。肺炎链球菌的荚膜抗原是迄今为止细菌性疫苗中抗原结构最复杂的，其型特异性多糖是由许多重复结构单元组成的大分子聚合体，构成了胸腺非依赖性抗原(thymus-independent，TI)的特性。荚膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)即是细菌的毒性因子又是一种重要的保护性抗原。

[0004] 利用化学方法纯化的细菌荚膜多糖制备组分疫苗是20世纪疫苗发展的重要成就之一，也是第二次疫苗革命的标志之一。在世界范围内广泛使用的多糖疫苗如流行性脑膜炎球菌A、C、Y、W135等4价多糖疫苗，肺炎23价多糖疫苗，伤寒Vi多糖疫苗等。大量临床试验结果表明，接种多糖疫苗引起的副反应十分罕见，这些疫苗对于预防成人和大龄儿童的相应感染方面效果显著。令人遗憾的是多糖疫苗在年幼儿童中产生的抗体亲合力低，对婴幼儿的效果甚微或根本无效。将细菌荚膜多糖与蛋白载体通过化学方式结合可以解决这个缺点，可将多糖胸腺不依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原，从而启动T辅助淋巴细胞产生一系列的免疫增强效应，并产生免疫记忆应答；1987年B型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗的成功研制，开创了结合疫苗发展史上的又一个里程碑，结合疫苗成为儿童疫苗研究中的一个热点。随后国际市场上陆续出现了A+C、ACYW135群脑膜炎结合疫苗和7价、10价、13价肺炎链球菌结合疫苗。其它各类含荚膜多糖或含脂多糖的细菌的结合疫苗也陆续上市。

[0005] 由于肺炎链球菌荚膜多糖的分子量较大，导致多糖溶液的粘度也大，造成多糖活化、结合物制备和纯化等步骤难以操作。使用大分子多糖作为原料多糖将导致结合物过度交联、结合物的分子量过大，从而对产品的质量造成风险，可能使免疫效果变差。为改变荚膜多糖的分子量大的这种情况，在进行活化、结合工艺之前，对肺炎球菌荚膜多糖进行降解处理。

[0006] 常用的肺炎球菌荚膜多糖降解方法有以下几种：1、乙酸降解法；2、三氟乙酸降解法；3、氢氧化钠降解法。

[0007] 本发明采用过氧化氢法降解肺炎球菌荚膜多糖，并对该方法进行了改良，以获得相对分子量变小的肺炎链球菌荚膜多糖或寡糖，从而满足活化结合的工艺要求。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供利用过氧化氢实现对不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖水解的方法。

[0009] 为了实现本发明目的，本发明的不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解方法，包括：向不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水溶液中加入过氧化氢溶液与无机盐溶液对多糖进行水解，于50℃-80℃反应3-5小时，反应结束后，将含有不同大小多糖水解片段的反应混合物进行超滤浓缩，然后过Sepharose 4FF凝胶层析柱进行纯化，收集kD值0.2-0.65的分离峰，经超滤浓缩、冻干后得到不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物。

[0010] 本发明所述的不同血清的型肺炎链球菌包括血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、9N、14、18C、19F、19A、22F、23F、33F。

[0011] 本发明所述的无机盐包括硫酸锌、硫酸铜、硫酸镍、硫酸锰等；优选硫酸锌。

[0012] 前述的方法，反应体系中荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：4.5-9：0.161。

[0013] 对于1、2、3、4、18C、23F血清型的荚膜多糖，反应体系中荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：9：0.161。过柱纯化后，收集kD值0.2-0.6的分离峰。

[0014] 对于6A、7F、9N、14、19F血清型的荚膜多糖，反应体系中荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：9：0.161。过柱纯化后，收集kD值0.3-0.6的分离峰。

[0015] 对于5、6B、9V、19A、22F、33F血清型的荚膜多糖，反应体系中荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：9：0.161。过柱纯化后，收集kD值0.35-0.65的分离峰。

[0016] 前述的方法，优选使用截留分子量10kD的超滤膜进行超滤浓缩。

[0017] 本发明还提供采用上述方法获得的肺炎链球菌荚膜多糖水解产物在制备肺炎链球菌多糖疫苗或肺炎链球菌结合疫苗中的应用。

[0018] 采用本发明提供的改良的过氧化氢法可以实现对不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解，将荚膜多糖水解为不同大小的片段，所得水解片段均保留了抗原性，未破坏抗原决定簇的基本结构，符合多价肺炎结合疫苗制备工艺的要求，可用于制备适合于2岁以下婴幼儿的多价肺炎结合疫苗。

具体实施方式

[0019] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中使用的10kD超滤膜购自PULL公司；Sepharose 4FF凝胶层析柱购自GE公司。

[0020] 本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

[0021] 实施例1 1、2、3、4、18C、23F型肺炎球菌荚膜多糖的水解

[0022] 用注射用水溶解多糖1-5mg，使其完全溶解，加入终浓度为3％的过氧化氢与终浓度为1mM硫酸锌溶液(相当于荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：9：0.16)，反应温度50℃-80℃，反应3-5小时。用10kD超滤膜进行超滤浓缩，0.85％氯化钠溶液超滤换液，换液5次，每次8倍体积稀释。浓缩到反应混合物体积的5倍，用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0.2-0.6的分离峰，收集后超滤浓缩至原上样体积，冻干回收肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物。采用琼脂双扩散法，检测水解后产物，与肺炎球菌血清形成明显的沉淀线。

