用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒

摘要

一种用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，该试剂盒中含有酶标板、洗涤液、样品稀释液、兔抗血清、酶标二抗、底物A液、底物B液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清，其中所述酶标板包被有O型FMDV基因工程抗原。本发明试剂盒使用固相阻断法，与传统间接ELISA试剂盒比，降低了非特异性抗体干扰，检测结果更准确，且不区分样品宿主来源。本发明试剂盒使用基因工程技术制备的蛋白和血清多抗进行试剂盒生产，简单安全，成本低，可广泛应用于O型FMD疫苗免疫效果监测与疫情监测。

权利要求

1.一种用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，该试剂盒中含有酶标板、洗涤液、样品稀释液、兔抗血清、酶标二抗、底物A液、底物B液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清，其中所述酶标板包被有O型FMDV基因工程抗原；

所述酶标二抗采用HRP标记的羊抗兔IgG抗体；

所述兔抗血清是由O型FMDV基因工程抗原免疫兔子制备，血清抗体经辛酸-硫酸铵法和G蛋白柱法进行初步纯化，然后用O型FMDV基因工程抗原和标签抗原进行亲和层析纯化，去除了非特异性抗体。

2.根据权利要求1所述的用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，其中所述酶标板包被O型FMDV基因工程抗原的过程为：用包被缓冲液将抗原稀释，以100μL/孔的量加入酶标板，4℃包被12h，用洗涤液洗涤3次；加入封闭液，200μL/孔，4℃封闭12h；甩去封闭液，洗板3次，置于37℃干燥，用铝箔真空密封。

3.根据权利要求2所述的用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，所述包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。

4.根据权利要求2所述的用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，所述封闭液为含10％胰蛋白胨的PBS缓冲液。

说明书

用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测FMDV抗体的试剂盒，特别涉及一种可用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，属于生物制品检测技术领域。

背景技术

[0002] 口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的急性、高度接触性传染病，主要侵害偶蹄动物，偶见于人和其它动物。世界动物卫生组织(Office International des Epizooties，OIE)将其列为法定申报的传染病，我国将其列一类动物疫病。FMDV在全世界有7个血清型，包括O、A、C、亚洲I(Asia l)、南非I(SAT 1)、南非II(SAT 2)和南非III(SAT 3)，血清型之间无交叉免疫现象。
目前我国FMDV流行毒株主要为O型和A型，其中O型FMDV基因型众多，流行广泛，严重危害畜牧养殖业发展。

[0003] 我国对FMD采取强制性免疫策略，疫苗免疫效果成为影响FMD防控的关键所在。疫苗免疫效果的监测主要有两种方法，正向间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。IHA简单易行，但其结果判断较为主观，且受血凝抗原影响较大，在国际上已不再使用。ELISA方法操作自动化强，降低了主观因素干扰，适用于大量临床样本的抗体监测。常用ELISA方法包括VP1结构蛋白抗体间接ELISA和液相阻断ELISA。VP1蛋白抗体间接ELISA是以FMDV的VP1蛋白作为包被抗原捕获血清特异性抗体，然后通过酶标二抗识别血清抗体，最后经底物显色进行信号放大。间接ELISA操作简便，但该方法具有种属特异性，在临床上需针对不同宿主制备试剂盒，应用繁琐。此外，间接ELISA受非特异性因素影响较大，而且只能检测一种血清抗体，如IgG。

[0004] 液相阻断ELISA使用全病毒灭活抗原与血清抗体进行体外中和试验，然后通过双抗体夹心法捕获过剩抗原，最后经酶标二抗进行底物显色与信号放大。液相阻断ELISA是OIE推荐的检测FMDV抗体的标准方法，在世界范围内应用广泛。但是该方法也有缺点：(1)使用全病毒灭活抗原，涉及病毒培养、灭活与浓缩纯化，对生产条件、生产人员素质和生产过程要求比较严格，同时存在生物安全风险；(2)全病毒抗原的制备较为复杂，涉及细胞培养以及病毒繁殖，生产周期长，产量也受限制；(3)全病毒抗原生产需要使用P3实验室、超速离心机等高端仪器设施，不利于推广应用。

[0005] 随着免疫学的不断发展进步，基于FMDV中和表位的亚单位疫苗、多肽疫苗等新型疫苗将凭借更高的纯度与免疫精准度逐步替代传统灭活疫苗。与此同时，针对FMDV抗体建立安全、敏感、特异的检测方法对疫苗的免疫效果监测具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种用于检测O型FMDV抗体的间接固相阻断ELISA试剂盒，利用基因工程技术表达的病毒蛋白作为包被抗原，可针对O型FMDV特异性抗体进行检测，且不区分样品宿主来源。

