治疗或预防骨关节炎的组合物和方法转让专利
申请号 : CN201380035291.1
文献号 : CN105682682B
文献日 : 2019-09-27
发明人 : 曹旭
申请人 : 约翰霍普金斯大学
摘要 :
本发明涉及骨关节炎的领域。更具体地，本发明提供可用于治疗或预防骨关节炎的组合物和方法。在一个实施方案中，治疗或预防患者中骨关节炎的方法包括向患者施用治疗有效量的转化生长因子β(TGF‑β)抑制剂的步骤。
权利要求 :
1.转化生长因子β1(TGF-β1)抑制剂在制备用于治疗或预防患者中软骨下骨髓骨损伤的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂是蛋白、肽或核酸。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂是抗体。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂抑制活性TGF-β1、TGF-β1受体、负责活化前体TGF-β1为成熟TGF-β1的蛋白酶、TGF-β1的表达、或前述的组合。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述药物被施用到软骨下骨区域。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂是小分子。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述小分子是卤夫酮、kartogenin或SB-505124。
8.如权利要求6或7所述的用途，其中所述TGF-β1抑制剂与二膦酸盐/酯或其衍生物共轭。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述二膦酸盐/酯是阿伦膦酸盐/酯。
10.TGF-β1抑制剂在制备用于治疗或预防患者中软骨下骨髓骨损伤的药物中的用途，所述药物当被施用到患者时，被施用到软骨下骨区域。
11.TGF-β1封闭抗体在制备用于治疗或预防患者中软骨下骨髓骨损伤的药物中的用途，所述药物当被施用到患者时，被施用到软骨下骨区域。
12.与二膦酸盐/酯共轭的小分子TGF-β1抑制剂在制备用于治疗或预防患者中软骨下骨髓骨损伤的药物中的用途。
说明书 :
治疗或预防骨关节炎的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年5月1日提交的美国临时申请号61/640,886和2012年9月6日提交的美国临时申请号61/697,483的权益，二者通过引用全文并入本文。
[0003] 政府权益的声明
[0004] 本发明在美国政府以基金号AR053973和基金号DK057501的支持下做出。美国政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
发明领域
[0005] 本发明涉及骨关节炎的领域。更具体地，本发明提供可用于治疗或预防骨关节炎的组合物和方法。
[0006] 发明背景
[0007] 骨关节炎是最常见的退化性关节紊乱，主要影响承重的关节如髋部和膝盖，并是身体残疾的主要原因，预测到2030年影响美国的6700万人。尽管鉴定了风险因素例如机械、
代谢或遗传，骨关节炎的确切发病机理仍是不清楚的。目前，没有对于骨关节炎的有效疾病
缓和治疗，直到必须进行关节置换的疾病末期。
代谢或遗传，骨关节炎的确切发病机理仍是不清楚的。目前，没有对于骨关节炎的有效疾病
缓和治疗，直到必须进行关节置换的疾病末期。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明至少部分地基于以下发现：转化生长因子β(TGF-beta或TGFβ)的抑制可用作骨关节炎的疗法。此外，本发明人发现，骨髓类骨质岛(osteoid islet)/损伤可用作监测
骨关节炎疗法的进展的生物标志或读出物(readout)。
骨关节炎疗法的进展的生物标志或读出物(readout)。
[0010] 在一个方面，本发明提供可用于治疗或预防骨关节炎的方法和组合物。在一个实施方案中，治疗或预防患者中骨关节炎的方法包括向患者施用治疗有效量的转化生长因子
β(TGF-β)抑制剂的步骤。在具体实施方案中，TGFβ是TGF-β超家族的成员。在更具体的实施方案中，TGF-β是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。在具体实施方案中，TGF-β是TGF-β1。在其他实施方案中，抑制剂是小分子、抗体、蛋白、肽或核酸。在具体实施方案中，抑制剂是抗体。在其他实施方案中，抑制剂抑制活性TGF-β、TGF-β受体、负责活化前体TGF-β为成熟TGF-β的蛋白酶、TGF-β的表达、或前述的组合。
β(TGF-β)抑制剂的步骤。在具体实施方案中，TGFβ是TGF-β超家族的成员。在更具体的实施方案中，TGF-β是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。在具体实施方案中，TGF-β是TGF-β1。在其他实施方案中，抑制剂是小分子、抗体、蛋白、肽或核酸。在具体实施方案中，抑制剂是抗体。在其他实施方案中，抑制剂抑制活性TGF-β、TGF-β受体、负责活化前体TGF-β为成熟TGF-β的蛋白酶、TGF-β的表达、或前述的组合。
[0011] 在特定实施方案中，抑制剂被施用到软骨下骨区域(subchondral bone area)。在更具体的实施方案中，治疗或预防患者中骨关节炎骨关节炎的方法包括向患者施用治疗有
效量的TGF-β抑制剂到软骨下骨区域的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防患者中骨关节
炎骨关节炎的方法包括向患者施用治疗有效量的TGF-β1封闭抗体到软骨下骨区域的步骤。
效量的TGF-β抑制剂到软骨下骨区域的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防患者中骨关节
炎骨关节炎的方法包括向患者施用治疗有效量的TGF-β1封闭抗体到软骨下骨区域的步骤。
[0012] 本发明还提供阻止患者中韧带损伤引起的骨关节炎发作的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的TGF-β抑制剂到被受损的韧带影响的关节的软骨下骨的步骤。在另一
个实施方案中，阻止患者中韧带损伤引起的骨关节炎发作的方法包括向患者施用治疗有效
量的TGF-β抑制剂到被受损的韧带影响的关节的软骨下骨的步骤。
个实施方案中，阻止患者中韧带损伤引起的骨关节炎发作的方法包括向患者施用治疗有效
量的TGF-β抑制剂到被受损的韧带影响的关节的软骨下骨的步骤。
[0013] 本发明还提供减少关节中关节软骨退化的方法，该方法包括在关节部位或在关节部位附近局部施用有效量的TGF-β抑制剂的步骤。在一个实施方案中，抑制剂被施用到所述
关节的软骨下骨区域。在另一实施方案中，抑制剂是小分子。在某些实施方案中，小分子是
卤夫酮、kartogenin或SB-505124。在某些实施方案中，TGF-β抑制剂与二膦酸盐/酯
(bisphosphonate)或其衍生物共轭。在具体实施方案中，二膦酸盐/酯是阿伦膦酸盐/酯
(alendronate)。本发明还提供治疗或预防患者中骨关节炎的方法，该方法包括施用有效量
的与二膦酸盐/酯共轭的小分子TGF-β1抑制剂的步骤。
关节的软骨下骨区域。在另一实施方案中，抑制剂是小分子。在某些实施方案中，小分子是
卤夫酮、kartogenin或SB-505124。在某些实施方案中，TGF-β抑制剂与二膦酸盐/酯
(bisphosphonate)或其衍生物共轭。在具体实施方案中，二膦酸盐/酯是阿伦膦酸盐/酯
(alendronate)。本发明还提供治疗或预防患者中骨关节炎的方法，该方法包括施用有效量
的与二膦酸盐/酯共轭的小分子TGF-β1抑制剂的步骤。
[0014] 在另一方面，本发明提供诊断骨关节炎和监测其治疗的方法。一般，骨髓类骨质岛/损伤的形成、存在、不存在、增加或减少可用于诊断骨关节炎或监测骨关节炎的治疗。在一个实施方案中，诊断患者中骨关节炎的方法包括鉴定患者软骨下骨髓中类骨质岛的存在
或不存在的步骤，其中类骨质岛的存在或不存在提供诊断。在具体实施方案中，类骨质岛利
用磁共振成像(MRI)鉴定。在一个实施方案中，诊断患者中骨关节炎的方法包括利用磁共振
成像(MRI)鉴定患者软骨下骨髓中类骨质岛的存在或不存在的步骤，其中类骨质岛的存在
或不存在提供诊断。在另一实施方案中，监测患者中骨关节炎疗法的方法包括在至少两个
时间点比较患者软骨下骨髓中类骨质岛形成程度的步骤，其中类骨质岛利用MRI检测。时间
点可包括但不限于，在骨关节炎治疗之前、期间和之后。在另一个实施方案中，本发明提供
治疗患者中骨关节炎的方法，该方法包括以下步骤：(a)利用MRI检测患者软骨下骨髓中类
骨质岛的存在；和(b)向患者施用TGF-β抑制剂。
或不存在的步骤，其中类骨质岛的存在或不存在提供诊断。在具体实施方案中，类骨质岛利
用磁共振成像(MRI)鉴定。在一个实施方案中，诊断患者中骨关节炎的方法包括利用磁共振
成像(MRI)鉴定患者软骨下骨髓中类骨质岛的存在或不存在的步骤，其中类骨质岛的存在
或不存在提供诊断。在另一实施方案中，监测患者中骨关节炎疗法的方法包括在至少两个
时间点比较患者软骨下骨髓中类骨质岛形成程度的步骤，其中类骨质岛利用MRI检测。时间
点可包括但不限于，在骨关节炎治疗之前、期间和之后。在另一个实施方案中，本发明提供
治疗患者中骨关节炎的方法，该方法包括以下步骤：(a)利用MRI检测患者软骨下骨髓中类
骨质岛的存在；和(b)向患者施用TGF-β抑制剂。
[0015] 附图简述
[0016] 图1.软骨下骨中上调的TGF-β信号传导与ACLT小鼠中软骨下骨结构的改变相关。(a(上图))假手术或ACLT手术后0、30或60天时胫骨软骨下骨中间室的三维高-分辨率μCT图
像(矢状视图)。软骨下骨板改变的形态学由红色箭头指示。比例尺，500μm。(a(中图))胫骨中间室的矢状切片的番红O-固绿染色，蛋白聚糖(红色)和骨(绿色)。箭头指示在手术后30
和60天蛋白聚糖的损失。比例尺，500μm。(a(下图)软骨下骨板(SBP)和软骨的H&E染色。透明软骨(HC)和钙化软骨(CC)厚度由双箭头线指示。比例尺，100μm。(b-d)通过μCT分析对软骨下骨结构参数的定量分析：总组织容量(TV)、软骨下骨板厚度(SBP Th)和骨小梁模式因子
(Tb.Pf)。n＝8；*在相应时间点P<0.05vs.假手术组；#在手术后30天P<0.05vs.ACLT组。(e)
在手术后0-90天的OARSI评分。n＝8；*P<0.05和**P<0.01vs.第0天组。(f)ACLT手术后小鼠
胫骨软骨下骨中的TRAP染色(粉红，上图)，比例尺，200μm和pSmad2/3+细胞的免疫组织化学分析(棕色，下图)，比例尺，100μm。每骨髓面积(mm2)TRAP+或p-Smad2/3+细胞的定量分析，报告为平均值±SD。n＝8；*P<0.05vs.第0天组。
像(矢状视图)。软骨下骨板改变的形态学由红色箭头指示。比例尺，500μm。(a(中图))胫骨中间室的矢状切片的番红O-固绿染色，蛋白聚糖(红色)和骨(绿色)。箭头指示在手术后30
和60天蛋白聚糖的损失。比例尺，500μm。(a(下图)软骨下骨板(SBP)和软骨的H&E染色。透明软骨(HC)和钙化软骨(CC)厚度由双箭头线指示。比例尺，100μm。(b-d)通过μCT分析对软骨下骨结构参数的定量分析：总组织容量(TV)、软骨下骨板厚度(SBP Th)和骨小梁模式因子
(Tb.Pf)。n＝8；*在相应时间点P<0.05vs.假手术组；#在手术后30天P<0.05vs.ACLT组。(e)
在手术后0-90天的OARSI评分。n＝8；*P<0.05和**P<0.01vs.第0天组。(f)ACLT手术后小鼠
胫骨软骨下骨中的TRAP染色(粉红，上图)，比例尺，200μm和pSmad2/3+细胞的免疫组织化学分析(棕色，下图)，比例尺，100μm。每骨髓面积(mm2)TRAP+或p-Smad2/3+细胞的定量分析，报告为平均值±SD。n＝8；*P<0.05vs.第0天组。
[0017] 图2.具有TGF-β1转基因活化突变的CED小鼠证明膝OA表型。(a)4月龄CED小鼠vs.野生型(WT)同窝的胫骨软骨下骨的横截、冠状和矢状视图的μCT图像。比例尺，1mm，对软骨下骨结构参数的定量分析：总组织容量(TV)、软骨下骨板厚度(SBP Th)和骨小梁模式因子
(Tb.Pf)。(b)胫骨中间室矢状切片的番红O-固绿，比例尺，500μm(上图)和H&E染色，比例尺，
100μm(下图)。双箭头线指示透明软骨(HC)和钙化软骨(CC)厚度。软骨下骨板＝SBP。(c)CED vs.WT同窝的OARSI评分。(d)CED vs.WT同窝的胫骨软骨下骨的基于CT的微血管造影术，血
管容量相对于组织容量(VV/TV)和血管数目(VN)的定量。比例尺，500μm。(e,f)免疫组织化
+ +
学或免疫荧光分析：CD31 (棕色)，比例尺，50μm(e)；巢蛋白 (红色,上图)，比例尺，50μm；
osterix+(棕色,下图)细胞，比例尺,100μm。CED vs.WT同窝的胫骨软骨下骨中的DAPI染色
细胞核(蓝色)(f(上图))。(a-f)n＝10；*P<0.05,**P<0.01。(g)人类胫骨软骨下骨样本的条
件培养基中活性TGF-β1的ELISA分析。健康：从健康供体收集的软骨下骨，Oac+：带有关节软骨的OA软骨下骨，Oac-：无关节软骨的OA软骨下骨。n＝10；*P<0.05；**P<0.01。数据报告为平均值±SD。
(Tb.Pf)。(b)胫骨中间室矢状切片的番红O-固绿，比例尺，500μm(上图)和H&E染色，比例尺，
100μm(下图)。双箭头线指示透明软骨(HC)和钙化软骨(CC)厚度。软骨下骨板＝SBP。(c)CED vs.WT同窝的OARSI评分。(d)CED vs.WT同窝的胫骨软骨下骨的基于CT的微血管造影术，血
管容量相对于组织容量(VV/TV)和血管数目(VN)的定量。比例尺，500μm。(e,f)免疫组织化
+ +
学或免疫荧光分析：CD31 (棕色)，比例尺，50μm(e)；巢蛋白 (红色,上图)，比例尺，50μm；