[0023] 实施例2 6A、7F、9N、14、19F型肺炎球菌荚膜多糖的水解

[0024] 用注射用水溶解多糖1-5mg，使其完全溶解，加入终浓度为2％的过氧化氢与终浓度为1mM硫酸锌溶液(相当于荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：6：0.161)，反应温度50℃-80℃，反应3-5小时。用10kD超滤膜进行超滤浓缩，0.85％氯化钠溶液超滤换液，换液5次，每次8倍体积稀释。浓缩到反应混合物体积的5倍，用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0.3-0.6的分离峰，收集后超滤浓缩至原上样体积，冻干回收肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物。采用琼脂双扩散法，检测水解后产物，与肺炎球菌血清形成明显的沉淀线。

[0025] 实施例3 5、6B、9V、19A、22F、33F型肺炎球菌荚膜多糖的水解

[0026] 用注射用水溶解多糖1-5mg，使其完全溶解，加入终浓度为1.5％的过氧化氢与终浓度为1mM硫酸锌溶液(相当于荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：4.5：0.161)，反应温度50℃-80℃，反应3-5小时。用10kD超滤膜进行超滤浓缩0.85％氯化钠溶液超滤换液，换液5次，每次8倍体积稀释。浓缩到反应混合物体积的5倍，用Sepharose4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0.35-0.65的分离峰，收集后超滤浓缩至原上样体积，冻干回收肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物。采用琼脂双扩散法，检测水解后产物，与肺炎球菌血清形成明显的沉淀线。

[0027] 实施例4不同处理时间对1、2、3、4、18C、23F型肺炎球菌荚膜多糖降解的影响[0028] 用注射用水溶解多糖1-5mg，使其完全溶解，加入终浓度为3.5％的过氧化氢与终浓度为1mM硫酸锌溶液(相当于荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：9：0.161)，反应温度50℃-80℃，反应时间分三组1-3、3-5、5-7小时。用10kD超滤膜进行超滤浓缩，0.85％氯化钠溶液超滤换液，换液5次，每次8倍体积稀释。浓缩到反应混合物体积的5倍，用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0.2-0.6的分离峰，收集后超滤浓缩至原上样体积，冻干回收肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物。采用琼脂双扩散法，检测水解后产物，与肺炎球菌血清形成明显的沉淀线。分别计算三组的回收率(表1)。

[0029] 表1 1、2、3、4、18C、23F型荚膜多糖降解后回收率

[0030]

[0031] 从表1可以看出，实验组2与实验组3的降解回收率无差异，但实验组2的降解时间要比实验组3时间短，因此最终选择实验组2的降解条件，降解时间3-5小时。

[0032] 实施例5不同处理温度对6A、7F、9N、14、19F型肺炎球菌荚膜多糖降解的影响[0033] 用注射用水溶解多糖1-5mg，使其完全溶解，加入终浓度为2％的过氧化氢与终浓度为1mM硫酸锌溶液，反应温度分为3组，20℃-50℃、50℃-80℃、80℃-100℃，反应3-5小时。用10kD超滤膜进行超滤浓缩，0.85％氯化钠溶液超滤换液，换液5次，每次8倍体积稀释。浓缩到反应混合物体积的5倍，用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0.3-0.6的分离峰，收集后超滤浓缩至原上样体积，冻干回收肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物。采用琼脂双扩散法，检测水解后产物，与肺炎球菌血清形成明显的沉淀线。分别计算三组的回收率(表
2)。

[0034] 表2 6A、7F、9N、14、19F型荚膜多糖水解后回收率

[0035]

[0036] 从表2可以看出，实验组1的降解温度低，实验组3的降解温度高，两组的降解回收率都低于实验组2，因此最终选择实验组2的降解温度50℃-80℃。

[0037] 实施例6不同浓度的硫酸锌溶液对5、6B、9V、19A、22F、33F型肺炎球菌荚膜多糖降解的影响

[0038] 用注射用水溶解多糖1-5mg，使其完全溶解，加入终浓度为1.5％的过氧化氢，反应温度50℃-80℃，反应3-5小时，分为三组，1组为加入3mM硫酸锌溶液(相当于荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：4.5：0.483)，2组为加入1mM硫酸锌溶液(相当于荚膜多糖、过氧化氢与硫酸锌的质量比为1-5：4.5：0.161)，3组为不加入硫酸锌溶液组。用10kD超滤膜进行超滤浓缩，0.85％氯化钠溶液超滤换液，换液5次，每次8倍体积稀释。浓缩到原水解体积的5倍，用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，收集kD值0.3-0.6的分离峰，收集后超滤浓缩至原上样体积，冻干回收肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物。采用琼脂双扩散法，检测水解后产物，与肺炎球菌血清形成明显的沉淀线。分别计算三组的回收率。

[0039] 表3 5、6B、9V、19A、22F、33F型荚膜多糖水解后回收率

[0040]

[0041] 从表3可以看出，实验组1和实验组3的水解回收率明显低于实验组2的水解回收率，因此最终选择实验组2的实验条件，使用1mM硫酸锌溶液。

[0042] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。