一株低温生防菌株及其应用转让专利
申请号 : CN201510762018.X
文献号 : CN105670958B
文献日 : 2018-12-25
发明人 : 张淑梅 , 刘宇帅 , 姜威 , 陈静宇 , 孟利强 , 胡基华 , 李晶 , 曹旭
申请人 : 黑龙江省科学院微生物研究所
摘要 :
本发明公开了一株低温生防菌株及其应用，所述低温生防菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)WSWGH‑10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11541，保藏日期为2015年10月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号。该生防菌能够在低温条件下生长繁殖，能够产生噬铁素、几丁质酶、脂肽类和蛋白类等多种抗菌物质，还具有降解纤维素能力。该菌株抑菌谱广，能够抑制大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、玉米茎基腐病菌、水稻恶苗病菌、水稻稻曲病菌、水稻立枯病菌、马铃薯丝核病菌、刺五加根腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌等病原真菌以及病原细菌(烟草细菌性病害角斑病菌)，而且还具有促进植物生长功能。
权利要求 :
1.一株低温生防菌株，其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus），保藏编号为CGMCC No. 11541。
2.权利要求1所述低温生防菌株在低温条件抑制植物病原真菌以及烟草细菌性病害角斑病菌生长中的应用，所述植物病原真菌为大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、玉米茎基腐病菌、水稻恶苗病菌、水稻稻曲病菌、水稻立枯病菌、马铃薯丝核病菌、刺五加根腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌。
3.根据权利要求2所述的低温生防菌株在低温条件抑制植物病原真菌以及烟草细菌性病害角斑病菌生长中的应用，其特征在于所述低温温度为10℃。
4.权利要求1所述低温生防菌株在促进植物生长中的应用。
5.权利要求1所述低温生防菌株在降解纤维素和蛋白中的应用。
说明书 :
一株低温生防菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一株低温生防菌株及其应用。
背景技术
[0002] 农作物病害是农业生产上的一种自然灾害，直接影响作物的产量和品质，造成的损失十分巨大。由于化学农药抗药性和污染问题的日益严重，环境友好的微生物农药成为农作物病害防治的重要手段。目前，微生物农药以活菌制剂为主，应用中防效不稳定是共性问题。生防菌能否在土壤环境中生存和繁殖是影响其实际防病效果的关键。由于通常的播种时节是在土壤温度较低的早春或秋季，现在所用的微生物农药菌株均为常温菌，在低温条件下生长缓慢或停止生长，降低了生物农药的应用效果，阻碍微生物农药的广泛推广应用，因此低温生防菌株的获得可为低温适生性生物菌肥及生物农药的研发提供优质的菌源材料，在生物防治中具有潜在的研究及开发优势。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一株低温生防菌株，该生防菌能够在低温条件下生长繁殖，能够产生噬铁素、几丁质酶、脂肽类和蛋白类等多种抗菌物质，还具有降解纤维素能力。该菌株抑菌谱广，能够抑制大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、玉米茎基腐病菌、水稻恶苗病菌、水稻稻曲病菌、水稻立枯病菌、马铃薯丝核病菌、刺五加根腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌等病原真菌以及病原细菌(烟草细菌性病害角斑病菌)，而且还具有促进植物生长功能。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005] 一株低温生防菌株，其为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)WSWGH-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11541，保藏日期为2015年10月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号。
[0006] 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)WSWGH-10形态特性：革兰氏阳性好氧菌，杆状，有芽孢，大小为0.2～0.5×1.0～1.5μm；菌落白色圆形，皱褶。
[0007] 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)WSWGH-10生理生化特性：利用葡萄糖，氧化酶、接触酶、M.R、明胶液化、淀粉水解、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、吲哚产生和石蕊牛奶均为阳性，V.P和尿素酶阴性；生长温度范围6～30℃，最适生长温度20℃。