osterix+(棕色,下图)细胞，比例尺,100μm。CED vs.WT同窝的胫骨软骨下骨中的DAPI染色
细胞核(蓝色)(f(上图))。(a-f)n＝10；*P<0.05,**P<0.01。(g)人类胫骨软骨下骨样本的条
件培养基中活性TGF-β1的ELISA分析。健康：从健康供体收集的软骨下骨，Oac+：带有关节软骨的OA软骨下骨，Oac-：无关节软骨的OA软骨下骨。n＝10；*P<0.05；**P<0.01。数据报告为平均值±SD。
[0018] 图3.在ACLT小鼠中TβRI抑制剂稳定软骨下骨结构和减弱关节软骨退化。(a)每天以1mg kg-1TβRI抑制剂处理，持续30天和在ACLT或假手术后1或2个月处死的小鼠的胫骨软
骨下骨中间室的三维μCT图像(矢状视图)。比例尺，1mm。(b-d)通过μCT分析对软骨下骨结构参数的定量分析：组织容量(TV)、软骨下骨板(SBP)的厚度、和骨小梁模式因子(Tb.Pf)。(e)来自用运载体或抑制剂处理1个月和在ACLT或假手术后2个月处死的小鼠的胫骨中间室的
矢状切片中关节软骨的番红O-固绿染色。比例尺，500μm(上图)或100μm(下图)。(f)用运载体(Ve)或TβRI抑制剂(In)处理的假手术或ACLT小鼠的OARSI评分。(g,h)免疫组织化学染色
的关节软骨组织切片中MMP13+和X型胶原+软骨细胞百分比的定量分析。(i)ACLT或假手术后
2个月、并用运载体或抑制剂处理1个月的小鼠中步态分析的Maxcontactat(％)。n＝8-12；*
P<0.05**P<0.01vs.Ve假手术；#P<0.05,##P<0.01vs.Ve ACLT,NS：不显著。数据报告为平均
值±SD。
骨下骨中间室的三维μCT图像(矢状视图)。比例尺，1mm。(b-d)通过μCT分析对软骨下骨结构参数的定量分析：组织容量(TV)、软骨下骨板(SBP)的厚度、和骨小梁模式因子(Tb.Pf)。(e)来自用运载体或抑制剂处理1个月和在ACLT或假手术后2个月处死的小鼠的胫骨中间室的
矢状切片中关节软骨的番红O-固绿染色。比例尺，500μm(上图)或100μm(下图)。(f)用运载体(Ve)或TβRI抑制剂(In)处理的假手术或ACLT小鼠的OARSI评分。(g,h)免疫组织化学染色
的关节软骨组织切片中MMP13+和X型胶原+软骨细胞百分比的定量分析。(i)ACLT或假手术后
2个月、并用运载体或抑制剂处理1个月的小鼠中步态分析的Maxcontactat(％)。n＝8-12；*
P<0.05**P<0.01vs.Ve假手术；#P<0.05,##P<0.01vs.Ve ACLT,NS：不显著。数据报告为平均
值±SD。
[0019] 图4.TβRI抑制剂减少ACLT小鼠中未偶联的骨形成(uncoupled bone formation)和血管发生。(a)用运载体处理的假手术(假手术)、用运载体处理的ACLT操作的(运载体)、
或用TβRI抑制剂处理的ACLT操作的(抑制剂)后一个月收集的胫骨软骨下骨中，巢蛋白(红
色)和osterix(棕色)的免疫荧光或免疫组织化学分析和定量。DAPI染色细胞核(蓝色)(上
图)。比例尺，50μm。(b)胫骨软骨下骨切片中骨钙素(棕色)的免疫组织化学分析和三色染
色。比例尺，50μm。空心箭头指示骨钙素+细胞且实心箭头指示类骨质。(c)来自小鼠软骨下骨的骨髓中巢蛋白和osterix的流式细胞术分析。(d)钙黄绿素(绿色)和二甲酚橙(橙色)荧
光双重标记。比例尺，100μm。(e)用递增剂量的重组hTGF-β1处理的培养的MSC中pSmad1/5/
8、Smad1/5、pSmad2和Smad2的蛋白质印迹法分析。(f)手术后2周，小鼠软骨下骨中pSmad2/
3、pSmad1、ALK5和ALK1(都染色为棕色)的免疫组织化学分析和定量。比例尺，50μm。(g)软骨下骨中CD31(棕色)的免疫组织化学分析和定量。比例尺，50μm。(h)胫骨软骨下骨的基于CT
的微血管造影术和软骨下骨血管容量(VV)和血管数目(VN)的定量，比例尺，500μm。(i)经由带有对比度的T2加权MRI扫描(T2weighted MRI scanning with contrast)获得的灌注率。
(j)代表性MRI T1加权图像。红色箭头指示骨髓损伤。n＝8-12；*P<0.05vs.假手术；#P<
0.05vs.运载体。
或用TβRI抑制剂处理的ACLT操作的(抑制剂)后一个月收集的胫骨软骨下骨中，巢蛋白(红
色)和osterix(棕色)的免疫荧光或免疫组织化学分析和定量。DAPI染色细胞核(蓝色)(上
图)。比例尺，50μm。(b)胫骨软骨下骨切片中骨钙素(棕色)的免疫组织化学分析和三色染
色。比例尺，50μm。空心箭头指示骨钙素+细胞且实心箭头指示类骨质。(c)来自小鼠软骨下骨的骨髓中巢蛋白和osterix的流式细胞术分析。(d)钙黄绿素(绿色)和二甲酚橙(橙色)荧
光双重标记。比例尺，100μm。(e)用递增剂量的重组hTGF-β1处理的培养的MSC中pSmad1/5/
8、Smad1/5、pSmad2和Smad2的蛋白质印迹法分析。(f)手术后2周，小鼠软骨下骨中pSmad2/
3、pSmad1、ALK5和ALK1(都染色为棕色)的免疫组织化学分析和定量。比例尺，50μm。(g)软骨下骨中CD31(棕色)的免疫组织化学分析和定量。比例尺，50μm。(h)胫骨软骨下骨的基于CT
的微血管造影术和软骨下骨血管容量(VV)和血管数目(VN)的定量，比例尺，500μm。(i)经由带有对比度的T2加权MRI扫描(T2weighted MRI scanning with contrast)获得的灌注率。
(j)代表性MRI T1加权图像。红色箭头指示骨髓损伤。n＝8-12；*P<0.05vs.假手术；#P<
0.05vs.运载体。
[0020] 图5.ACLT大鼠中局部软骨下施用TGF-β抗体减少异常软骨下骨形成和关节软骨退化。(a)经历假手术(假手术)或ACLT手术、手术后3个月植入包含运载体(运载体)或TGF-β抗
体(抗体)的藻酸盐/酯(alginate)珠的大鼠中胫骨软骨下骨中间室的三维μCT图像(矢状视
图)。比例尺，1mm。(b-d)通过μCT分析对软骨下骨结构参数的定量分析：软骨下骨板(SBP)的厚度、骨小梁模式因子(Tb.Pf)和连接性密度(connectivity density)(Conn.Dn)。(e)
osterix(棕色)的免疫组织化学和定量分析。比例尺，100μm。(f)软骨下胫骨中间室的矢状
切片的番红O-固绿染色，比例尺，400μm。(g)OARSI评分。(h)关节软骨中X型胶原(绿色)和
MMP13(棕色)的免疫荧光或免疫组织化学和定量分析。DAPI染色细胞核(蓝色)(中图)。比例
尺，200μm。n＝8；*P<0.05,**P<0.01vs.假手术,#P<0.05vs.运载体ACLT大鼠。
体(抗体)的藻酸盐/酯(alginate)珠的大鼠中胫骨软骨下骨中间室的三维μCT图像(矢状视
图)。比例尺，1mm。(b-d)通过μCT分析对软骨下骨结构参数的定量分析：软骨下骨板(SBP)的厚度、骨小梁模式因子(Tb.Pf)和连接性密度(connectivity density)(Conn.Dn)。(e)
osterix(棕色)的免疫组织化学和定量分析。比例尺，100μm。(f)软骨下胫骨中间室的矢状
切片的番红O-固绿染色，比例尺，400μm。(g)OARSI评分。(h)关节软骨中X型胶原(绿色)和
MMP13(棕色)的免疫荧光或免疫组织化学和定量分析。DAPI染色细胞核(蓝色)(中图)。比例
尺，200μm。n＝8；*P<0.05,**P<0.01vs.假手术,#P<0.05vs.运载体ACLT大鼠。
[0021] 图6.巢蛋白+细胞中诱导的TβRII敲除减少ACLT小鼠中软骨下骨和关节软骨的改变。(a)经历假手术或ACLT手术后2个月，野生型(WT)或巢蛋白-CreTMER::TβRIIfl/fl(Tβ
RII-/-)小鼠中胫骨软骨下骨中间室的三维μCT图像(矢状视图)。比例尺，500μm，和由μCT分析对软骨下骨结构参数的定量分析：软骨下骨组织容量(TV)、软骨下骨板(SBP)厚度、和骨
小梁模式因子(Tb.Pf)。(b)osterix(棕色)的免疫组织化学和定量分析。比例尺，100μm。(c)经历假手术或ACLT操作和用运载体或TβRI抑制剂处理的巢蛋白-CreTMER::Rosa26-LacZfl
/fl小鼠的软骨下骨中骨钙素(红色)和β-gal(绿色)的双重免疫荧光分析。比例尺，40μm。(d)胫骨中间室的矢状切片的番红O-固绿和H&E染色。比例尺，100μm。(e)OARSI评分。(f)小鼠步态分析的Max_contact_at(％)。(g)MMP13和X型胶原(都染色为棕色)的免疫组织化学和定
量分析。HC＝透明软骨；CC＝钙化软骨；SCB＝软骨下骨。n＝8；*P<0.05,**P<0.01vs.野生型假手术,#P<0.05,##P<0.01vs.野生型ACLT组。比例尺，100μm。(h)在OA发作时软骨下骨中提高的活性TGF-β1的模型。TGF-β1在软骨下骨中响应于异常机械负荷被活化。活性TGF-β1的积累的高浓度刺激骨髓中MSC和骨原细胞(osteoprogenitor)增加，其导致异常骨形成和血
管发生，用于OA发展。
RII-/-)小鼠中胫骨软骨下骨中间室的三维μCT图像(矢状视图)。比例尺，500μm，和由μCT分析对软骨下骨结构参数的定量分析：软骨下骨组织容量(TV)、软骨下骨板(SBP)厚度、和骨
小梁模式因子(Tb.Pf)。(b)osterix(棕色)的免疫组织化学和定量分析。比例尺，100μm。(c)经历假手术或ACLT操作和用运载体或TβRI抑制剂处理的巢蛋白-CreTMER::Rosa26-LacZfl
/fl小鼠的软骨下骨中骨钙素(红色)和β-gal(绿色)的双重免疫荧光分析。比例尺，40μm。(d)胫骨中间室的矢状切片的番红O-固绿和H&E染色。比例尺，100μm。(e)OARSI评分。(f)小鼠步态分析的Max_contact_at(％)。(g)MMP13和X型胶原(都染色为棕色)的免疫组织化学和定
量分析。HC＝透明软骨；CC＝钙化软骨；SCB＝软骨下骨。n＝8；*P<0.05,**P<0.01vs.野生型假手术,#P<0.05,##P<0.01vs.野生型ACLT组。比例尺，100μm。(h)在OA发作时软骨下骨中提高的活性TGF-β1的模型。TGF-β1在软骨下骨中响应于异常机械负荷被活化。活性TGF-β1的积累的高浓度刺激骨髓中MSC和骨原细胞(osteoprogenitor)增加，其导致异常骨形成和血
管发生，用于OA发展。
[0022] 图7.具有OA的人类膝关节的表征。(a)软骨下骨中间室横截面的代表性3D重建的μCT图像(上图)和H&E染色(下图)。上图中的冠状视图证明OA患者中相比于健康对照增加的
骨体积和破坏的骨结构。与μCT扫描结果一致，透明软骨(HC)在OA软骨下骨上减少。同时，钙化软骨(CC)和软骨下骨(SCB)朝向关节软骨移动，且关节软骨在OA的晚期完全丧失。双潮线
标志(double tide mark)由箭头指示。(b-d)来自μCT分析的软骨下骨结构参数的定量分
析：骨体积/组织容量(BV/TV)(b)、骨矿物质密度(BMD)(c)、和平均软骨下骨板厚度(SBP
Th)(d)。BV/TV在软骨被磨损处增加(Oac-)。BMD没有平行于骨体积比例显著增加，指示，新
形成骨较差地矿化。平均SBP Th在OA样品中相比于健康对照更大，不论关节软骨的存在与
否。(e)SBP Th的分布百分比(SBP Th Distr)。OA样品中SBP增加的厚度不是均匀的。与图
(e)中所示结果一致，SBP一般变得更厚，如由OA样品中分布曲线的右移证明的。(g)胫骨软
骨下骨中pSmad2/3的免疫组织化学分析。与OA软骨下骨中活性TGFβ1增加的水平一致，OA软
骨下骨中pSmad2/3+细胞数目也增加。n＝10；*P<0.05；**P<0.01vs.健康。Oac+：覆盖软骨的OA软骨下骨，Oac-：无软骨的OA软骨下骨。
骨体积和破坏的骨结构。与μCT扫描结果一致，透明软骨(HC)在OA软骨下骨上减少。同时，钙化软骨(CC)和软骨下骨(SCB)朝向关节软骨移动，且关节软骨在OA的晚期完全丧失。双潮线
标志(double tide mark)由箭头指示。(b-d)来自μCT分析的软骨下骨结构参数的定量分
析：骨体积/组织容量(BV/TV)(b)、骨矿物质密度(BMD)(c)、和平均软骨下骨板厚度(SBP
Th)(d)。BV/TV在软骨被磨损处增加(Oac-)。BMD没有平行于骨体积比例显著增加，指示，新
形成骨较差地矿化。平均SBP Th在OA样品中相比于健康对照更大，不论关节软骨的存在与
否。(e)SBP Th的分布百分比(SBP Th Distr)。OA样品中SBP增加的厚度不是均匀的。与图
(e)中所示结果一致，SBP一般变得更厚，如由OA样品中分布曲线的右移证明的。(g)胫骨软
骨下骨中pSmad2/3的免疫组织化学分析。与OA软骨下骨中活性TGFβ1增加的水平一致，OA软
骨下骨中pSmad2/3+细胞数目也增加。n＝10；*P<0.05；**P<0.01vs.健康。Oac+：覆盖软骨的OA软骨下骨，Oac-：无软骨的OA软骨下骨。
[0023] 图8：人类胫骨中由于软骨下骨扩张或软骨下骨材料特性的关节软骨应力分布改变的计算机模拟。(a-b)人类胫骨平台的确立的FE模型用于模拟。胫骨关节软骨中的软骨下
板模量外侧应力分布)p软骨下骨尺寸扩张基于来自大规模临床OA研究的此前公开的数据
模拟1-3，以预测其上的关节软骨应力分布改变。(c-e)与正常情形(c)相比，软骨下骨尺寸
1％(d)或2％(e)的增量增加将导致关节软骨应力的显著增加。(f)在体重的动力学压迫负
荷下4，以正常软骨下刚性模量，人类关节胫骨软骨中的应力分布。点I是内侧髁关节软骨中
的峰应力；点II是外侧髁中的峰应力。(g)根据OA进展时的骨矿物质密度的此前公开的数据
3，估计，软骨下板刚性模量10％或20％的增量将导致内侧和外侧髁二者关节表面上峰应力
的显著增加。
板模量外侧应力分布)p软骨下骨尺寸扩张基于来自大规模临床OA研究的此前公开的数据
模拟1-3，以预测其上的关节软骨应力分布改变。(c-e)与正常情形(c)相比，软骨下骨尺寸
1％(d)或2％(e)的增量增加将导致关节软骨应力的显著增加。(f)在体重的动力学压迫负