[0007] 本发明试剂盒的检测原理是样品中抗FMDV抗体与包被抗原结合导致兔抗血清与抗原的结合量减少，形成“包被抗原-兔抗血清-酶标抗体”复合物，最后加入底物进行显色反应，显色深浅与样品中抗体含量成反比。

[0008] 本发明的试剂盒中含有酶标板、洗涤液、样品稀释液、兔抗血清、酶标二抗、底物A液、底物B液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清，其中所述酶标板包被有O型FMDV基因工程抗原。

[0009] 具体地，其中所述酶标板包被O型FMDV基因工程抗原的过程为：用包被缓冲液将抗原稀释，以100uL/孔的量加入酶标板，4℃包被12h，用洗涤液洗涤3次；加入封闭液，200uL/孔，4℃封闭12h；甩去封闭液，洗板3次，置于37℃干燥，用铝箔真空密封。

[0010] 优选情况下，所述包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。

[0011] 优选情况下，所述封闭液为含10％胰蛋白胨的PBS缓冲液。

[0012] 在本发明的一个优选实施例中，所述酶标二抗采用HRP标记的羊抗兔IgG抗体。

[0013] 在本发明的一个具体实施例中，其中所述兔抗血清是由O型FMDV基因工程抗原免疫兔子制备。血清抗体经辛酸-硫酸铵法和G蛋白柱法进行初步纯化，然后用O型FMDV基因工程抗原和标签抗原进行亲和层析纯化，去除了非特异性抗体，抗体纯度高。与单克隆抗体相比，所述血清抗体制备简单、成本低，具有多个抗原表位结合位点，与包被抗原结合能力更强。

[0014] 本发明的积极效果是：

[0015] 1、本发明试剂盒所使用的包被抗原为基因工程表达，不涉及病毒培养。相比传统液相阻断ELISA试剂盒，其生产与使用过程中生物安全性好。

[0016] 2、本发明试剂盒使用固相阻断法，与传统间接ELISA试剂盒比，降低了抗原非特异性抗体的干扰，检测结果更准确。

[0017] 3、本发明试剂盒避免了使用样品宿主来源的酶标二抗，与传统间接ELISA试剂盒比，不受样品的宿主来源限制，可用于多种动物血清样品检测，使用方便。

[0018] 4、本发明试剂盒使用基因工程技术制备的蛋白和血清多抗进行试剂盒生产，操作简单安全，成本低，有益于推广应用。

具体实施方式

[0019] 根据本发明的用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，试剂盒内设有洗涤液、样品稀释液、酶标二抗、底物A液、底物B液、终止液、封板膜，还包括O型FMDV阴阳性对照血清，包被了O型FMDV抗原蛋白的酶标板，以及能够与包被抗原特异性结合的兔抗血清。其中兔抗血清与包被抗原具有很高的结合活性，是由O型FMDV抗原蛋白免疫兔子制备。

[0020] 下面具体介绍本发明试剂盒内各试剂的来源(或制备过程)、试剂盒的测试原理及测试过程。

[0021] 下述实施例中的主要原材料的来源为：HRP标记羊抗兔IgG和O型FMDV基因工程抗原购自洛阳佰奥通实验材料中心。O型FMDV液相阻断ELISA试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所。其它试剂和材料均是来源于商业途径。所述的实验方法，若无特别说明，均为常规实验方法。

[0022] 一、试剂盒内各试剂的来源和制备过程

[0023] 1.1酶标板的制备

[0024] (1)酶标板的包被过程

[0025] 所述酶标板是以基因工程技术表达的O型FMDV基因工程抗原蛋白作为包被抗原，用pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗原进行稀释，以100uL/孔的量加入酶标板，4℃包被12h，用洗涤液洗涤3次。加入封闭液，200uL/孔，4℃封闭12h。甩去封闭液，洗板3次，置于37℃干燥，用铝箔真空密封。

[0026] (2)包被抗原最佳工作浓度的确定

[0027] 采用方阵滴定法确定抗原蛋白的最佳包被浓度。用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原蛋白，浓度分别为1ug/mL、0.5ug/mL、0.25ug/mL、0.125ug/mL、0.0625ug/mL、0.03125ug/mL，横向加入酶标板，4℃包被12h。加10％的胰蛋白胨，200uL/孔，37℃封闭2h。阴阳性兔抗血清同时做倍比稀释1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800，纵向加入酶标板，组成方阵进行间接ELISA。每孔加终止液50uL，测定OD450nm值。选择阳性OD值接近1.0，阳性OD值/阴性OD值(P/N值)最大时的抗原包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度。确定的抗原最佳工作浓度为0.0625ug/mL。

