一种基于双色时间分辨荧光标记‑磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法

摘要

一种基于双色时间分辨荧光标记‑磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，用于牛奶及乳制品中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测。通过将该两种菌适配体分别与NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu时间荧光分辨纳米材料偶联形成信号探针，同时该两种适配体与Fe3O4磁性纳米材料偶联形成捕获探针，当存在目标物质时，由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形成“三明治”夹心复合物。通过监控544nm和615nm处荧光信号强度，能够定量检测鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，两者的线性范围分别为102‑105cfu ml‑1和102‑105cfu ml‑1最低检测限分别为15cfu ml‑1和20cfu ml‑1。本发明用于同时检测两种致病菌具有灵敏度高、快速简便的优点。并应用于牛奶及乳制品的检测，结果准确可靠。

权利要求

1.一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，其特征在于：将两种致病菌即鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌适配体分别与NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu时间荧光分辨纳米材料偶联形成信号探针，同时鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌适配体与Fe3O4磁性纳米材料偶联形成捕获探针，当存在鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌时，由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形成磁性材料-适配体-菌体-适配体-时间分辨荧光纳米材料“三明治”夹心复合物。在酶标仪的时间分辨荧光模式下，以

273nm进行激发，记录544nm和615nm处荧光信号强度，实现对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测，建立标准曲线，达到对含鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌样品进行定量检测。

2.如权利要求1中所述的一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，其特征在于：合成NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu发光纳米材料和Fe3O4磁性纳米材料应用于两种致病菌即鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检测。

3.如权利要求1中所述的一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，其特征在于：所述方法能够用于牛奶等食品样品中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测。

说明书

一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检

测两种致病菌的方法

技术领域

[0001] 一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，涉及纳米材料和分析化学技术领域，用于对食品中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行同时检测。

背景技术

[0002] 食源性疾病通常指随着食物摄入人体的生物性、物理性、化学性有毒有害物导致人体感染或中毒的疾病。食源性致病菌就是能引起食物中毒或感染的致病性细菌。鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是最常见的引起食源性疾病的致病菌。鼠伤寒沙门氏菌是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，周身鞭毛，无荚膜，最适生长温度是34℃～37℃，最适pH为7.0～7.8。沙门氏菌生长能力很强，且对环境的抵抗力强，甚至可以在低温、缺氧和干旱条件下存活4个月。它是一种人畜共患致病菌，可污染食品并大量繁殖，其致病机制是随食物经口进入人体后会随淋巴系统进入血液，造成人体感染，不仅如此，鼠伤寒沙门氏菌入侵肠道后菌体裂解后会产生大量内毒素，内毒素作用于肠粘膜引发宿主全身性炎症，出现中毒症状。由鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒具有发病率高，发病时间短等特点。金黄色葡萄球菌是一种需氧或兼性厌氧革兰氏阳性菌，最适生长温度是30℃～37℃，最适pH为7.0～7.5,是葡萄球菌属中最重要的致病菌之一。由于金黄色葡萄球菌可在有氧或无氧的环境中生长，高度耐盐、并且对温度(6.5℃～46℃)和pH(4.2～9.3)要求很低，因此能广泛的存在于食品当中。金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜致病菌，可引起许多严重的感染，其致病机制是侵袭人体后引起化脓性感染，通过分泌肠毒素等外毒素和酶类造成急性肠炎，引起呕吐、腹泻等；或者菌体直接侵入人体，引起化脓性感染、肺炎、肠炎等。根据相关数据统计，金黄色葡萄球菌在全球范围内为仅次于大肠杆菌第二常见的与食品中毒相关的病原体。