荷下4，以正常软骨下刚性模量，人类关节胫骨软骨中的应力分布。点I是内侧髁关节软骨中
的峰应力；点II是外侧髁中的峰应力。(g)根据OA进展时的骨矿物质密度的此前公开的数据
3，估计，软骨下板刚性模量10％或20％的增量将导致内侧和外侧髁二者关节表面上峰应力
的显著增加。
[0024] 图9：ACLT骨关节炎小鼠模型中胫骨软骨下骨的骨髓中osterix-阳性细胞的分布。(a)ACLT手术后第0(左列)、14(中列)和30天(右列)，ACLT OA小鼠模型中胫骨软骨下骨中骨
髓区域中TRAP(红色)y)和osterix(棕色)染色的免疫组织化学分析的代表性图像。(b)胫骨
软骨下骨的骨髓中osterix和TRAP阳性细胞的总体分布组织形态测定分析图集。TRAP阳性
细胞(破骨细胞)代表骨再塑表面并以白色线指示；osterix阳性细胞以绿色点指示。与第0
天相比，破骨细胞在第14天增加和在第30天减少至基线；与之相比，osterix-阳性细胞在第
30天在胫骨软骨下骨髓中增加。n＝8。
髓区域中TRAP(红色)y)和osterix(棕色)染色的免疫组织化学分析的代表性图像。(b)胫骨
软骨下骨的骨髓中osterix和TRAP阳性细胞的总体分布组织形态测定分析图集。TRAP阳性
细胞(破骨细胞)代表骨再塑表面并以白色线指示；osterix阳性细胞以绿色点指示。与第0
天相比，破骨细胞在第14天增加和在第30天减少至基线；与之相比，osterix-阳性细胞在第
30天在胫骨软骨下骨髓中增加。n＝8。
[0025] 图10：I型TGFβ1受体(TβRI)抑制剂对关节软骨和软骨下骨的剂量依赖性作用。(a)来自ACLT手术2个月后以不同剂量的TβRI抑制剂处理的ACLT小鼠的膝关节的胫骨关节软骨
和相邻软骨下骨的番红O染色。(b)来自ACLT的软骨下骨膝关节的3D重建的μCT图像。ACLT手
术后30和60天时软骨下骨的μCT参数的定量分析：骨体积/组织容量(BV/TV)(c)、组织容量
(TV)(d)、和骨小梁模式因子(Tb.Pf)(e)。虚线指示在ACLT后30天时的平均TV。假手术操作
的小鼠保持关节软骨和软骨下骨结构。与之相比，以运载体处理的ACLT小鼠丧失大多数的
关节软骨和具有改变的软骨下骨形态学。1mg/kg的TβRI抑制剂拯救了软骨下骨改变和阻止
关节软骨的退化。较低剂量(0.1和0.5mg/kg)的抑制剂未完全拯救骨结构，也没有阻止关节
软骨退化。较高剂量(2.5和5mg/kg)的抑制剂可拯救骨结构但还导致对关节软骨的有害作
用，可能因为TGFβ1信号传导对于关节软骨的保持是必需的。尽管抑制剂处理不改变BV/TV
(c)，以高剂量抑制剂(1、2.5和5mg/kg)处理抑制TV的增加(d)和减少由ACLT手术引起的
Tb.Pf(e)。n＝10,*P<0.05vs.运载体组。
和相邻软骨下骨的番红O染色。(b)来自ACLT的软骨下骨膝关节的3D重建的μCT图像。ACLT手
术后30和60天时软骨下骨的μCT参数的定量分析：骨体积/组织容量(BV/TV)(c)、组织容量
(TV)(d)、和骨小梁模式因子(Tb.Pf)(e)。虚线指示在ACLT后30天时的平均TV。假手术操作
的小鼠保持关节软骨和软骨下骨结构。与之相比，以运载体处理的ACLT小鼠丧失大多数的
关节软骨和具有改变的软骨下骨形态学。1mg/kg的TβRI抑制剂拯救了软骨下骨改变和阻止
关节软骨的退化。较低剂量(0.1和0.5mg/kg)的抑制剂未完全拯救骨结构，也没有阻止关节
软骨退化。较高剂量(2.5和5mg/kg)的抑制剂可拯救骨结构但还导致对关节软骨的有害作
用，可能因为TGFβ1信号传导对于关节软骨的保持是必需的。尽管抑制剂处理不改变BV/TV
(c)，以高剂量抑制剂(1、2.5和5mg/kg)处理抑制TV的增加(d)和减少由ACLT手术引起的
Tb.Pf(e)。n＝10,*P<0.05vs.运载体组。
[0026] 图11：ACLT小鼠中TβRI抑制剂处理对软骨TGFβ下游信号传导和软骨下骨再塑的作用。(b)免疫染色证明，在ACLT-运载体处理的小鼠中osterix+骨原细胞(棕色)不与TRAP+破
骨细胞(粉红)共定位(上图，在14和30天)。然而，在ACLT-TβRI抑制剂处理的小鼠中观察到
osterix和TRAP的共定位(下图)。n＝8。
骨细胞(粉红)共定位(上图，在14和30天)。然而，在ACLT-TβRI抑制剂处理的小鼠中观察到
osterix和TRAP的共定位(下图)。n＝8。
[0027] 图12：9月龄小鼠中，TβRI抑制剂处理改进软骨下骨结构和减弱关节软骨退化。(a)在假手术或ACLT手术后0、14、30和60天处死并在手术后3天开始每天以运载体或TβRI抑制
剂(SB505124-1mg/kg)处理1个月的小鼠的胫骨关节软骨和软骨下骨的番红O染色。对于在
较早时间点分析的那些小鼠，小鼠被处理直到处死。(b)膝关节的软骨下骨的3DμCT图像。假手术操作的小鼠在实验的整个持续时间保持关节软骨和软骨下骨结构。假手术操作的小鼠
中TβRI抑制剂处理对关节软骨没有显著作用并具有软骨下骨体积比例的仅轻微增加。运载
体处理的ACLT小鼠中关节软骨的退化和破坏的软骨下骨形态学和结构经2个月显著发展。
相比于ACLT-运载体处理的小鼠，TβRI抑制剂处理在类似时间点改进软骨下骨结构和减弱
关节软骨退化。(c)基于组织学分析的OARSI评分。(d-e)通过μCT分析对结构参数的定量分
析：软骨下骨板(SBP,d)的厚度和骨小梁模式因子(Tb.Pf,e)。在手术后1个月，相比于假手
术操作的对照，软骨下骨板的厚度在ACLT-运载体处理的小鼠中减少，但在ACLT-抑制剂处
理的小鼠中保持正常。TβRI抑制剂处理还在ACLT后1和2个月相对于ACLT-运载体处理的小
鼠减少骨小梁模式因子，指示骨微结构和连接性的改进。n＝8,**P<0.01vs.运载体假手
术,#P<0.05vs.运载体ACLT。Ve-假手术：运载体处理、假手术操作的；In-假手术：TβRI抑制剂处理、假手术操作的；Ve-ACLT：运载体处理、ACLT操作的；In-ACLT：TβRI抑制剂处理、ACLT操作的小鼠。
剂(SB505124-1mg/kg)处理1个月的小鼠的胫骨关节软骨和软骨下骨的番红O染色。对于在
较早时间点分析的那些小鼠，小鼠被处理直到处死。(b)膝关节的软骨下骨的3DμCT图像。假手术操作的小鼠在实验的整个持续时间保持关节软骨和软骨下骨结构。假手术操作的小鼠
中TβRI抑制剂处理对关节软骨没有显著作用并具有软骨下骨体积比例的仅轻微增加。运载
体处理的ACLT小鼠中关节软骨的退化和破坏的软骨下骨形态学和结构经2个月显著发展。
相比于ACLT-运载体处理的小鼠，TβRI抑制剂处理在类似时间点改进软骨下骨结构和减弱
关节软骨退化。(c)基于组织学分析的OARSI评分。(d-e)通过μCT分析对结构参数的定量分
析：软骨下骨板(SBP,d)的厚度和骨小梁模式因子(Tb.Pf,e)。在手术后1个月，相比于假手
术操作的对照，软骨下骨板的厚度在ACLT-运载体处理的小鼠中减少，但在ACLT-抑制剂处
理的小鼠中保持正常。TβRI抑制剂处理还在ACLT后1和2个月相对于ACLT-运载体处理的小
鼠减少骨小梁模式因子，指示骨微结构和连接性的改进。n＝8,**P<0.01vs.运载体假手
术,#P<0.05vs.运载体ACLT。Ve-假手术：运载体处理、假手术操作的；In-假手术：TβRI抑制剂处理、假手术操作的；Ve-ACLT：运载体处理、ACLT操作的；In-ACLT：TβRI抑制剂处理、ACLT操作的小鼠。
[0028] 图13：ACLT小鼠的软骨下骨的灌注。(a)来自ACLT小鼠的膝关节的代表性MRI T2加权图像。(b)灌注测量的验证。定量软骨下骨中不同部位(在(a)中标出)的灌注率。如(b)中
所示，灌注率在胫骨、股骨和骨髓中高，在那里血液被充分供应。灌注率在肌肉中低，在那里血液供应低。(c)ACLT手术后，ACLT小鼠的软骨下骨中的灌注在1个月时显著增加，然后在2
个月时减少至靠近健康软骨下骨，但仍高于健康软骨下骨。n＝8。
所示，灌注率在胫骨、股骨和骨髓中高，在那里血液被充分供应。灌注率在肌肉中低，在那里血液供应低。(c)ACLT手术后，ACLT小鼠的软骨下骨中的灌注在1个月时显著增加，然后在2
个月时减少至靠近健康软骨下骨，但仍高于健康软骨下骨。n＝8。
[0029] 图14：ACLT手术后1个月，巢蛋白-CreER::Rosa26-lacZfl/fl小鼠的胫骨软骨下骨和关节软骨中的β-gal阳性细胞分布。Gtrosa26tm1Sor靶向突变纯合的小鼠用于试验巢蛋
白-Cre转基因的细胞表达模式。被他莫昔芬诱导后，Cre表达导致阻止lacZ基因表达的
loxP-侧翼的终止序列的去除。因此，LacZ的X-gal染色(蓝色)在表达巢蛋白-Cre的细胞和
其子群体中永久表达。ACLT后1个月他莫昔芬诱导后，β-gal阳性细胞在软骨下骨髓腔中检
测到(第2图)，但在关节软骨中未检测到(第3图)。n＝8。
白-Cre转基因的细胞表达模式。被他莫昔芬诱导后，Cre表达导致阻止lacZ基因表达的
loxP-侧翼的终止序列的去除。因此，LacZ的X-gal染色(蓝色)在表达巢蛋白-Cre的细胞和
其子群体中永久表达。ACLT后1个月他莫昔芬诱导后，β-gal阳性细胞在软骨下骨髓腔中检
测到(第2图)，但在关节软骨中未检测到(第3图)。n＝8。
[0030] 图15：软骨下中类骨质岛的形成，TβRI抑制剂减少ACLT小鼠中未偶联的骨形成和血管发生。(a)用运载体处理的假手术操作(假手术)、用运载体处理的ACLT操作(运载体)、
或用TβRI抑制剂处理的ACLT操作(抑制剂)后一个月收集的胫骨软骨下骨中，巢蛋白(红色)
和osterix(棕色)的免疫荧光或免疫组织化学分析和定量。DAPI染色细胞核(蓝色)(上图)。
比例尺，50μm。(b)胫骨软骨下骨切片中骨钙素(棕色)的免疫组织化学分析和三色染色。比
例尺，50μm。空心箭头指示骨钙素+细胞且实心箭头指示类骨质。(c)来自小鼠软骨下骨的骨髓中巢蛋白和osterix的流式细胞术分析。(d)钙黄绿素(绿色)和二甲酚橙(橙色)荧光双重
标记。比例尺，100μm。(e)软骨下骨中CD31(棕色)的免疫组织化学分析和定量。比例尺，50μm。(f)胫骨软骨下骨的基于CT的微血管造影术和软骨下骨血管容量(VV)和血管数目(VN)的
定量，比例尺，500μm。(g)经由带有对比度的T2加权MRI扫描获得的灌注率。(h)代表性MRI T1加权图像。红色箭头指示骨髓损伤。n＝8-12；*P<0.05vs.假手术；#P<0.05vs.运载体。
或用TβRI抑制剂处理的ACLT操作(抑制剂)后一个月收集的胫骨软骨下骨中，巢蛋白(红色)
和osterix(棕色)的免疫荧光或免疫组织化学分析和定量。DAPI染色细胞核(蓝色)(上图)。
比例尺，50μm。(b)胫骨软骨下骨切片中骨钙素(棕色)的免疫组织化学分析和三色染色。比
例尺，50μm。空心箭头指示骨钙素+细胞且实心箭头指示类骨质。(c)来自小鼠软骨下骨的骨髓中巢蛋白和osterix的流式细胞术分析。(d)钙黄绿素(绿色)和二甲酚橙(橙色)荧光双重
标记。比例尺，100μm。(e)软骨下骨中CD31(棕色)的免疫组织化学分析和定量。比例尺，50μm。(f)胫骨软骨下骨的基于CT的微血管造影术和软骨下骨血管容量(VV)和血管数目(VN)的
定量，比例尺，500μm。(g)经由带有对比度的T2加权MRI扫描获得的灌注率。(h)代表性MRI T1加权图像。红色箭头指示骨髓损伤。n＝8-12；*P<0.05vs.假手术；#P<0.05vs.运载体。
[0031] 图16：Dunkin Hartley豚鼠自发性骨关节炎的膝关节中的软骨下骨髓骨损伤当注射TGFβI型受体抑制剂3个月时被抑制，骨髓损伤显著减少。左图)以不同剂量TβRI抑制剂或运载体处理3个月的豚鼠的膝关节的MRI扫描。红色箭头指示远端股骨(上列)或胫骨平台
(下列)的软骨下骨中的骨髓损伤。右图)骨髓损伤强度的定量分析。
(下列)的软骨下骨中的骨髓损伤。右图)骨髓损伤强度的定量分析。
[0032] 发明详述
[0033] 应理解，本发明不限于本文所描述的具体方法和组分等，因为它们可能会有所变化。还应理解，本文所用的术语仅为了描述具体的实施方案的目的使用，并非意图限制本发
明的范围。必须注意，除非上下文明确地另有说明，本文和所附权利要求书中使用的单数形
式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代对象。因此，例如，提及“蛋白”是提及一种或更多种蛋白，并包括本领域技术人员已知的其等同物等。
明的范围。必须注意，除非上下文明确地另有说明，本文和所附权利要求书中使用的单数形
式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代对象。因此，例如，提及“蛋白”是提及一种或更多种蛋白，并包括本领域技术人员已知的其等同物等。
[0034] 除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。描述了具体的方法、装置和材料，尽管与本文所述的这
些材料和方法类似或等同的任何材料和方法可用于实施或测试本发明。
些材料和方法类似或等同的任何材料和方法可用于实施或测试本发明。
[0035] 本文引用的所有出版物，包括所有期刊文献、书、手册、公开的专利申请和授权的专利，均以引用的方式并入本文。此外，提供了说明书、实施例和所附权利要求书中使用的
一些术语和短语的含义。所述定义在本质上并不意味着进行限制，而是用于提供对本发明
某些方面更清晰的理解。
一些术语和短语的含义。所述定义在本质上并不意味着进行限制，而是用于提供对本发明
某些方面更清晰的理解。
[0036] 关节软骨退化是骨关节炎中的主要问题，其最近已被归因于缺氧可诱导的因子-2α(HIF-2α)和补体成分5(C5)，除了充分建立的ADAMTS5和基质金属蛋白酶13(MMP13)以外。
关节软骨的内稳态和完整性依赖于其与软骨下骨和其他关节组织的生物化学和生物机械
相互作用。软骨下骨在关节活动期间为其上的关节软骨提供机械支撑，并响应于机械环境
的改变经由建模(modeling)或骨再塑(remodeling)经历恒定适应。在负重关节上的机械负
荷的不稳定性的情形中，诸如因韧带损伤、过度体重、或衰老期间的虚弱肌肉发生的，软骨