[0028] (3)封闭液和封闭时间的确定

[0029] 用已确定的抗原最适工作浓度包被酶标板，分别用含3％明胶的PBS、含10％脱脂奶粉的PBS、含10％胰蛋白胨的PBS作为封闭液。37℃分别封闭30min、1h、2h和3h。加底物显色，读取OD450nm值。选择阳性OD值接近1.0，P/N值最大时的封闭液和封闭时间作为最适条件。选择含10％胰蛋白胨的PBS作为最佳封闭液，封闭时间为2h。

[0030] 1.2酶标二抗的制备

[0031] Tris 2.42g，酶稳定剂0.8g，氯化钠8.5g，红染料2g，新生牛血清100ml，Proclin 300 0.5ml，曲拉通X-100 1.5ml，加蒸馏水850ml，小心加入盐酸1.65ml，充分混匀，调节pH值7.0，定容至1000ml，加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体0.2ml，搅拌均匀，用0.22μm的除菌滤器过滤。无菌分装。

[0032] 1.3兔抗血清的制备

[0033] 选用健康的成年大耳白兔，在免疫前取血收集非免疫血清作为对照。将O型FMDV基因工程抗原与完全弗氏佐剂混匀乳化，进行兔背部皮下多点注射，每只兔子500μg。每隔2周加强免疫1次，加强免疫时使用弗氏不完全佐剂，每只兔子250μg。三免后14天，采血进行效价检测。效价达到1∶104时，颈动脉放血处死动物，分离血清。血清使用辛酸-硫酸铵法和G蛋白柱法进行初步纯化，然后用O型FMDV基因工程抗原和标签抗原进行亲和层析，以去除非特异性抗体。纯化后血清置-20℃保存。

[0034] 1.4阴性对照血清的制备

[0035] 选用5周龄健康仔猪，经O型FMDV液相阻断ELSIA试剂盒鉴定为O型FMDV抗体阴性猪，经PCR方法鉴定为O型FMDV抗原阴性猪。颈动脉放血处死动物，分离血清，用辛酸-硫酸铵沉淀法和G柱亲和层析法纯化血清。用阴性对照血清稀释液将纯化的血清作10倍稀释，充分混匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，作为阴性对照血清，置-20℃保存。

[0036] 1.5阳性对照血清的制备

[0037] 选用5周龄健康仔猪，经O型FMDV液相阻断ELISA试剂盒鉴定为O型FMDV抗体阴性猪，经PCR方法鉴定为O型FMDV抗原阴性猪。免疫O型FMDV灭活苗，用O型FMDV液相阻断ELISA试剂盒进行效价测定。效价达到1∶512时，颈动脉放血处死动物，分离纯化血清。用阳性对照血清稀释液将纯化的血清作10倍稀释，充分混匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，作为阳性对照血清，置-20℃保存。

[0038] 1.6样品稀释液的制备

[0039] 磷酸二氢钠1.28g，磷酸氢二钠0.41g，氯化钠20.09g，指示剂0.2g，新生牛血清50ml，Proclin 300 0.5ml，加蒸馏水950ml，充分混匀，调节pH值6.0，定容至1000ml。然后分装。

[0040] 1.7洗涤液的制备

[0041] 磷酸二氢钾4g，十二水磷酸氢二钠58g，氯化钠160g，Proclin 300 0.5ml，吐温-20 10ml，加蒸馏水定容至1000ml。然后分装。

[0042] 1.8底物A液和底物B液的制备

[0043] 底物A液：柠檬酸2.10g，结晶乙酸钠12.25g，过氧化脲0.6g，加蒸馏水950ml，充分混匀，调节pH值5.0，加蒸馏水定容至1000ml。分装。

[0044] 底物B液：柠檬酸2.10g，EDTA 0.3g，TMB-HCl 0.6g，加蒸馏水950ml，充分混匀，调节pH值3.0，加蒸馏水定容至1000ml。分装。

[0045] 1.9终止液的制备

[0046] 取蒸馏水850ml，小心加入硫酸108.5ml，溶解完全，放凉后定容至1000ml。分装。

[0047] 二、测试过程和原理

[0048] 2.1测试过程

[0049] 步骤1：稀释待测样品，以100uL/孔的剂量加入酶标板，37℃孵育30min。甩干，洗板3次，3min/次。

[0050] 步骤2：稀释兔抗血清，添加剂量100uL/孔，37℃孵育30min。

[0051] 步骤3：甩干，洗板，加酶标二抗，37℃孵育30min。

[0052] 步骤4：甩干，洗板，加入底液A、B各50uL，37℃显色10min。

[0053] 步骤5：每孔加终止液50uL，测定OD450nm值。

[0054] 2.2固相阻断ELISA最适反应条件的确定

[0055] 用已确定的抗原最适工作浓度进行间接ELISA，采用方阵滴定法确定兔抗血清和酶标二抗的最适工作浓度。封闭完成后，加入梯度稀释的兔抗血清(1∶6000、1∶8000、1∶10000、1∶12000、16000、18000、20000、24000)和HRP酶标二抗(1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶
8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000)，37℃孵育完成后显色，读取OD450nm值。选择阳性OD值接近1.0，P/N值最大时的兔抗血清和HRP酶标二抗稀释度作为最适工作浓度。确定兔抗血清最佳工作浓度为16000倍稀释，HRP酶标二抗为8000倍稀释。