[0003] 目前，食源性致病菌的测定方法主要有平板计数法，聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增方法(LAMP)、免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光技术(IFT)、胶体金免疫层析技术(GICA)、免疫磁珠分离技术(IMB)等。其中ELISA已被高度商业化，成为目前食品安全、环境监测、医疗诊断中常用的检测方法，它结合了酶催化作用的高效性和抗原抗体反应的特异性，达到快速灵敏检测的目的，但ELISA方法检测致病菌仍然需要足够数量的细菌进行反应，因此在检测前需要进行预增菌培养阶段，此工序费力且耗时较长，限制了其进一步应用。ELISA与GICA都是基于抗原抗体亲和反应，一抗体作为识别分子易受外界条件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经过动物或细胞实验，繁琐费时，成本较高，因此检测成本也偏高。所以开发一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的新型检测方法很有必要。

[0004] 核酸适配体(Aptamer)通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指数富集配体系统进化)技术筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简便、 快速、适用范围广等特点。核酸适配体能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相较，核算适配体有诸多优点，比如体外合成周期短，制备成本低，无需动物实验；稳定性好，对温度不敏感；易于修饰等等，而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食品安全中得到广泛应用。

[0005] 时间分辨荧光是一种特殊的荧光现象，是利用物质的荧光寿命长短进行时间分辨，即采用适当的激发光源和检测体系，可以得到在固定波长的荧光强度-时间曲线和在固定时间的荧光发射光谱，用于对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分实现分辨并可分别进行测定；通过设置合理的延迟时间(Delay time)和门控时间(Gate time，也称检测时间)消除了检测环境中杂质自发荧光和背景荧光对信噪比的干扰，从而提高分析方法灵敏度。时间分辨荧光分析技术发展的关键在于镧系元素荧光探针和分析模式的有效开发和结合利用。随着纳米技术的蓬勃发展，具有良好水分散性的镧系纳米材料作为一类新型发光标记物，其固有的时间分辨光学特性逐渐被开发并利用起来。镧系掺杂纳米材料本身具有诸多优越的理化特性，比如水分散性好、荧光寿命长、耐光漂白，斯托克斯位移宽(～300nm)，生物兼容性好，细胞毒性低，多色可调控(掺杂元素种类和比例)，有利于生物体系中多组分同时检测。鉴于上述优点，新型镧系掺杂的荧光纳米材料具备了良好的时间分辨荧光分析应用前景。磁性纳米材料的物理长度恰好处于纳米量级且具有制备方法简单、原料低廉、独特的超顺磁性、表面易于修饰、生物相容性好等特点，使得其在生物医学领域具有广阔的应用前景。

[0006] 本发明构建了一种新颖的、灵敏的时间分辨荧光生物分析法同时检测鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。首先合成了两种不同基质和掺杂不同镧系元素的具有时间分辨荧光功能的纳米材料，该纳米材料可同时采用273nm的紫外光进行激发，并设定一定的门控时间和延迟时间可分别在544nm和615nm处有非常强且窄的发射峰。对纳米材料表面进行亲和素修饰，再将5’端生物素化的目标寡核酸适配体链与亲和素化的纳米材料通过亲和素和生物素的作用形成时间分辨荧光探针。采用类似的方法用目标适配体修饰磁性材料作为捕获探针。由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形成磁性材料-适配体-菌体-适配体-时间分辨荧光纳米材料“三明治”夹心复合物。在酶标仪的时间分辨荧光模式下，以273nm进行激发，记录544nm和615nm处荧光信号强度，通过对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测，建立标准曲线，达到对含鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌样品进行定量检测的目的。该发明可以用于禽畜肉类、饮品类、牛奶及乳制品等样品中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌含量的检测。