下骨和钙化软骨区域经历变化。例如，前交叉韧带(ACL)的破裂增加膝骨关节炎的风险，且
估计患有骨关节炎的个体的大约20-35％具有偶发的ACL撕裂。临床上，骨赘形成、软骨下骨
硬化、在骨软骨连接处潮线分裂伴随血管发生、和关节软骨退化是骨关节炎的特征。骨髓损
伤与疼痛紧密相关，并牵涉在预测骨关节炎中软骨损伤的严重度。在健康关节软骨中，基质
周转保持在相对低的速率且软骨细胞抵抗增殖和终末分化。在骨关节炎的进展期间，X型胶
原、碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2(RUNX2)和MMP13在关节软骨细胞中表达，伴随关节软
骨中减少的蛋白聚糖和扩张的钙化软骨区域。然而，在骨关节炎进展期间软骨下骨对关节
软骨退化的可能贡献的潜在确切机制主要是未知的。
关节软骨的内稳态和完整性依赖于其与软骨下骨和其他关节组织的生物化学和生物机械
相互作用。软骨下骨在关节活动期间为其上的关节软骨提供机械支撑，并响应于机械环境
的改变经由建模(modeling)或骨再塑(remodeling)经历恒定适应。在负重关节上的机械负
荷的不稳定性的情形中，诸如因韧带损伤、过度体重、或衰老期间的虚弱肌肉发生的，软骨
下骨和钙化软骨区域经历变化。例如，前交叉韧带(ACL)的破裂增加膝骨关节炎的风险，且
估计患有骨关节炎的个体的大约20-35％具有偶发的ACL撕裂。临床上，骨赘形成、软骨下骨
硬化、在骨软骨连接处潮线分裂伴随血管发生、和关节软骨退化是骨关节炎的特征。骨髓损
伤与疼痛紧密相关，并牵涉在预测骨关节炎中软骨损伤的严重度。在健康关节软骨中，基质
周转保持在相对低的速率且软骨细胞抵抗增殖和终末分化。在骨关节炎的进展期间，X型胶
原、碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2(RUNX2)和MMP13在关节软骨细胞中表达，伴随关节软
骨中减少的蛋白聚糖和扩张的钙化软骨区域。然而，在骨关节炎进展期间软骨下骨对关节
软骨退化的可能贡献的潜在确切机制主要是未知的。
[0037] 近年来，TGF-β在骨关节炎的发病中的作用已经吸引了越来越多的注意。TGF-β对于关节软骨代谢内稳态和结构完整性的维持是必要的。TGF-β1刺激软骨细胞增殖，且小鼠
中关节软骨中TGF-β1的敲除或TGF-β信号传导的阻断导致蛋白聚糖丧失和软骨退化。关节
软骨中升高的ALK1-Smad1/5vs.ALK5-Smad2/3比例可能有助于骨关节炎的发病。若干研究
组已经证明，在骨关节炎动物模型中，内源TGF-β1活性的消除减少体内骨赘形成但加剧关
节软骨退化。我们此前已经显示，TGF-β1在破坏骨的骨吸收期间被活化，并诱导骨髓MSC向
用于新骨形成的吸收陷窝的迁移，用作偶联因子。在这一研究中，我们研究了在骨关节炎进
展期间TGF-β1对软骨下骨病理学和关节软骨退化的作用。我们发现，在不同骨关节炎动物
模型中，软骨下骨中TGF-β1活性的抑制减弱了其病理变化并减少了关节软骨的退化。
中关节软骨中TGF-β1的敲除或TGF-β信号传导的阻断导致蛋白聚糖丧失和软骨退化。关节
软骨中升高的ALK1-Smad1/5vs.ALK5-Smad2/3比例可能有助于骨关节炎的发病。若干研究
组已经证明，在骨关节炎动物模型中，内源TGF-β1活性的消除减少体内骨赘形成但加剧关
节软骨退化。我们此前已经显示，TGF-β1在破坏骨的骨吸收期间被活化，并诱导骨髓MSC向
用于新骨形成的吸收陷窝的迁移，用作偶联因子。在这一研究中，我们研究了在骨关节炎进
展期间TGF-β1对软骨下骨病理学和关节软骨退化的作用。我们发现，在不同骨关节炎动物
模型中，软骨下骨中TGF-β1活性的抑制减弱了其病理变化并减少了关节软骨的退化。
[0038] I.定义
[0039] 整个说明书使用了以下定义。其他定义纳入说明书中以便于参考。
[0040] “剂”是指可用作药物组合物或可用在药物组合物中、或可以是化合物的所有材料，诸如小的合成的或天然衍生的有机化合物、核酸、蛋白、多肽/肽、抗体、片段、亚型、变体或可独立用于此类目的的其他材料，都根据本发明。
[0041] 肽可用作剂。术语“肽”在本文宽泛地使用，是指包含由肽键连接的两种或更多种氨基酸或氨基酸类似物(或其修饰形式)的分子。如此，肽剂可包含一种或更多种D-氨基酸
和/或L-氨基酸；和/或一种或更多种氨基酸类似物，例如，在其反应性侧链已被衍生化或以
其他方式被修饰的氨基酸。此外，肽中的一个或更多个肽键可被修饰，且在氨基末端或羧基
末端或在二者的反应基团可被修饰。包含D-氨基酸、或L-氨基酸类似物或类似物的肽，可具
有对蛋白酶、氧化剂或肽在生物环境中可能遇到的其他反应性材料改进的稳定性。另外，肽
剂(或测试剂)的稳定性可通过产生(或连接)包含该肽和第二多肽(例如，抗体的Fc结构域)
的融合蛋白来改进，该融合蛋白增加肽剂的体内半衰期。肽还可被修饰以具有生物环境中
减少的稳定性，如果需要，使得肽在环境中有活性的时间段被减少。
和/或L-氨基酸；和/或一种或更多种氨基酸类似物，例如，在其反应性侧链已被衍生化或以
其他方式被修饰的氨基酸。此外，肽中的一个或更多个肽键可被修饰，且在氨基末端或羧基
末端或在二者的反应基团可被修饰。包含D-氨基酸、或L-氨基酸类似物或类似物的肽，可具
有对蛋白酶、氧化剂或肽在生物环境中可能遇到的其他反应性材料改进的稳定性。另外，肽
剂(或测试剂)的稳定性可通过产生(或连接)包含该肽和第二多肽(例如，抗体的Fc结构域)
的融合蛋白来改进，该融合蛋白增加肽剂的体内半衰期。肽还可被修饰以具有生物环境中
减少的稳定性，如果需要，使得肽在环境中有活性的时间段被减少。
[0042] 抗体提供可用作本发明中的剂的肽的实例。本文所用的术语“抗体”以其最宽泛的含义使用，包括多克隆和单克隆抗体、以及此类抗体的抗原结合片段。抗体的特征部分在
于，其特异性结合抗原，特别是抗原诸如TGF-β(例如，TGF-β1等等)或TGF-β受体(TGF-βRI、RII等等)的一个或更多个表位。术语“特异性结合”、“特异性地结合”、“特异结合活性”等等，当提及抗体使用时是指，抗体与特定表位的相互作用具有至少约1x10-6M、一般至少约
1x10-7M、通常至少约1x10-8M、和特别是至少约1x10-9M或1x10-10M或更小的解离常数。如此，抗体的保留特异结合活性的Fab、F(ab’)2、Fd和Fv片段被包括在抗体定义中。在某些实施方案中，本发明利用直接或间接封闭或中和TGF-β的抗体。在具体实施方案中，使用针对TGF-β
1的抗体。此类抗体是可商购获得的。
于，其特异性结合抗原，特别是抗原诸如TGF-β(例如，TGF-β1等等)或TGF-β受体(TGF-βRI、RII等等)的一个或更多个表位。术语“特异性结合”、“特异性地结合”、“特异结合活性”等等，当提及抗体使用时是指，抗体与特定表位的相互作用具有至少约1x10-6M、一般至少约
1x10-7M、通常至少约1x10-8M、和特别是至少约1x10-9M或1x10-10M或更小的解离常数。如此，抗体的保留特异结合活性的Fab、F(ab’)2、Fd和Fv片段被包括在抗体定义中。在某些实施方案中，本发明利用直接或间接封闭或中和TGF-β的抗体。在具体实施方案中，使用针对TGF-β
1的抗体。此类抗体是可商购获得的。
[0043] 本文所用的术语“抗体”包括天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括例如，单链抗体、嵌合、双功能和人源化抗体、以及其抗原结合片段。此类非天然存在的抗体可利
用固相肽合成构建，可重组产生或可例如通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库
来获得，参见Huse等，246SCIENCE 1275-1281(1989)。制造例如，嵌合、人源化、CDR嫁接的、单链和双功能抗体的这些和其他方法是本领域已知的。一般参见，Harlow和Lane,
ANTIBODIES.A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；
Borrabeck,Antibody Engineering,2d ed.(Oxford University Press 1995)；Winter和
Harris,14IMMUNOL.TODAY 243-46(1993)；Hilyard等，PROTEIN ENGINEERING.A PRACTICAL
APPROACH(IRL Press 1992)；和Ward等，341NATURE 544-46(1989)。
用固相肽合成构建，可重组产生或可例如通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库
来获得，参见Huse等，246SCIENCE 1275-1281(1989)。制造例如，嵌合、人源化、CDR嫁接的、单链和双功能抗体的这些和其他方法是本领域已知的。一般参见，Harlow和Lane,
ANTIBODIES.A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；
Borrabeck,Antibody Engineering,2d ed.(Oxford University Press 1995)；Winter和
Harris,14IMMUNOL.TODAY 243-46(1993)；Hilyard等，PROTEIN ENGINEERING.A PRACTICAL
APPROACH(IRL Press 1992)；和Ward等，341NATURE 544-46(1989)。
[0044] “小分子”是指具有小于约3千道尔顿(kDa)、小于约1.5千道尔顿、或小于约1千道尔顿的分子量的组合物。小分子可以是核酸、肽、多肽、模拟肽(peptidomimetics)、碳水化合物、脂质或其他有机(含碳)或无机分子。“小有机分子”是具有小于约3千道尔顿、小于约
1.5千道尔顿、或小于约1kDa的分子量的有机化合物(或与无机化合物(例如，金属)复合的
有机化合物)。
1.5千道尔顿、或小于约1kDa的分子量的有机化合物(或与无机化合物(例如，金属)复合的
有机化合物)。
[0045] 本文所用的“受试者”或“患者”是指个体，且可包括家养动物(如猫、狗等)；家畜(如牛、马、猪、绵羊、山羊等)，实验动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟类。在一方面，受试者是哺乳动物如灵长类或人。具体地，该术语还包括诊断患有骨关节炎或处于发展骨关节炎的风险的哺乳动物。
[0046] 本文使用的术语“有效”是指足以实现所需的、所希望的或预期结果。更具体地，本文提供的“治疗有效量”是指本发明的TGF-β抑制剂单独地或与另一种治疗剂(例如另一种TGF-β抑制剂和/或不同的治疗剂)组合提供所需治疗效果所必需的量，例如有效预防、缓解
或改善疾病的症状或延长被治疗的受试者的生存期的量。在具体实施方案中，本文提供的
术语“治疗有效量”是指TGF-β抑制剂提供所需治疗效果所必需的量，例如有效预防、缓解或改善疾病或病症的症状或延长被治疗的受试者的生存期的量。在更具体的实施方案中，治
疗有效量的TGF-β抑制剂是指治疗或预防骨关节炎、阻止韧带损伤引起的骨关节炎发作、阻
止不稳定的关节中骨关节炎发作、或减少关节中关节软骨退化所必需的量。
或改善疾病的症状或延长被治疗的受试者的生存期的量。在具体实施方案中，本文提供的
术语“治疗有效量”是指TGF-β抑制剂提供所需治疗效果所必需的量，例如有效预防、缓解或改善疾病或病症的症状或延长被治疗的受试者的生存期的量。在更具体的实施方案中，治
疗有效量的TGF-β抑制剂是指治疗或预防骨关节炎、阻止韧带损伤引起的骨关节炎发作、阻
止不稳定的关节中骨关节炎发作、或减少关节中关节软骨退化所必需的量。
[0047] 本领域的普通技术人员将理解，所需的精确量对于不同受试者有所不同，取决于受试者的年龄、健康情况、所治疗病症的严重性、施用的具体化合物和/或组合物等。任何个体病例的合适“治疗有效量”可由本领域普通技术人员通过参照相关文本和文献和/或通过
使用常规实验来确定。
使用常规实验来确定。
[0048] 本文所用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得所需的药理学效果和/或生理学效果。所述效果可以是预防性的，即完全或部分预防疾病、病症或其症
状，并且/或者可以是治疗性的，即部分或完全治愈疾病或病症和/或疾病或病症所导致的
不良影响。本文使用的“治疗”涵盖对受试者尤其是人的疾病或病症的任何治疗，并包括：
(a)预防所述疾病或病症在受试者中发生，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断出
患有所述疾病；(b)抑制所述疾病或病症，即阻止其发展；和(c)缓解所述疾病或病症，例如
引起所述疾病或病症的消退，例如以完全或部分地消除所述疾病或病症的症状。
状，并且/或者可以是治疗性的，即部分或完全治愈疾病或病症和/或疾病或病症所导致的
不良影响。本文使用的“治疗”涵盖对受试者尤其是人的疾病或病症的任何治疗，并包括：
(a)预防所述疾病或病症在受试者中发生，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断出
患有所述疾病；(b)抑制所述疾病或病症，即阻止其发展；和(c)缓解所述疾病或病症，例如
引起所述疾病或病症的消退，例如以完全或部分地消除所述疾病或病症的症状。
[0049] II.TGF-β抑制剂
[0050] 在某些实施方案中，本发明的方法利用TGF-β抑制剂。术语“TGF-β”是指蛋白的转化生长因子-β家族的一种或更多种成员，例如，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其是细胞生长和分化、胚胎和骨发育、细胞外基质形成、血细胞生成、免疫和炎性应答的多效调节物。这一超家族的其他成员包括激活素(activin)、抑制素、骨形态发生蛋白、和Mullerian抑制物质。TGF-β起始细胞内信号传导途径，最终导致调节细胞周期、控制增殖响应、或涉及介导外-内细胞信号传导、细胞粘附、迁移和细胞间通讯的细胞外基质蛋白的基因表达。应理解，术语
“TGF-β”的使用是指该超家族的一种或更多种成员。在某些实施方案中，术语“TGF-β”是指TGF-β1。