[0056] 2.3固相阻断ELISA判定标准的确定

[0057] 取100份经O型FMDV液相阻断ELISA抗体检测试剂盒鉴定阳性的血清样品，按1∶32稀释后进行间接阻断ELISA检测，读取OD450值。规定以100份血清的平均OD450值加上3倍标准误差(SD)作为阴阳性的临界值，计算抑制率。结果显示，抑制率大于20％为阳性，抑制率小于20％为阴性。阳性血清对照抑制率应在30％±1，阴性血清对照抑制率不得高于7％，否则试验结果不成立。

[0058] 抑制率计算公式：

[0059]

[0060] 2.4固相阻断ELISA敏感性试验

[0061] (1)对猪O型FMDV抗体阳性对照血清的灵敏度试验

[0062] 将猪O型FMDV阳性对照血清进行2倍梯度稀释，用本发明制备的固相阻断试剂盒进行测定，确定该试剂盒对阳性对照血清的灵敏度，结果见表1。试剂盒检测梯度稀释的阳性血清，检测效价达到1∶128倍(抑制率大于20％)。

[0063] 表1 对梯度稀释的阳性对照血清的灵敏度试验

[0064]稀释倍数 抑制率(％) 结果判定
1∶8 79.93 +
1∶16 78.02 +
1∶32 75.6 +
1∶64 69.03 +
1∶128 38.5 +
1∶256 14.25 -
1∶512 12.53 -
阳性对照 29.75 /
阴性对照 6.19 /

[0065] (2)对已知阳性血清样品的敏感性试验

[0066] 使用O型FMDV液相阻断ELISA试剂盒鉴定获得120份阳性样品。使用本发明的固相阻断ELISA试剂盒对样品进行检测。本发明的ELISA试剂盒检出阳性样品116份，有4份未检出。结果表明本试剂盒对120份阳性样品的敏感性为96.7％。

[0067] 2.5固相阻断ELISA特异性试验

[0068] (1)对猪O型FMDV抗体阴性质控血清的特异性试验

[0069] 用本发明的固相阻断ELISA试剂盒检测7份O型FMDV抗体阴性质控血清，结果见表2，本发明的阻断ELISA试剂盒与这些病毒抗体无交叉反应，特别是与A型FMDV以及亚洲I型FMDV抗体也没有交叉反应。其中N1为A型FMDV抗体阳性血清，N2为亚洲I型FMDV抗体阳性血清，N3为猪瘟病毒抗体阳性血清，N4为猪蓝耳病病毒抗体阳性血清，N5为猪细小病毒抗体阳性血清，N6为猪伪狂犬病病毒抗体阳性血清，N7为猪流感病毒抗体阳性血清。

[0070] 表2 对已知阳性血清样品的灵敏度试验

[0071]血清编号 抑制率(％) 结果判定
N1 8.71 -
N2 8.48 -
N3 9.35 -
N4 4.92 -
N5 7.52 -
N6 6.71 -
N7 8.64 -
阳性对照 30.38 /
阴性对照 6.1 /

[0072] (2)对已知阴性血清样品的特异性试验

[0073] 使用O型FMDV液相阻断ELISA试剂盒鉴定获得120份阴性样品。使用本发明的液相阻断ELISA试剂盒对样品进行检测。本发明的ELISA试剂盒检出阴性样品115份，有5份未检出。结果表明本试剂盒对120份阴性样品的特异性为95.8％。

[0074] 2.6固相阻断ELISA重复性试验

[0075] 使用3个不同批次的酶标板，在一块板上进行批内重复实验，在不同板上进行批间重复试验，测定OD450值，计算变异系数。变异系数＜10％，说明试剂盒重复性和稳定性好。3个不同批次的酶标板，批内和批间检测结果一致，变异系数均＜6％，说明试剂盒重复性很好。

[0076] 变异系数(C·V)计算公式：

[0077]

[0078] 三、固相阻断ELISA试剂盒的组装

[0079] 将各试剂组装成试剂盒，按表3取各组份分别进行密封，粘贴内包装标签，组装试剂盒。

[0080] 表3 试剂盒组份

[0081]

[0082] 将组装好的试剂盒置于4℃保存，间隔2个月测定其敏感性和特异性，以确定试剂盒的保存期。本发明的试剂盒4℃避光保存，保存期为6个月。