发明内容

[0007] 一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法:分别制备得到NaYF4:Ce/Tb，NaGdF4:Eu时间分辨荧光纳米材料和Fe3O4磁性纳米材料，对时间荧光分辨纳米材料和磁性纳米材料进行表面功能化修饰并与亲和素(Avidin)偶联，随后通过亲和素(Avidin)与生物素(Biotin)之间的作用与生物素(Biotin)修饰的适配体DNA特异性结合分别构成荧光探针和捕获探针。适配体固定到磁性纳米材料表面，用于捕获和富集鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu分别标记鼠伤寒沙门氏菌和金黄色 葡萄球菌，加入目标菌进行孵育，由于是适配体对目标菌体的特异性识别，最终形成磁性材料-适配体-菌体-适配体-时间分辨荧光纳米材料复合物。采用酶标仪在时间分辨荧光的模式下，用273nm的激发光，并设定延迟时间为100μs，检测时间为1000μs，可分别在544nm和615nm得到Tb和Eu的特异性发射峰，并且在一定范围内鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的含量与荧光强度的数值相关，基于此对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌标准品进行检测，建立标准曲线，已达到对实际样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行定量检测的目的。步骤为：

[0008] 1、采用一步溶剂热法合成NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu,并对其做表面修饰[0009] 制备NaYF4:Ce/Tb：称取1mmol的磷酸乙醇胺(AEP)和1mmol的NaCl溶于30ml乙二醇中并不断搅拌，随后加入0.9mmol Y(NO3)3·6H2O、0.05mmol Ce(NO3)3·6H2O、0.05mmol Tb(NO3)3·6H2O。然后，将含有4mmol NH4F的10ml乙二醇溶液(45℃水浴搅拌充分溶解)逐滴加入上述透明溶液中，于室温下继续搅拌30min后转移至50ml铁氟龙高压反应釜内，195℃反应4h。反应后，取出冷却至室温，以乙醇、超纯水交替洗涤三次，溶于超纯水中于4℃冰箱保存备用。制备NaGdF4:Eu：将2.0mmol NaCl、1.0mmol GdCl3·XH2O和0.1mmol EuCl3·6H2O溶于以及1ml聚乙烯亚胺(PEI)水溶液加入20ml乙二醇中室温下搅拌。然后，将含有6mmol NH4F的10ml乙二醇溶液(45℃水浴搅拌充分溶解)逐滴加入上述透明溶液中，于室温下继续搅拌30min后转移至50ml铁氟龙高压反应釜内，195℃反应4h。反应后，取出冷却至室温，以乙醇、超纯水交替洗涤三次，溶于超纯水中于4℃冰箱保存备用。

[0010] 2、制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒

[0011] 称取2.0g无水醋酸钠和1.0g六水合三氯化铁加入30ml乙二醇，将6.5g温浴的1,6-己二胺加入前者的混合液中，加热至50℃，并不断搅拌形成酒红色透亮的均质胶体溶液。将该溶液转移至100ml反应釜中，198℃高温反应6h。反应完成后取出反应釜自然冷却至室温全部倒入烧杯(分批冲洗转移残留粉末)，然后利用磁铁分离收集，弃去上层混合液体，将磁分离获得的黑色粉末用超纯水，超声分散，然后磁分离弃去溶液，收集粉末。采用超纯水和无水乙醇轮流洗涤三次，所得黑色粉末在50℃下干燥12h，取出研钵研磨至细粉末，储存备用。

[0012] 3、利用戊二醛方法将时间分辨荧光纳米材料和磁性纳米材料与亲和素(Avidin)进行偶联

[0013] 由于时间分辨荧光纳米材料和磁性纳米材料表面含有氨基基团，因此可以通过戊二醛法将亲和素共价结合到材料表面。将两种时间荧光分辨纳米材料和磁性纳米材料用10mM磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，制成1mg/ml溶液，超声15min使其充分分散于缓冲液中。将材料与5％的戊二醛在室温下避光轻微震荡活化2h，时间分辨荧光纳米材料用离心的方法去除未反应的戊二醛，磁性材料通过外加磁场去除未反应的戊二醛，接着用PBS清洗三次，然后加入亲和素(1mg/ml)37℃震荡过夜。反应结束后清洗数次，弃上清。