“TGF-β”的使用是指该超家族的一种或更多种成员。在某些实施方案中，术语“TGF-β”是指TGF-β1。
[0051] 术语“TGF-β抑制剂”是指具有直接或间接抑制TGF-β的生物功能的能力的剂。如此，TGF-β抑制剂包括但不限于，TGF-β特异性的抑制剂(例如，封闭(中和)抗体)、可溶性
TGF-β受体(其将竞争性地抑制TGF-β)、膜结合TGF-β受体、灭活负责活化前体TGF-β为成熟TGF-β的蛋白酶的蛋白酶抑制剂、阻止TGF-β结合受体的TGF-β受体(I、II或III型)特异性抑制剂(例如，抗体或小分子)、阻断TGF-β的表达的siRNA或反义RNA、或前述的组合。
TGF-β受体(其将竞争性地抑制TGF-β)、膜结合TGF-β受体、灭活负责活化前体TGF-β为成熟TGF-β的蛋白酶的蛋白酶抑制剂、阻止TGF-β结合受体的TGF-β受体(I、II或III型)特异性抑制剂(例如，抗体或小分子)、阻断TGF-β的表达的siRNA或反义RNA、或前述的组合。
[0052] 因此，术语“TGF-β抑制剂”旨在涵盖天然存在的抑制剂，包括但不限于，chordin和noggin蛋白、Cerebus、Gremlin、DAN和DAN蛋白家族的其他成员、和卵泡抑素。小分子TGF-β抑制剂包括但不限于，SB43154(GlaxoSmithKline,King of Prussia,Pa.)、LY 2157299(Axon Medichem,Groningen,NL)和TGF-β受体激酶抑制剂诸如[3-(吡啶-2基)-4-(4-醌
基)]-1H吡唑和SD-208(Scios,Inc,Fremont,Calif.)、或TGF-β2抑制剂AP 12009
(Antisense Pharma,Regensburg,Bavaria)、吡非尼酮(InterMune Inc.,Brisbane,
Calif.)。参见Yingling等，3NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY1011-22(2004)。在其他实施
方案中，TGF-β抑制剂包括甘露糖-6-磷酸(BTG)、LF-984、他莫昔芬(乙胺,2-(4-(1,2-二苯
基-1-丁烯基)苯氧基)-N,N-二甲基-,(Z)-)、吡非尼酮(CAS No.53179-13-8)(MARNAC)、曲
尼司特(CAS No.53902-12-8)(Kissei)、IN-1130(In2Gen)、来自Inflazyme的TGF-β拮抗剂
(Pharmaprojects No.6075)、来自Eli Lilly的TGF-βI受体激酶抑制剂(美国专利号
7511056；美国专利公布号20080262004)、和其类似物或衍生物。
基)]-1H吡唑和SD-208(Scios,Inc,Fremont,Calif.)、或TGF-β2抑制剂AP 12009
(Antisense Pharma,Regensburg,Bavaria)、吡非尼酮(InterMune Inc.,Brisbane,
Calif.)。参见Yingling等，3NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY1011-22(2004)。在其他实施
方案中，TGF-β抑制剂包括甘露糖-6-磷酸(BTG)、LF-984、他莫昔芬(乙胺,2-(4-(1,2-二苯
基-1-丁烯基)苯氧基)-N,N-二甲基-,(Z)-)、吡非尼酮(CAS No.53179-13-8)(MARNAC)、曲
尼司特(CAS No.53902-12-8)(Kissei)、IN-1130(In2Gen)、来自Inflazyme的TGF-β拮抗剂
(Pharmaprojects No.6075)、来自Eli Lilly的TGF-βI受体激酶抑制剂(美国专利号
7511056；美国专利公布号20080262004)、和其类似物或衍生物。
[0053] TGF-β抑制剂可与靶向异共轭物至作用位点的分子共轭。在某些实施方案中，TGF-β抑制剂可与二膦酸盐/酯或其衍生物共轭。在一个实施方案中，TGF-β抑制剂可与阿伦膦酸盐/酯共轭。在另一实施方案中，TGF-β抑制剂可与利塞膦酸盐/酯(actenol)共轭。在又另一实施方案中，TGF-β抑制剂可与唑来膦酸盐/酯 共轭。在某些实施方案中，
TGF-β抑制剂抗体与二膦酸盐/酯或其衍生物共轭。在其他实施方案中，TGF-β抑制剂小分子与二膦酸盐/酯或其衍生物共轭。在具体实施方案中，小分子包括卤夫酮、kartogenin、SB-
505124、或其衍生物。在特定实施方案中，共轭可包括接头。参见例如，Guan等，18(3)NATURE MEDICINE 456-U159(2012)和Johnson等，336(6082)SCIENCE 717-21(2012)。
TGF-β抑制剂抗体与二膦酸盐/酯或其衍生物共轭。在其他实施方案中，TGF-β抑制剂小分子与二膦酸盐/酯或其衍生物共轭。在具体实施方案中，小分子包括卤夫酮、kartogenin、SB-
505124、或其衍生物。在特定实施方案中，共轭可包括接头。参见例如，Guan等，18(3)NATURE MEDICINE 456-U159(2012)和Johnson等，336(6082)SCIENCE 717-21(2012)。
[0054] TGF-β的作用通过活性TGF-β向细胞上存在的特异性受体结合，随后向这些细胞转导信号来介导。TGF-β抑制剂或拮抗剂在本文进一步定义为抑制TGF-β信号转导的分子。在
某些实施方案中，结合TGF-β并阻止TGF-β结合TGF-β受体的分子将用作TGF-β拮抗剂。此类分子包括TGF-β的中和抗体。参见例如，WO 2005/010049；Lucas等.145J.IMMUNOL.1415-22
(1990)和Dasch等，142J.IMMUNOL.1536-41(1989)。本领域技术人员清楚来源于一个物种例
如小鼠的抗体可被工程化以在第二物种例如人类中治疗使用的多种途径。
某些实施方案中，结合TGF-β并阻止TGF-β结合TGF-β受体的分子将用作TGF-β拮抗剂。此类分子包括TGF-β的中和抗体。参见例如，WO 2005/010049；Lucas等.145J.IMMUNOL.1415-22
(1990)和Dasch等，142J.IMMUNOL.1536-41(1989)。本领域技术人员清楚来源于一个物种例
如小鼠的抗体可被工程化以在第二物种例如人类中治疗使用的多种途径。
[0055] TGF-β受体的可溶性形式也将结合TGF-β并阻止对膜结合TGF-β受体的结合。参见Lin等，68CELL 775-85(1992)；和Wang等，67CELL 797-805(1991)。TGF-β受体的可溶性形式可通过本领域已知的方法制备。例如，可制备缺少TGF-β受体的跨膜域的缺失突变体，其将
表达可溶性TGF-β结合蛋白。参见例如，Miyazono等，55Adv.Immunol.181(1994)。类似地，可采用选择性TGF-β受体抑制剂，诸如SB431542、LY364947、SD-208和A-83-01。
表达可溶性TGF-β结合蛋白。参见例如，Miyazono等，55Adv.Immunol.181(1994)。类似地，可采用选择性TGF-β受体抑制剂，诸如SB431542、LY364947、SD-208和A-83-01。
[0056] 其他类型TGF-β拮抗剂也是本领域已知的。例如，核心蛋白聚糖(decorin)是结合TGF-β并调节这一生长因子的活性的小的软骨素-硫酸皮肤素蛋白聚糖。参见Yamaguchi等，
346NATURE 281-84(1990)。可使用阻断TGF-β的某些生物活性的蛋白激酶抑制剂。参见
Ohtsuki&Massague,12MOL.CELL.BIOL.261-65(1992)。还参见Mselle等，
124CLIN.IMMUNOL.69(2007)；Eriksson等，56AM.J.REPROD.IMM.321(2006)；Eriksson等，
176J.IMMUNOL.6219(2006)；Meadows等，6INT.IMMUNOPHARM.1020(2006)；Saunier&
Akhurst,6CURR.CAN.DRUG TARGETS 565(2006)；Tsuchida等，6MINI-REVIEWS
MED.CHEM.1255(2006)；Wira等，206IMMUNOL.REV.306(2005)；Garba,等，
168J.IMMUNOL.2247(2002)；和Sato等，164J.IMMUNOL.2285(2000)。
346NATURE 281-84(1990)。可使用阻断TGF-β的某些生物活性的蛋白激酶抑制剂。参见
Ohtsuki&Massague,12MOL.CELL.BIOL.261-65(1992)。还参见Mselle等，
124CLIN.IMMUNOL.69(2007)；Eriksson等，56AM.J.REPROD.IMM.321(2006)；Eriksson等，
176J.IMMUNOL.6219(2006)；Meadows等，6INT.IMMUNOPHARM.1020(2006)；Saunier&
Akhurst,6CURR.CAN.DRUG TARGETS 565(2006)；Tsuchida等，6MINI-REVIEWS
MED.CHEM.1255(2006)；Wira等，206IMMUNOL.REV.306(2005)；Garba,等，
168J.IMMUNOL.2247(2002)；和Sato等，164J.IMMUNOL.2285(2000)。
[0057] TGF-β抑制剂还可包括肽剂。这些分子是肽性质的，是指它们包含由酰胺键即肽键连接的α-氨基酸。术语“肽”不限于短的氨基酸链；它可包括长度多于50个氨基酸的链。如此，本文使用的术语肽还涵盖多肽和蛋白。在具体实施方案中，TGF-β1抑制剂肽可以是在美国专利公布号20110294734(参见表1)中描述的肽。
[0058] 在特定实施方案中，TGF-β1抑制剂肽具有通过与TGF-β1的活性形式相互作用，抑制TGF-β1的生物功能的能力。在某些实施方案中，例如，尽管TGF-β1抑制剂的特征为其与
TGF-β1相互作用的能力，应理解，该抑制剂可另外与其他哺乳动物亚型(例如，TGF-β2和/
或-β3)相互作用。这一活性抑制TGF-β与相应超家族受体的相互作用，所述相应超家族受体如I型受体诸如激活素样激酶ALK1、ALK2、ALK5；II型受体诸如II型TGF-β受体(TGF-βRII)；
共受体诸如endoglin和crypto。另外，抑制剂还可与以下相互作用：与I型受体如ALK3、
ALK4、ALK6、ALK7；II型受体如ActRII、ActRIIb、BMPRII、MISRII和TGF-βRII；共受体如RGMa、RGMb和血幼素(hemojuvelin)；伪受体如BAMBI；信号传导成分诸如chordin、卵泡抑素、
leftyl、noggin、sclerostin；和TGF-β信号转导途径中的其他成员或TGF-β信号转导途径与另一途径共有的成员。TGF-β活性的抑制(例如，在软骨下骨中)还可通过经由siRNA、肽、或TGF-β拮抗剂或负调节物抑制TGF-β下游成分来实现。
TGF-β1相互作用的能力，应理解，该抑制剂可另外与其他哺乳动物亚型(例如，TGF-β2和/
或-β3)相互作用。这一活性抑制TGF-β与相应超家族受体的相互作用，所述相应超家族受体如I型受体诸如激活素样激酶ALK1、ALK2、ALK5；II型受体诸如II型TGF-β受体(TGF-βRII)；
共受体诸如endoglin和crypto。另外，抑制剂还可与以下相互作用：与I型受体如ALK3、
ALK4、ALK6、ALK7；II型受体如ActRII、ActRIIb、BMPRII、MISRII和TGF-βRII；共受体如RGMa、RGMb和血幼素(hemojuvelin)；伪受体如BAMBI；信号传导成分诸如chordin、卵泡抑素、
leftyl、noggin、sclerostin；和TGF-β信号转导途径中的其他成员或TGF-β信号转导途径与另一途径共有的成员。TGF-β活性的抑制(例如，在软骨下骨中)还可通过经由siRNA、肽、或TGF-β拮抗剂或负调节物抑制TGF-β下游成分来实现。
[0059] TGF-β抑制剂肽可从合成这些肽的多种细胞来源获得，所述细胞来源包括例如，转染有能够引导肽合成或分泌的重组DNA分子的细胞。可选地，TGF-β抑制剂肽可通过化学合
成方法合成，所述化学合成方法包括但不限于固相肽合成。肽也是商购可获得的，例如P144
由Sigma-Genosys,Ltd.(Cambridge,UK)供应。
成方法合成，所述化学合成方法包括但不限于固相肽合成。肽也是商购可获得的，例如P144
由Sigma-Genosys,Ltd.(Cambridge,UK)供应。
[0060] III.药物组合物和施用
[0061] 因此，本发明的药物组合物可包含有效量的TGF-β抑制剂。本文使用的术语“有效的”是指足以实现所需的、所希望的或预期结果。更具体地，“有效量”或“治疗有效量”可互换使用，是指至少一种TGF-β抑制剂，可能与又另一种治疗剂另外组合，提供所需“治疗”(本文定义的)或治疗效果所必需的量，例如有效预防、缓解、治疗或改善疾病或病症的症状或
延长被治疗的受试者的生存期的量。在特定实施方案中，以治疗有效量施用本发明的药物
组合物以治疗患有骨关节炎的患者或处于发展骨关节炎的风险中的患者，包括患有韧带损
伤的患者。本领域的普通技术人员将理解，所需的精确TGF-β抑制剂剂量量对于不同受试者
有所不同，取决于受试者的年龄、健康情况、所治疗病症的严重性、施用的具体化合物和/或组合物等。任何个体病例的合适“治疗有效量”可由本领域普通技术人员通过参照相关文本
和文献和/或通过使用常规实验来确定。
延长被治疗的受试者的生存期的量。在特定实施方案中，以治疗有效量施用本发明的药物
组合物以治疗患有骨关节炎的患者或处于发展骨关节炎的风险中的患者，包括患有韧带损
伤的患者。本领域的普通技术人员将理解，所需的精确TGF-β抑制剂剂量量对于不同受试者
有所不同，取决于受试者的年龄、健康情况、所治疗病症的严重性、施用的具体化合物和/或组合物等。任何个体病例的合适“治疗有效量”可由本领域普通技术人员通过参照相关文本
和文献和/或通过使用常规实验来确定。