[0008] 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)WSWGH-10分子生物学鉴定结果：通过16S rDNA序列和看家基因gyrB序列比对，与甲基营养型芽孢杆菌同源性为99％。
[0009] 本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)WSWGH-10能够产生噬铁素、几丁质酶、脂肽类和蛋白类等多种抗菌物质，还具有降解纤维素能力。
[0010] 本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)WSWGH-10能够在低温条件10℃有效抑制大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、玉米茎基腐病菌、水稻恶苗病菌、水稻稻曲病菌、水稻立枯病菌、马铃薯丝核病菌、刺五加根腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌等病原真菌以及病原细菌(烟草细菌性病害角斑病菌)的生长，抑制率大于82％，抑菌谱广，抑菌率高。
[0011] 本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)WSWGH-10具有促进植物生长功能，其50倍和100倍稀释液能够促进玉米种子发芽，发芽率为90.3％和94.5％，大于空白对照(88.2％)，并且芽长、根长和根数显著大于空白对照。
[0012] 保藏信息：
[0013] 分类命名：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)；
[0014] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0015] 保藏编号：CGMCC No.11541；
[0016] 保藏日期：2015年10月21日；
[0017] 保藏地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号。
附图说明
[0018] 图1为菌体形态；
[0019] 图2为菌落形态；
[0020] 图3为菌株16s rRNA系统进化树；
[0021] 图4为菌株gyrB基因系统进化树；
[0022] 图5为菌株分泌噬铁素能力检测；
[0023] 图6为菌株分泌纤维素酶能力检测；
[0024] 图7为菌株分泌几丁质酶能力检测；
[0025] 图8为菌株分泌蛋白酶能力检测；
[0026] 图9为抗菌蛋白抑菌活性测定；
[0027] 图10为脂肽类抗生素抑菌活性测定；
[0028] 图11为菌株对烟草角斑病菌的抑制结果；
[0029] 图12为菌株促进玉米种子发芽结果。
具体实施方式
[0030] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0031] 本发明提供了一株低温生防菌株及其应用，具体内容如下：
[0032] 1)低温生防菌株的筛选鉴定：
[0033] 低温生防菌株WSWGH-10是从黑龙江省鹤岗地区冬季冻土中分离筛选得到。筛选按以下方法进行：取5g冻土解冻后研碎，放入含有50ml无菌水的三角瓶中，10℃震荡3h，用无菌水稀释至10-7，分别取10-5、10-6和10-7稀疏度的菌液0.1ml涂布在LB平板上，10℃培养箱中静置培养3～7d，挑单菌落划线转接新的LB平板，10℃培养箱中静置培养3～7d。以大豆根腐病菌为指示菌，采用对峙培养方法筛选生防菌株，即可获得低温生防菌株。
[0034] 对菌株进行形态、培养特性和生理生化特性鉴定，具体步骤如下：将低温培养24小时的菌体进行革兰氏染色后在400倍显微镜下观察菌体大小；将菌液倍比稀释后涂布在LB培养基平板上，观察菌落形态和颜色；将菌株进行氧化酶，接触酶，葡萄糖发酵，V.P，M.R，淀粉水解、尿素酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、吲哚产生、明胶液化和石蕊牛奶试验，结果表明该菌株为革兰氏阳性好氧菌，杆状，有芽孢，大小为0.2～0.5×1.0～1.5μm(图1)；菌落白色圆形，皱褶(图2)；能够利用葡萄糖；氧化酶、接触酶、M.R、明胶液化、淀粉水解、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、吲哚产生和石蕊牛奶均为阳性，V.P和尿素酶阴性。生长温度范围6～30℃，最适生长温度20℃。
[0035] 对菌株进行16S rDNA序列分析和看家基因gyrB分析：取1mL菌液离心收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN BIOTECH)提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以16SrDNA通用引物和芽孢杆菌gyrB基因通用引物进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将特异DNA条带进行测序，在GenBank中进行同源序列比对，用Mega 5.0软件构建系统发育树(图3～4)，结果与甲基营养型芽孢杆菌的16S rDNA序列和gyrB基因同源性为99％，结合形态、培养特性和生理生化特性，鉴定为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。
[0036] 2)菌株分泌蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和噬铁素能力检测：
