哺乳动物冲卵液及其配制方法和应用

摘要

本发明提供一种哺乳动物冲卵液及其配制方法，所述冲卵液包括Ⅰ液、Ⅱ液和犊牛血清；所述Ⅰ液包括氯化钠以及氯化钾、氯化钙和氯化镁中的至少一种；所述Ⅱ液包括磷酸氢二钠和/或其水合物以及果糖，任选包括磷酸二氢钾。其配制方法为：用水分别配制Ⅰ液和Ⅱ液，120℃高压灭菌15‑20分钟后，将Ⅰ液和Ⅱ液按比例混合，并向混合液中添加适量犊牛血清即得。本发明还提供所述冲卵液在哺乳动物非手术法胚胎移植技术中的应用。本发明提供的哺乳动物冲卵液，制备简单，渗透压及pH范围(pH7.1‑7.4)更接近供体子宫内的生理环境，能够延长胚胎在体外保存时间，有利于牛、羊胚胎规模化生产和胚胎移植技术的推广应用。

权利要求

1.一种哺乳动物冲卵液，其特征在于，所述冲卵液包括Ⅰ液、Ⅱ液和犊牛血清；

所述Ⅰ液包括氯化钠5.0-10.0g/L、氯化钾0-0.5g/L、氯化钙0-0.5g/L和氯化镁0-0.5g/L；

所述Ⅱ液包括磷酸氢二钠1.0-2.0g/L或七水合磷酸氢二钠1.0-3.0g/L或十二水合磷酸氢二钠1.0-3.0g/L、磷酸二氢钾0-0.5g/L和D-果糖1.0-3.0g/L；

使用时，将Ⅰ液和Ⅱ液按1:2-2:1的体积比混合，然后向混合液中添加10-15v/v%的犊牛血清。

2.根据权利要求1所述的冲卵液，其特征在于，所述Ⅰ液包括氯化钠7.0-9.0g/L、氯化钾

0.1-0.3g/L、氯化钙0.1-0.3g/L和氯化镁0.1-0.3g/L。

3.根据权利要求2所述的冲卵液，其特征在于，所述Ⅰ液包括氯化钠8.0g/L、氯化钾

0.2g/L、氯化钙0.1g/L和氯化镁0.1g/L。

4.根据权利要求1所述的冲卵液，其特征在于，所述Ⅱ液包括磷酸氢二钠1.0-1.2g/L或七水合磷酸氢二钠2.0-2.2g/L或十二水合磷酸氢二钠2.6-3.0g/L、磷酸二氢钾0.1-0.3g/L和D-果糖1.0-1.5g/L。

5.根据权利要求4所述的冲卵液，其特征在于，所述Ⅱ液包括十二水合磷酸氢二钠

2.9g/L、磷酸二氢钾0.2g/L和D-果糖1.0g/L。

6.根据权利要求1-5任一项所述的冲卵液，其特征在于，使用时，将Ⅰ液和Ⅱ液按1:1的体积比混合。

7.权利要求1-6任一项所述冲卵液的配制方法，其特征在于，用去离子水或蒸馏水，按照各组分含量分别配制Ⅰ液和Ⅱ液，120℃高压灭菌15-20分钟后，将Ⅰ液和Ⅱ液按比例混合，然后向混合液中添加犊牛血清，即得。

8.权利要求1-6任一项所述冲卵液在哺乳动物非手术法胚胎移植技术中的应用，所述应用为非治疗目的；所述哺乳动物选自牛、羊、马、小鼠。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物为牛。

说明书

哺乳动物冲卵液及其配制方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及动物胚胎移植技术领域，具体地说，涉及一种哺乳动物冲卵液及其配制方法和应用。

背景技术

[0002] 超数排卵和胚胎移植技术(MOET)在牛、羊改良和育种中已经广泛应用。在MOET过程中，胚胎(卵)回收效率的高低直接影响了后续胚胎移植的进行。胚胎(卵)的回收一般在超排供体配种3～8天后进行，所采用的胚胎(卵)回收方法分为手术法和非手术法。牛的胚胎回收方法主要采用非手术法，其具体操作过程是用带金属芯的冲卵管插入一侧供体子宫角，给气囊充气，固定冲卵管，抽出金属芯，用配制好的冲卵液把位于子宫角的胚胎冲洗出来。目前，国内常用TCM-199、Hank’s液等进口合成缓冲液作为牛胚胎冲卵液使用，由于其价格昂贵，合成条件要求严格等问题，影响了牛超数排卵技术的推广和应用。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种哺乳动物冲卵液及其配制方法。

[0004] 本发明的另一目的是提供上述冲卵液在哺乳动物非手术法胚胎移植技术中的应用。

[0005] 为了实现本发明目的，本发明的一种哺乳动物冲卵液，所述冲卵液包括Ⅰ液、Ⅱ液和犊牛血清；

[0006] 所述Ⅰ液包括氯化钠以及氯化钾、氯化钙和氯化镁中的至少一种；所述Ⅱ液包括磷酸氢二钠和/或其水合物以及果糖，任选包括磷酸二氢钾。

[0007] 具体地，所述Ⅰ液包括氯化钠5.0-10.0g/L、氯化钾0-0.5g/L、氯化钙0-0.5g/L和氯化镁0-0.5g/L。优选地，所述Ⅰ液包括氯化钠7.0-9.0g/L、氯化钾0.1-0.3g/L、氯化钙0.1-0.3g/L和氯化镁0.1-0.3g/L。更优选地，所述Ⅰ液包括氯化钠8.0g/L、氯化钾0.2g/L、氯化钙
0.1g/L和氯化镁0.1g/L。