[0062] 本发明的药物组合物是以适于向受试者体内施用的生物相容形式。药物组合物还包括药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指由美国联邦政府或州政府的管理机
构批准的，或者是美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，更特别是人类的。术语“载
体”是指与TGF-β抑制剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物被口服施用时，水可以作为载体。当药物组合物被静脉施用时，盐水和右旋糖水溶液可以作为载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可
被用作可注射溶液的液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。药物组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
构批准的，或者是美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，更特别是人类的。术语“载
体”是指与TGF-β抑制剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物被口服施用时，水可以作为载体。当药物组合物被静脉施用时，盐水和右旋糖水溶液可以作为载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可
被用作可注射溶液的液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。药物组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
[0063] 本发明的药物组合物可采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等等的形式。组合物可以常规粘合剂和载体诸如甘油三酯被配制为栓剂。口服制剂可包括标准载体，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。在具体实施方案中，药物组合物包含有效量的TGF-β抑制剂连同适合量的药学上可接受的载体，以
便提供适合施用于患者的形式。制剂应适合施用模式。
便提供适合施用于患者的形式。制剂应适合施用模式。
[0064] 本发明的药物组合物可通过任何特定施用途径施用，包括但不限于口服、肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心脏内、骨内(intraosteal)、骨内(intraosseous)、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸廓内、子宫内、膀胱内、大丸剂(bolus)、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内、离子电渗手段、或经皮手段。最适合的途径是口服施用或注射。在某些实施方案中，注射到患病关节区域是优选的。
[0065] 通常，包含TGF-β抑制剂的药物组合物以通过常规测试确定的合适剂量可单独地或与其他治疗剂一起使用，目的是获得最佳疗效，而使任何潜在毒性最小化。使用本发明的
药物组合物的剂量方案可根据多种因素来选择，包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别、医疗条件；待治疗病症的严重性；施用途径；患者肾功能和肝功能；以及所采用的具体药物
组合物。普通的内科医生可以容易地确定和开具预防、对抗或阻止病症发展所需的有效量
的药物组合物(以及可能存在的其他药剂，包括治疗剂)。
药物组合物的剂量方案可根据多种因素来选择，包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别、医疗条件；待治疗病症的严重性；施用途径；患者肾功能和肝功能；以及所采用的具体药物
组合物。普通的内科医生可以容易地确定和开具预防、对抗或阻止病症发展所需的有效量
的药物组合物(以及可能存在的其他药剂，包括治疗剂)。
[0066] 在产生最大疗效并具有最小毒性的范围内，实现治疗方案(例如，包含至少一种TGF-β抑制剂(并任选地与另一种治疗剂组合)的药物组合物)浓度的最佳精度，可能需要基
于所述药物组合物针对一个或多个靶位点的可用性的动力学的方案。当确定治疗方案的最
佳浓度时，可考虑药物组合物的分布、平衡和清除。当组合使用以实现所需的效果时，可调
整本文公开的药物组合物的剂量。在另一方面，药物组合物和多种治疗剂的剂量可独立地
优化并结合，以实现协同的结果，其中病理比单独使用两种中的任一种均减少得多。
于所述药物组合物针对一个或多个靶位点的可用性的动力学的方案。当确定治疗方案的最
佳浓度时，可考虑药物组合物的分布、平衡和清除。当组合使用以实现所需的效果时，可调
整本文公开的药物组合物的剂量。在另一方面，药物组合物和多种治疗剂的剂量可独立地
优化并结合，以实现协同的结果，其中病理比单独使用两种中的任一种均减少得多。
[0067] 在注射的情况下，通常方便的是向成人(约60kg)施用每天约0.0001μg-30mg、约0.01μg-20mg或约0.01-10mg的量。在其他动物的情况下，也可施用对60公斤计算的剂量。
[0068] 本发明药物组合物的剂量可任选地包括约0.0001μg至约1,000mg/kg/施用，或约0.001μg至约100.0mg/kg/施用，从约0.01μg至约10mg/kg/施用，从约0.1μg至约10mg/kg/施用，包括但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、
63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、
88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100-500mg/kg/施用，或其任意范围、值或部分，或达到以下血清浓度：0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、
3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、
10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、
5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、
11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、
17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、
1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000μg/ml血清浓度/单次或多次施用，或其任意范围、值或部分。
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、
63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、
88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100-500mg/kg/施用，或其任意范围、值或部分，或达到以下血清浓度：0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、
3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、
10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、
5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、
11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、
17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、
1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000μg/ml血清浓度/单次或多次施用，或其任意范围、值或部分。
[0069] 作为非限制性实例，对患者的治疗可以使用单剂量、输注剂量或重复剂量，在以下天的至少一天：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40，或可选地或另外，在以下周的至少之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或
52，或可选地或另外，在以下年的至少之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19或20年、或其任意组合，以如下一次性或周期剂量的本发明的组合物来提供：每天约0.1ng到约100mg/kg，如0.0001、0.001、0.01、0.10.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、
70、80、90或100mg/kg。
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40，或可选地或另外，在以下周的至少之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或
52，或可选地或另外，在以下年的至少之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19或20年、或其任意组合，以如下一次性或周期剂量的本发明的组合物来提供：每天约0.1ng到约100mg/kg，如0.0001、0.001、0.01、0.10.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、
70、80、90或100mg/kg。
[0070] 具体地，可每周至少一次施用本发明的药物组合物，持续数周的时间段。在一个实施方案中，每周至少一次施用药物组合物，持续数周至数月。在另一实施方案中，每周一次
施用药物组合物，持续4到8周。在又一实施方案中，每周一次施用药物组合物，持续4周。
施用药物组合物，持续4到8周。在又一实施方案中，每周一次施用药物组合物，持续4周。
[0071] 更具体地，可如下施用药物组合物：每天至少一次持续约2天、每天至少一次持续约3天、每天至少一次持续约4天、每天至少一次持续约5天、每天至少一次持续约6天、每天
至少一次持续约7天、每天至少一次持续约8天、每天至少一次持续约9天、每天至少一次持
续约10天、每天至少一次持续约11天、每天至少一次持续约12天、每天至少一次持续约13
天、每天至少一次持续约14天、每天至少一次持续约15天、每天至少一次持续约16天、每天
至少一次持续约17天、每天至少一次持续约18天、每天至少一次持续约19天、每天至少一次
持续约20天、每天至少一次持续约21天、每天至少一次持续约22天、每天至少一次持续约23
天、每天至少一次持续约24天、每天至少一次持续约25天、每天至少一次持续约26天、每天
至少一次持续约27天、每天至少一次持续约28天、每天至少一次持续约29天、每天至少一次
持续约30天、或每天至少一次持续约31天。
至少一次持续约7天、每天至少一次持续约8天、每天至少一次持续约9天、每天至少一次持
续约10天、每天至少一次持续约11天、每天至少一次持续约12天、每天至少一次持续约13
天、每天至少一次持续约14天、每天至少一次持续约15天、每天至少一次持续约16天、每天
至少一次持续约17天、每天至少一次持续约18天、每天至少一次持续约19天、每天至少一次
持续约20天、每天至少一次持续约21天、每天至少一次持续约22天、每天至少一次持续约23
天、每天至少一次持续约24天、每天至少一次持续约25天、每天至少一次持续约26天、每天
至少一次持续约27天、每天至少一次持续约28天、每天至少一次持续约29天、每天至少一次
持续约30天、或每天至少一次持续约31天。
[0072] 可选地，可如下施用药物组合物：约1天一次、约2天一次、约3天一次、约4天一次、约5天一次、约6天一次、约7天一次、约8天一次、约9天一次、约10天一次、约11天一次、约12天一次、约13天一次、约14天一次、约15天一次、约16天一次、约17天一次、约18天一次、约19天一次、约20天一次、约21天一次、约22天一次、约23天一次、约24天一次、约25天一次、约26天一次、约27天一次、约28天一次、约29天一次、约30天一次、或约31天一次。
[0073] 可选地，可如下施用本发明的药物组合物：约1周一次、约2周一次、约3周一次、约4周一次、约5周一次、约6周一次、约7周一次、约8周一次、约9周一次、约10周一次、约11周一次、约12周一次、约13周一次、约14周一次、约15周一次、约16周一次、约17周一次、约18周一次、约19周一次、约20周一次。
[0074] 可选地，可如下施用本发明的药物组合物：约1个月一次、约2个月一次、约3个月一次、约4个月一次、约5个月一次、约6个月一次、约7个月一次、约8个月一次、约9个月一次、约
10个月一次、约11个月一次、或约12个月一次。
10个月一次、约11个月一次、或约12个月一次。
[0075] 可选地，可如下施用药物组合物：每周至少一次持续约2周、每周至少一次持续约3周、每周至少一次持续约4周、每周至少一次持续约5周、每周至少一次持续约6周、每周至少一次持续约7周、每周至少一次持续约8周、每周至少一次持续约9周、每周至少一次持续约
10周、每周至少一次持续约11周、每周至少一次持续约12周、每周至少一次持续约13周、每
周至少一次持续约14周、每周至少一次持续约15周、每周至少一次持续约16周、每周至少一
次持续约17周、每周至少一次持续约18周、每周至少一次持续约19周、或每周至少一次持续