[0037] 采用蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和噬铁素鉴别平板法检测该菌株是否能够产生蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和噬铁素。蛋白酶检测：将菌株接种在蛋白酶检测培养基平板上(脱脂奶粉1％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％)，10℃培养3～7d，观察有无酶解透明圈。纤维素酶检测：将菌株接种在纤维素刚果红培养基上(硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.05％，纤维素粉2％，刚果红0.02％，琼脂粉2％)，10℃培养3～7d，观察有无酶解圈。几丁质酶检测：将菌株接种在几丁质培养上(胶体几丁质1％，蛋白胨0.2％，酵母粉
0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸铁0.001％磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，刚果红
0.02％，琼脂粉2％)10℃培养3～7d，观察有无酶解圈。噬铁素检测：将菌株接种CAS-平板，
10℃培养3～7d，观察有无酶解圈。结果表明该菌株能够分泌蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和噬铁素，说明该菌株不仅具有生防功能还具有降解纤维素和蛋白的能力(图5-8)。
0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸铁0.001％磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，刚果红
0.02％，琼脂粉2％)10℃培养3～7d，观察有无酶解圈。噬铁素检测：将菌株接种CAS-平板，
10℃培养3～7d，观察有无酶解圈。结果表明该菌株能够分泌蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和噬铁素，说明该菌株不仅具有生防功能还具有降解纤维素和蛋白的能力(图5-8)。
[0038] 3)低温生防菌的抗菌物质确定：
[0039] 抗菌蛋白：将菌株在LB培养基中10℃、170r/min培养3d，4000r/mim离心，收集上清液，采用硫酸铵分级沉淀方法获得蛋白，先加硫酸铵至30％饱和度，4℃过夜沉淀，10000r/mim离心20min，收集沉淀，得沉淀I。上清液再加入硫酸铵至50％、70％和90％饱和度，4℃过夜沉淀，10000r/mim离心20min,收集沉淀II、III和IV，用PBS缓冲液溶解，透析除盐，浓缩后以大豆根腐病菌为指示菌检测抑菌活性，结果表明沉淀II、III和IV都具有抑菌活性(图9)，说明该菌株能够产生多种抗菌蛋白。
[0040] 脂肽类抗生素：将菌株在LB培养基中10℃、170r/min培养3d，4000r/mim离心，收集上清液，采用盐酸沉淀法获得脂肽类抗生素。向上清液中加入浓盐酸至pH 2，4℃放置过夜，次日10000r/mim离心20min,收集沉淀，用甲醇抽提，采用纸片法以大豆根腐病菌为指示菌检测抑菌活性，结果脂肽类抗生素具有抑菌活性(图10)，说明该菌株还能够产生脂肽类抗生素。
[0041] 4)低温生防菌的抑菌谱测定：
[0042] 采用菌丝生长速度法测定菌株WSWHG-10对10种植物病原真菌(大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、玉米茎基腐病菌、水稻恶苗病菌、水稻稻曲病菌、水稻立枯病菌、马铃薯丝核病菌、刺五加根腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌)抑制情况。取0.1ml低温培养48h菌液涂布于PDA平板上，在平板中心接种病原菌菌丝块(直径5mm)，涂布无菌水作对照，10℃培养7d，测定菌落直径，按以下公式计算抑菌率。抑菌率％＝对照组菌落直径-对照组菌落直径/对照组菌落直径Х100％。结果表明该菌株对10种病原真菌具有很好的抑制效果，抑制率达
82.0～90.3％(表1)，说明该菌株抑菌谱广，抑菌能力强。
82.0～90.3％(表1)，说明该菌株抑菌谱广，抑菌能力强。
[0043] 表1菌株对病原真菌的抑菌结果
[0044]
[0045] 采用抑菌圈法测定菌株WSWHG-10对引起烟草细菌性病害的病原菌(角斑病菌)的抑制情况，取0.1ml病原细菌涂布于LB平板上，在中心放灭菌钢圈，在钢圈中加入0.05ml生防菌液，10℃培养7d，观察有无抑菌圈，结果在钢圈周围有抑菌圈，说明生防菌WSWHG-10能够抑制该病原细菌生长(图11)。以上结果说明该菌株抑菌谱广，不仅对多种植物病原真菌具有很强的抑制作用，对细菌性病害也有很好的抑制作用。
[0046] 5)低温生防菌的促生长测定：
[0047] 将培养48h的菌液用无菌水稀释50和100倍，将玉米种子浸泡在2个处理液中4d，取出放于含水滤纸上，28℃保湿培养3d，计算发芽率，以清水处理为对照。结果表明50和100倍稀释液促进种子发芽，发芽率为90.3％和94.5％，大于空白对照(88.2％)，并且芽长、根长和根数显著大于空白对照(表2，图12)。
[0048] 表2菌株对玉米种子发芽的影响
[0049]