[0008] 所述Ⅱ液包括磷酸氢二钠1.0-2.0g/L或七水合磷酸氢二钠1.0-3.0g/L或十二水合磷酸氢二钠1.0-3.0g/L、磷酸二氢钾0-0.5g/L和D-果糖1.0-3.0g/L。优选地，所述Ⅱ液包括磷酸氢二钠1.0-1.2g/L或七水合磷酸氢二钠2.0-2.2g/L或十二水合磷酸氢二钠2.6-3.0g/L、磷酸二氢钾0.1-0.3g/L和D-果糖1.0-1.5g/L。更优选地，所述Ⅱ液包括十二水合磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钾0.2g/L和D-果糖1.0g/L。

[0009] 使用时，将Ⅰ液和Ⅱ液按1:2-2:1的体积比(优选体积比1:1)混合，然后向混合液中添加10-15v/v％的犊牛血清，即得所述哺乳动物冲卵液。

[0010] 本发明还提供所述冲卵液的配制方法，用去离子水或蒸馏水，按照各组分含量分别配制Ⅰ液和Ⅱ液，120℃高压灭菌15-20分钟后，将Ⅰ液和Ⅱ液按比例混合，然后向混合液中添加犊牛血清，即得。

[0011] 本发明进一步提供所述冲卵液在哺乳动物非手术法胚胎移植技术中的应用。

[0012] 本发明所述哺乳动物包括但不限于牛、羊、马、小鼠。优选地，所述哺乳动物为牛。

[0013] 本发明提供的哺乳动物冲卵液，制备简单，渗透压及pH范围(pH7.1-7.4)更接近供体子宫内的生理环境，能够延长胚胎在体外保存时间，有利于牛、羊胚胎规模化生产和胚胎移植技术的推广应用。

具体实施方式

[0014] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0015] 实施例1哺乳动物冲卵液及其制备

[0016] 冲卵液I液的配制：使用电子天平按表1比例称取氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁，去离子水或蒸馏水充分溶解，120℃高压灭菌15-20分钟，室温静置保存。

[0017] 冲卵液II液的配制：使用电子天平按表2比例称取十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和D-果糖，去离子水或蒸馏水充分溶解，120℃高压灭菌15-20分钟，室温静置保存。

[0018] 冲卵液的配制：将Ⅰ液和Ⅱ液按表3比例充分混合，然后添加混合液10-15v/v％的犊牛血清，即得哺乳动物冲卵液。

[0019] 表1 冲卵液I液配方

[0020]

[0021] 表2 冲卵液II液配方

[0022]

[0023] 表3 冲卵液配方

[0024]

[0025] 实施例2不同冲卵液对奶牛胚胎生产和胚胎移植的影响

[0026] 1、供体牛：选择180头，18-20月龄青年奶牛为供体。

[0027] 2、供体牛超排处理：超排采用常规方法，即连续4天注射促卵泡成熟激素(FSH)，剂量逐日递减。具体为：供体牛发情周期任意埋植CIDR(第0天)，第5-8天早、晚各肌注FSH，第7天注射FSH同时分别肌注前列腺素(PG)，同时晚上撤除CIDR。FSH注射总剂量为7.8-8.4mg。

[0028] 3、人工授精：供体发情后12小时第一次人工授精，间隔12小时后第二次人工授精。每次使用1支冷冻细管精液，输精部位为子宫体。

[0029] 4、胚胎采集：供体母牛配种后第7天采用非手术方法回收胚胎。每侧子宫角反复冲洗6～7次，所用冲卵液为实施例1中制备的冲卵液A～G，CN102864122A中公开的马属动物冲卵液及TCM-199(几种冲卵液的渗透压与pH值比较见表4)，冲卵液使用量为250-400mL。

[0030] 5、胚胎移植：选择30枚可用胚胎，随机分为2组，每组15枚胚胎，分别保存在上述冲卵液中，室温保存2小时之后进行胚胎移植。

[0031] 结果表明，相比于马属动物冲卵液和TCM-199，使用本发明制备的冲卵液用于牛的胚胎回收和胚胎移植，获得的可用胚胎数和受体胚胎移植受胎率更高，提高了牛超数排卵的效率(表5和表6)。

[0032] 表4 几种冲卵液的渗透压与pH值比较

[0033]

[0034] 表5 不同冲卵液对奶牛胚胎生产的影响(单位：头，枚)

[0035]

[0036] 表6 不同冲卵液的保存对胚胎移植的影响

[0037]

[0038]

[0039] 实施例3黑安格斯肉牛的胚胎生产

[0040] 1、供体牛：选择34头，18-22月龄青年黑安格斯肉牛为供体。

[0041] 2、供体牛FSH注射剂量为10.0mg，所用冲卵液为实施例1中制备的冲卵液A，具体操作同实验例2中的描述。

[0042] 结果表明，使用冲卵液A超排黑安格斯肉牛能够获得可用胚胎8.3枚(表7)。

[0043] 表7 黑安格斯肉牛胚胎生产结果(单位：头，枚)

[0044]

[0045] 以上结果表明，利用本发明配制的冲卵液能够提高牛超数排卵效率和胚胎移植受胎率。冲卵液制备方法简单、成本低廉，有利于胚胎在体外的短期保存，能够满足牛、羊胚胎的规模化生产需要，促进了胚胎移植技术的推广应用。

[0046] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。