约20周。
10周、每周至少一次持续约11周、每周至少一次持续约12周、每周至少一次持续约13周、每
周至少一次持续约14周、每周至少一次持续约15周、每周至少一次持续约16周、每周至少一
次持续约17周、每周至少一次持续约18周、每周至少一次持续约19周、或每周至少一次持续
约20周。
[0076] 可选地，可如下施用药物组合物：每周至少一次持续约1个月、每周至少一次持续约2个月、每周至少一次持续约3个月、每周至少一次持续约4个月、每周至少一次持续约5个
月、每周至少一次持续约6个月、每周至少一次持续约7个月、每周至少一次持续约8个月、每周至少一次持续约9个月、每周至少一次持续约10个月、每周至少一次持续约11个月、或每
周至少一次持续约12个月。
月、每周至少一次持续约6个月、每周至少一次持续约7个月、每周至少一次持续约8个月、每周至少一次持续约9个月、每周至少一次持续约10个月、每周至少一次持续约11个月、或每
周至少一次持续约12个月。
[0077] 药物组合物还可与一种或更多种另外的治疗剂组合。用在本发明方法中的药物组合物的身份和量的确可由普通医学执业者使用本领域已知的标准技术容易地进行。在其他
具体实施方案中，TGF-β抑制剂可与有效量的另一种TGF-β抑制剂、骨关节炎治疗剂(例如皮质类固醇、透明质酸等)或另一种治疗剂组合施用。
具体实施方案中，TGF-β抑制剂可与有效量的另一种TGF-β抑制剂、骨关节炎治疗剂(例如皮质类固醇、透明质酸等)或另一种治疗剂组合施用。
[0078] 在没有进一步阐述的情况下，应认为，本领域技术人员使用先前的描述可最大程度地利用本发明。下面的实施例仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开内容的其余部
分。
实施例
分。
实施例
[0079] 提出下面的实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和评估本文所描述和要求保护的化合物、组合物、物品、装置和/或方法的完整披露和说明，旨在纯粹地进行说明，而并非旨在限制本发明人认为的发明范围。已努力确保数值(例如，数量、温度等)的
准确性，但本文也可能存在一些误差和偏差。除非另有说明，份是重量份，温度是摄氏度或
在环境温度下，压力为在大气压下或接近大气压。有反应条件的众多改变和组合，例如组分
浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、压力和其他反应范围和条件，这些范围和条件可被用于优化从所述方法得到的产物纯度和收率。仅需要合理的和常规的实验方法来优化这些方法
条件。
准确性，但本文也可能存在一些误差和偏差。除非另有说明，份是重量份，温度是摄氏度或
在环境温度下，压力为在大气压下或接近大气压。有反应条件的众多改变和组合，例如组分
浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、压力和其他反应范围和条件，这些范围和条件可被用于优化从所述方法得到的产物纯度和收率。仅需要合理的和常规的实验方法来优化这些方法
条件。
[0080] 材料和方法
[0081] 人类受试者.在IRB批准后，我们从经历全膝置换手术的患有骨关节炎的78个个体收集胫骨平台样本。处理样本用于μCT、ELISA和组织学检查。我们从Nation Disease
Research Interchange(NDRI)购买了健康膝样本用作对照。
Research Interchange(NDRI)购买了健康膝样本用作对照。
[0082] 小鼠.我们从Charles River购买了C57BL/6J(野生型)小鼠。我们用氯胺酮和赛拉嗪麻醉两月龄的雄性小鼠，然后手术截断前交叉韧带以诱导右膝上与骨关节炎相关的机械
不稳定性。对单独小鼠进行假手术。对于时间过程实验，操作的动物在手术后第0、14、30、60和90天被安乐死，n＝8-12。对于剂量筛选实验，将2月龄的假手术和ACLT操作的小鼠分配到
6个组，每组，n＝10。手术后三天开始，我们每天腹膜内注射不同剂量(0.1、0.5、1、2.5和5mg kg-1)的TβRI抑制剂(SB505124,Sigma Aldrich)或等体积的运载体(DMSO+PBS)，持续30天。
小鼠在手术后第30和60天被安乐死。
不稳定性。对单独小鼠进行假手术。对于时间过程实验，操作的动物在手术后第0、14、30、60和90天被安乐死，n＝8-12。对于剂量筛选实验，将2月龄的假手术和ACLT操作的小鼠分配到
6个组，每组，n＝10。手术后三天开始，我们每天腹膜内注射不同剂量(0.1、0.5、1、2.5和5mg kg-1)的TβRI抑制剂(SB505124,Sigma Aldrich)或等体积的运载体(DMSO+PBS)，持续30天。
小鼠在手术后第30和60天被安乐死。
[0083] 我们从Jackson Laboratory购买了巢蛋白-CreTMER和(ROSA)26Sortm1Sor/J小鼠。Floxed II型TGF-β受体(TβRIIfl/fl)小鼠从Dr.Moses’lab获得。将巢蛋白-CreTMER小鼠与TβRIIfl/fl小鼠杂交。将后代互交以产生以下后代：巢蛋白-CreTMER::TβRIIfl/fl，其中Cre与可被他莫昔芬活化的突变的雌激素受体融合。我们通过PCR分析从小鼠尾分离的基因组DNA确
定转基因小鼠的基因型。对Cre转基因的基因分型通过以引物Cre5′(5′-
CAAATAGCCCTGGCAGAT-3′)和Cre 3′(5′-TGATACAAGGGACATCTTCC-3′)的PCR进行。loxP TβRII等位基因用引物lox1F(5′-TAAACAAGGTCCGGAGCCCA-3′)和lox1R(5′-
ACTTCTGCAAGAGGTCCCCT-3′)鉴定。我们通过将巢蛋白-CreTMER小鼠与具有纯合的阻止下游
lacZ基因表达的loxP侧翼DNA STOP序列的小鼠杂交，产生巢蛋白-CreTMER::Rosa26-LacZ
fl/fl小鼠。然后将后代互交以产生以下基因型：巢蛋白-CreTMER::Rosa26-LacZ fl/fl。我们对两月龄的雄性WT,巢蛋白-CreTMER::TβRIIfl/fl和巢蛋白-CreTMER::Rosa26-LacZ fl/fl雄性小鼠进行假手术或ACLT手术。手术后三天，我们用100mg kg-1体重的他莫昔芬每天处理每个
组，持续30天，并在手术后第30或60天处死小鼠(每处理组n＝8)。CED小鼠在我们的实验室
中如前所述地产生，其中CED衍生的TGF-β1突变(H222D)被由2.3-kb I型胶原启动子驱动的
成骨细胞特异性表达。
定转基因小鼠的基因型。对Cre转基因的基因分型通过以引物Cre5′(5′-
CAAATAGCCCTGGCAGAT-3′)和Cre 3′(5′-TGATACAAGGGACATCTTCC-3′)的PCR进行。loxP TβRII等位基因用引物lox1F(5′-TAAACAAGGTCCGGAGCCCA-3′)和lox1R(5′-
ACTTCTGCAAGAGGTCCCCT-3′)鉴定。我们通过将巢蛋白-CreTMER小鼠与具有纯合的阻止下游
lacZ基因表达的loxP侧翼DNA STOP序列的小鼠杂交，产生巢蛋白-CreTMER::Rosa26-LacZ
fl/fl小鼠。然后将后代互交以产生以下基因型：巢蛋白-CreTMER::Rosa26-LacZ fl/fl。我们对两月龄的雄性WT,巢蛋白-CreTMER::TβRIIfl/fl和巢蛋白-CreTMER::Rosa26-LacZ fl/fl雄性小鼠进行假手术或ACLT手术。手术后三天，我们用100mg kg-1体重的他莫昔芬每天处理每个
组，持续30天，并在手术后第30或60天处死小鼠(每处理组n＝8)。CED小鼠在我们的实验室
中如前所述地产生，其中CED衍生的TGF-β1突变(H222D)被由2.3-kb I型胶原启动子驱动的
成骨细胞特异性表达。
[0084] 大鼠.我们从Charles River购买了两月龄的雄性Lewis大鼠。ACLT如上所述地进行。在ACLT后，我们利用20G针头在内侧平台制造一个管道。将包含0.1μg 1D11(TGF-β1中和抗体,R&D Systems,Minneapolis,MN)或运载体的藻酸盐/酯珠包埋在软骨下骨管道中。然
后用骨蜡封闭管道。我们在手术后第0、1、2和3个月安乐死动物(每组n＝8)。相应地处理膝
关节用于μCT和组织分析。
后用骨蜡封闭管道。我们在手术后第0、1、2和3个月安乐死动物(每组n＝8)。相应地处理膝
关节用于μCT和组织分析。
[0085] 将所有动物保持在Johns Hopkins University School of Medicine的动物设施中。实验方案由Institutional Animal Care and Use Committee of the Johns Hopkins
University,Baltimore,MD,USA检查和批准。
University,Baltimore,MD,USA检查和批准。
[0086] 细胞培养.我们从Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute(College Station)获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的小鼠成年MSC。我们在补充有
10％胎牛血清(Atlanta Biologicals)、10％马血清(Thermo Scientific)和1％青霉素-链
霉素(Mediatech)的Iscove改良的Dulbecco培养基(Invitrogen)中维持细胞(传代3-5)。我
们在6孔板中以每孔1.8×105细胞的密度培养MSC，然后使之饥饿6h，随后是如所示的TGF-β
1(R&D Systems)和TβRI抑制剂(SB-505124)(Sigma-Aldrich)处理。
10％胎牛血清(Atlanta Biologicals)、10％马血清(Thermo Scientific)和1％青霉素-链
霉素(Mediatech)的Iscove改良的Dulbecco培养基(Invitrogen)中维持细胞(传代3-5)。我
们在6孔板中以每孔1.8×105细胞的密度培养MSC，然后使之饥饿6h，随后是如所示的TGF-β
1(R&D Systems)和TβRI抑制剂(SB-505124)(Sigma-Aldrich)处理。
[0087] ELISA和蛋白质印迹法.我们通过ELISA显色试剂盒(R&D Systems)根据制造商的说明书确定条件培养基中活性TGF-β1的浓度。对来自体外培养的MSC的溶胞产物的蛋白进
行蛋白质印迹法分析。离心细胞溶胞产物并由SDS-PAGE分离上清液，并布点在聚偏氟乙烯
膜(Bio-Rad Laboratories)上。在特异性抗体中培养后，我们利用增强化学发光试剂盒
(Amersham Biosciences)检测蛋白。我们使用识别小鼠pSmad1/5(Cell Signaling
technology Inc.,1:500)、pSmad2(Cell Signaling technology Inc.,1:1000)、Smad1/5/
8(Cell Signaling technology Inc.,1:1000)和Smad2(Cell Signaling technology
Inc.,1:1000)的抗体来检查溶胞产物中的蛋白浓度。
行蛋白质印迹法分析。离心细胞溶胞产物并由SDS-PAGE分离上清液，并布点在聚偏氟乙烯
膜(Bio-Rad Laboratories)上。在特异性抗体中培养后，我们利用增强化学发光试剂盒
(Amersham Biosciences)检测蛋白。我们使用识别小鼠pSmad1/5(Cell Signaling
technology Inc.,1:500)、pSmad2(Cell Signaling technology Inc.,1:1000)、Smad1/5/
8(Cell Signaling technology Inc.,1:1000)和Smad2(Cell Signaling technology
Inc.,1:1000)的抗体来检查溶胞产物中的蛋白浓度。
[0088] 组织化学、免疫组织化学和组织形态测定.在处死时，我们切除膝关节并固定在10％缓冲的福尔马林中48小时，在10％乙二胺四乙酸(pH 7.4)中脱钙21天，并包埋在石蜡
或O.C.T.化合物(Sakura Finetek)中。处理膝关节中间室的4μm厚的矢状方向切片用于苏
木精和伊红以及番红O-固绿染色。抗酒石酸酸性磷酸酶染色利用标准方案(Sigma-
Aldrich)进行。免疫染色利用标准方案进行。我们将切片与针对小鼠巢蛋白(Aves Labs,
Inc.,1:300)、Osterix(Abcam,1:600)、骨钙素(Takara bio Inc.,1:200)、p-Smad2/3
(Santa Cruz Biotechnology Inc.,1:50)、p-Smad1/5(Abcam,1:50)、ALK1(Santa Cruz
Biotechnology Inc.,1:50)、ALK5(Abcam,1:50)、CD31(Abcam,1:100)、MMP13(Abcam,1:40)
和胶原X(Abcam,1:80)的一抗在4℃孵育过夜。对于免疫组织化学染色，辣根过氧化酶-链霉
素检测系统(Dako)随后用于检测免疫活性，随后以苏木精(Dako)复染。对于免疫荧光染色，
加入与荧光共轭的二抗并在室温培养载玻片1小时同时避光。我们对切片显微拍照以对胫
骨软骨下骨的整个区域进行组织形态测定测量(Olympus DP71)。定量组织形态测定分析用
OsteoMeasureXP软件(OsteoMetrics,Inc.)以盲式进行。为了标记矿化沉积，进行2％碳酸
氢钠溶液中1％钙黄绿素(Sigma,15mg kg-1)和3％二甲酚橙(Sigma,90mg kg-1)的连续皮下
注射。钙黄绿素和二甲酚橙分别在小鼠被处死前10天和2天注射。我们以每组每个小鼠5个
连续切片，计数了每个样本的全胫骨软骨下骨区域中阳性染色细胞的数目。我们如前所述
地计算了OARSI评分。
或O.C.T.化合物(Sakura Finetek)中。处理膝关节中间室的4μm厚的矢状方向切片用于苏