[0014] 4、亲和素修饰的时间分辨荧光纳米材料和磁性纳米材料与适配体进行偶联[0015] 利用通过亲和素(Avidin)与生物素(Biotin)之间的特异性结合将表面修饰亲和素(Avidin)的时间分辨荧光纳米材料和磁性纳米材料与生物素(Biotin)修饰的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌适配体DNA单链连接。具体方法为：将亲和素修饰的时间分辨荧光纳米材料和磁性纳米材料分散于10mM磷酸盐缓冲液中，分别加入一定量的生物素化的鼠伤寒沙门氏菌和 金黄色葡萄球菌适配体，在37℃摇床中孵育12h，离心收集材料，用磷酸盐缓冲液清洗三次，分散于磷酸盐缓冲液中。

[0016] 5、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌标准品进行检测

[0017] 用10mM磷酸盐缓冲液将鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌梯度稀释到不同浓度，样品与125μL鼠伤寒沙门氏菌适配体修饰NaYF4：Ce/Tb荧光探针，150μL金黄色葡萄球菌适配体修饰NaGdF4：Eu荧光探针，80μL鼠伤寒沙门氏菌适配体修饰磁珠捕获探针，100μL金黄色葡萄球菌适配体修饰磁珠捕获探针混合，于37℃条件下孵育40min，然后通过外加磁场将未结合的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分离去除，并用洗涤缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液加0.05％(v/v)吐温20)清洗两遍，最后将富集到的混合物重悬到200μL的磷酸盐缓冲液中进行上机检测。采酶标仪(M5)在时间分辨荧光模式下，设定激发波长为273nm，延迟时间为100μs，检测时间为1000μs，在544nm和615nm处有Tb和Eu的发光信号，分别检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。当体系中不存在目标菌种时，捕获探针和荧光探针的适配体没有与目标物质结合，因此此时荧光强度最小(F0)，随着鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌浓度的增加，荧光信号强度逐渐增加。根据荧光强度的增加值(ΔF)与对应的细菌的浓度的对数值建立标准曲线，实验结果在102-105cfu/ml区间内呈良好的线性关系。

[0018] 本发明的优点：

[0019] 1、利用镧系掺杂纳米材料荧光寿命长的特点，通过时间分辨使得检测背景的荧光衰减，从而大大的提高了检测的灵敏度。

[0020] 2、利用适配体对检测物质的特异性结合，有效的提高了检测的准确性和稳定性。

[0021] 3、利用适配体与抗体相比较，具有可人工合成，便于化学修饰，稳定性好，可长期保存。

[0022] 4、利用磁性纳米材料作为捕获探针，将目标检测物进行富集，方便快捷，大大简化检测过程。

附图说明

[0023] 图1是基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的原理图

[0024] 图2是时间分辨荧光纳米材料NaYF4:Ce/Tb电镜图(a)；NaGdF4:Eu电镜图(b)[0025] 图3是Fe3O4磁性纳米材料电镜图

[0026] 图4是时间分辨荧光纳米材料NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu混合后荧光光谱图[0027] 图5是时间分辨荧光强度随沙门氏菌和金黄色葡萄球菌浓度变化叠加图(a)；沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测标准曲线图(b)。具体实施方式：

[0028] 本发明包括但不限于以下实施例，凡在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或者拒不改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

[0029] 实施例1：牛奶样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测及加标后与平板计数法比较：

[0030] 样品预处理：取从本地超市购买牛奶10ml，12000r/min离心15min，然后用0.22μm滤膜以除去牛奶中的蛋白质和脂肪，然后用Tris-HCl溶液将牛奶样品的pH值调为7.7，将处理过的牛奶样品分成9份，每份样品的体积为900μL，再将100μL不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的培养物加到上述牛奶样品中，使样品的总体积达到1mL。分别取100 μL含有不同浓度的金黄色葡萄球菌的样品进行平板计数，另取100μL含有不同浓度的菌液的样品，采用本实验的方法进行检测，将得到的检测结果与平板计数法所得到的结果进行比较。结果见表一。两种方法检测结果一致，无明显差异。

[0031] 表一：牛奶实际样品检测，平板涂布方法与本方法比较

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