木精和伊红以及番红O-固绿染色。抗酒石酸酸性磷酸酶染色利用标准方案(Sigma-
Aldrich)进行。免疫染色利用标准方案进行。我们将切片与针对小鼠巢蛋白(Aves Labs,
Inc.,1:300)、Osterix(Abcam,1:600)、骨钙素(Takara bio Inc.,1:200)、p-Smad2/3
(Santa Cruz Biotechnology Inc.,1:50)、p-Smad1/5(Abcam,1:50)、ALK1(Santa Cruz
Biotechnology Inc.,1:50)、ALK5(Abcam,1:50)、CD31(Abcam,1:100)、MMP13(Abcam,1:40)
和胶原X(Abcam,1:80)的一抗在4℃孵育过夜。对于免疫组织化学染色，辣根过氧化酶-链霉
素检测系统(Dako)随后用于检测免疫活性，随后以苏木精(Dako)复染。对于免疫荧光染色，
加入与荧光共轭的二抗并在室温培养载玻片1小时同时避光。我们对切片显微拍照以对胫
骨软骨下骨的整个区域进行组织形态测定测量(Olympus DP71)。定量组织形态测定分析用
OsteoMeasureXP软件(OsteoMetrics,Inc.)以盲式进行。为了标记矿化沉积，进行2％碳酸
氢钠溶液中1％钙黄绿素(Sigma,15mg kg-1)和3％二甲酚橙(Sigma,90mg kg-1)的连续皮下
注射。钙黄绿素和二甲酚橙分别在小鼠被处死前10天和2天注射。我们以每组每个小鼠5个
连续切片，计数了每个样本的全胫骨软骨下骨区域中阳性染色细胞的数目。我们如前所述
地计算了OARSI评分。
[0089] 流式细胞术.我们将C57/Bl6小鼠分为3个组(每组n＝10)：假手术操作与运载体处理、ACLT与运载体处理、和ACLT与TβRI抑制剂(SB505124)处理。手术后一个月，我们处死小鼠并将来自每个组的胫骨软骨下骨髓细胞汇集在一起。将红血细胞通过商购的ACK溶解缓
冲液(Quality Biological,Inc.)溶解。离心后，将细胞团块重悬并在4％低聚甲醛中固定。
然后我们用PBS中0.1％牛血清白蛋白(BSA)洗涤细胞并计数它们。在0.1％Triton X-100中
6
透化1×10细胞/毫升，随后在冰上在3％FACS缓冲液(PBS,3％FBS,0.1％NaN3叠氮化钠)中
封闭30min。我们在暗室在37℃用Alexa Fluor 647-共轭的巢蛋白抗体(BD Pharmingen)、
抗Osterix(Abcam,1:400)或同种型对照孵育细胞1小时，然后用PBS中0.1％BSA洗涤两次。
在冰上将Osterix染色的细胞与荧光染料-共轭的二抗进一步孵育30分钟。用3％FACS缓冲
液洗涤后立即获取细胞。探针使用FACS Calibur流式细胞仪和CellQuest软件(Becton
Dickinson)分析。
冲液(Quality Biological,Inc.)溶解。离心后，将细胞团块重悬并在4％低聚甲醛中固定。
然后我们用PBS中0.1％牛血清白蛋白(BSA)洗涤细胞并计数它们。在0.1％Triton X-100中
6
透化1×10细胞/毫升，随后在冰上在3％FACS缓冲液(PBS,3％FBS,0.1％NaN3叠氮化钠)中
封闭30min。我们在暗室在37℃用Alexa Fluor 647-共轭的巢蛋白抗体(BD Pharmingen)、
抗Osterix(Abcam,1:400)或同种型对照孵育细胞1小时，然后用PBS中0.1％BSA洗涤两次。
在冰上将Osterix染色的细胞与荧光染料-共轭的二抗进一步孵育30分钟。用3％FACS缓冲
液洗涤后立即获取细胞。探针使用FACS Calibur流式细胞仪和CellQuest软件(Becton
Dickinson)分析。
[0090] 体内微-MRI.我们在水平30cm孔9.4T Bruker Biospec临床前扫描仪上进行所有MRI研究，利用定制的、对B0磁场正交放置的单旋体积线圈。麻醉用4％异氟烷开始并用2％
异氟烷/氧混合物保持。我们以2D RARE(Rapid Acquisition with Relaxation
Enhancement)顺序、TE/TR(回波时间/重复时间)＝15.17/3000ms、厚度为0.35mm的35个切
片、FOV 1.75x 1.75cm、和矩阵尺寸256x 128获得T2加权图像。我们以调整为脂肪共振频率
的化学位移选择性脂肪饱和脉冲(a chemical shift selective fat saturation pulse
tuned to the fat resonant frequency)获得T2加权图像。所有T2加权图像被加工到最终
矩阵尺寸为256x 256，等向性分辨率为0.068mm像素-1。在注射0.1ml 0.1M钆喷酸葡胺之前
和10分钟后，我们以3D梯度回波顺序(3D gradient echo sequence)获得T1加权图像，使用
300翻转角、TE/TR＝1.5/8ms、FOV 1.5x 1.5x 1.5cm、和矩阵尺寸128x 64x 64。所有T1加权图像被加工到最终矩阵尺寸为128x 128x 128，等向性分辨率为0.12mm像素-1。
异氟烷/氧混合物保持。我们以2D RARE(Rapid Acquisition with Relaxation
Enhancement)顺序、TE/TR(回波时间/重复时间)＝15.17/3000ms、厚度为0.35mm的35个切
片、FOV 1.75x 1.75cm、和矩阵尺寸256x 128获得T2加权图像。我们以调整为脂肪共振频率
的化学位移选择性脂肪饱和脉冲(a chemical shift selective fat saturation pulse
tuned to the fat resonant frequency)获得T2加权图像。所有T2加权图像被加工到最终
矩阵尺寸为256x 256，等向性分辨率为0.068mm像素-1。在注射0.1ml 0.1M钆喷酸葡胺之前
和10分钟后，我们以3D梯度回波顺序(3D gradient echo sequence)获得T1加权图像，使用
300翻转角、TE/TR＝1.5/8ms、FOV 1.5x 1.5x 1.5cm、和矩阵尺寸128x 64x 64。所有T1加权图像被加工到最终矩阵尺寸为128x 128x 128，等向性分辨率为0.12mm像素-1。
[0091] 微计算机断层扫描(μCT).我们从小鼠切割不含软组织的膝关节，在70％乙醇中固定过夜并通过高分辨率μCT(Skyscan1172)分析。我们分别使用NRecon v1.6和CTAn v1.9重
建和分析图像。三维模型可视化软件CTVol v2.0用于分析干骺端中骨小梁的参数。扫描仪
设置电压为50kVp、电流为200μA和分辨率为5.7μm/像素。胫骨软骨下骨的横截面图像用于
进行三维组织形态测定分析。我们定义感兴趣的区域为覆盖完整软骨下骨中间室，且我们
使用来自内侧胫骨平台的共10张连续图像用于3-D重建和分析。分析的三维结构参数包括：
TV：总组织容量(包含骨小梁和皮质骨二者)，BV/TV：骨小梁体积/组织容量，Tb.Th：小梁厚度，Tb.Sp：骨小梁间隔(trabecular separation)，SMI，Conn.Dn：连接性密度，和Tb.Pf：骨小梁模式因子。
建和分析图像。三维模型可视化软件CTVol v2.0用于分析干骺端中骨小梁的参数。扫描仪
设置电压为50kVp、电流为200μA和分辨率为5.7μm/像素。胫骨软骨下骨的横截面图像用于
进行三维组织形态测定分析。我们定义感兴趣的区域为覆盖完整软骨下骨中间室，且我们
使用来自内侧胫骨平台的共10张连续图像用于3-D重建和分析。分析的三维结构参数包括：
TV：总组织容量(包含骨小梁和皮质骨二者)，BV/TV：骨小梁体积/组织容量，Tb.Th：小梁厚度，Tb.Sp：骨小梁间隔(trabecular separation)，SMI，Conn.Dn：连接性密度，和Tb.Pf：骨小梁模式因子。
[0092] 基于CT的微血管造影术.我们通过microphil灌注的长骨的血管造影术对骨中的血管成像。简要地，我们安乐死动物和打开胸腔后，切断下腔静脉。我们经由插入左心室的
针头用包含肝素钠(100U mL-1)的0.9％生理盐水溶液冲洗血管系统。样本用10％中性缓冲
福尔马林加压固定。我们通过使用肝素化的盐水溶液从血管洗涤福尔马林并然后注射包含
铬酸铅的辐射透不过的硅橡胶化合物(Microfil MV-122；Flow Tech)以标记脉管系统。样
品在4℃储存过夜用于造影剂聚合。小鼠股骨从样本切下并浸泡在10％中性缓冲福尔马林
中4天以确保完全的组织固定。我们在基于甲酸的溶液(Cal-Ex II)中处理样本48h以将骨
脱钙并帮助股骨脉管系统从周围组织的图像阈值化(image thresholding)。图像使用μ
CTimaging系统(Skyscan 1172)以9-μm各向同性体元尺寸(isotropic voxel size)的分辨
率获得。最初基于阈值2D断层照片的目视判读选择阈值为60。
针头用包含肝素钠(100U mL-1)的0.9％生理盐水溶液冲洗血管系统。样本用10％中性缓冲
福尔马林加压固定。我们通过使用肝素化的盐水溶液从血管洗涤福尔马林并然后注射包含
铬酸铅的辐射透不过的硅橡胶化合物(Microfil MV-122；Flow Tech)以标记脉管系统。样
品在4℃储存过夜用于造影剂聚合。小鼠股骨从样本切下并浸泡在10％中性缓冲福尔马林
中4天以确保完全的组织固定。我们在基于甲酸的溶液(Cal-Ex II)中处理样本48h以将骨
脱钙并帮助股骨脉管系统从周围组织的图像阈值化(image thresholding)。图像使用μ
CTimaging系统(Skyscan 1172)以9-μm各向同性体元尺寸(isotropic voxel size)的分辨
率获得。最初基于阈值2D断层照片的目视判读选择阈值为60。
[0093] 步态分析.我们使用“猫道(CatWalk)”系统(Noldus)在手术前和手术后2、4、6和8周进行自动步态分析。所有实验在一天的相同时间段(1:00PM至4:00PM)期间进行并如以前
报告的分析。简要地，我们训练小鼠在ACLT或假手术操作之前每天穿过猫道走道，持续7天。
试验期间，将每只小鼠单独放置在猫道走道，猫道走道由玻璃板(100×15×0.6cm)加两个
间隔8cm的Plexiglas壁组成。允许小鼠自由步行并从走道玻璃板的一侧向另一侧横越。两
个间隔90cm的红外线光束用于检测小鼠的到达和控制数据获取的开始和结束。当房间完全
黑暗时我们进行记录，例外是来自计算机屏幕的光。来自包装的荧光灯的LED光在玻璃板内
发射并完全在内反射。当小鼠爪接触玻璃板时，光向下反射且照亮的接触区用放置在连接
于运行猫道软件v9.1(Noldus)的计算机的玻璃板下面的高速彩色摄像机记录。比较在每个
时间点每只动物的每次运行中同侧(左)和对侧的(右)后爪之间进行。配对t检验用于统计
分析。
报告的分析。简要地，我们训练小鼠在ACLT或假手术操作之前每天穿过猫道走道，持续7天。
试验期间，将每只小鼠单独放置在猫道走道，猫道走道由玻璃板(100×15×0.6cm)加两个
间隔8cm的Plexiglas壁组成。允许小鼠自由步行并从走道玻璃板的一侧向另一侧横越。两
个间隔90cm的红外线光束用于检测小鼠的到达和控制数据获取的开始和结束。当房间完全
黑暗时我们进行记录，例外是来自计算机屏幕的光。来自包装的荧光灯的LED光在玻璃板内
发射并完全在内反射。当小鼠爪接触玻璃板时，光向下反射且照亮的接触区用放置在连接
于运行猫道软件v9.1(Noldus)的计算机的玻璃板下面的高速彩色摄像机记录。比较在每个
时间点每只动物的每次运行中同侧(左)和对侧的(右)后爪之间进行。配对t检验用于统计
分析。
[0094] 统计学.数据展示为平均值±标准差。不同组之间OARSI评分、骨量和微结构的比较使用多因素方差分析(ANOVA)进行。当ANOVA检验指示主作用的总体显著性且无它们之间
的相互作用时，通过事后检验评价单独时间点和位置之间的差异。显著性水平设置在P<
0.05。所有数据分析使用SPSS 15.0分析软件(SPSS Inc)进行。
的相互作用时，通过事后检验评价单独时间点和位置之间的差异。显著性水平设置在P<
0.05。所有数据分析使用SPSS 15.0分析软件(SPSS Inc)进行。
[0095] 结果
[0096] 实施例1：软骨下骨中提高的活性TGF-β和骨吸收.为了检查骨关节炎发作时的软骨下骨改变，我们截断小鼠中的ACL以产生非稳定的骨关节炎动物模型并分析随着时间的
作用。在三维μCT分析(图1a(上图))中，ACLT小鼠中的胫骨软骨下骨体积手术后相对于假手
术操作的对照显著改变。手术后2个月时总软骨下骨组织容量(TV)比假手术对照的总软骨
下骨组织容量增加多于20％(图1b)。软骨下骨板(SBP)的厚度在手术后14至60天显著波动，
在60天时具有异常形态学(图1c)。而且，骨小梁的连接性和微结构的破坏由ACLT小鼠与假
手术操作的对照相比显著增加的骨小梁模式因子(Tb.Pf)指示(图1d)，指示未偶联的骨再
塑。软骨中的蛋白聚糖损失在手术后30天观察到并在60天时进一步恶化(图1a(中图))。值
得注意地，蛋白聚糖损失在关节软骨的深区域(deep zone)检测到(箭头)。H&E染色显示，钙
化软骨区的厚度随着潮线移动接近关节表面而增加。(图1a(下图)，双箭头线)。OARSI评分
揭示关节软骨退化在ACLT后14天开始并逐渐发展(图1e)。TRAP染色显示，软骨下骨中的破
骨细胞的数目早在手术后7天增加，且持续的破坏骨的骨吸收在30天时产生大的骨髓腔(图
1f(上图)和a(上图))。免疫染色证明，手术后，pSmad2/3+细胞的数目增加7天，保持在高浓
度直到30天且然后在60天时逐渐减少回到基线(图1f(下图))。结果说明，改变的机械负荷
引起软骨下骨吸收和软骨下骨中提高的TGF-β浓度。
作用。在三维μCT分析(图1a(上图))中，ACLT小鼠中的胫骨软骨下骨体积手术后相对于假手
术操作的对照显著改变。手术后2个月时总软骨下骨组织容量(TV)比假手术对照的总软骨
下骨组织容量增加多于20％(图1b)。软骨下骨板(SBP)的厚度在手术后14至60天显著波动，
在60天时具有异常形态学(图1c)。而且，骨小梁的连接性和微结构的破坏由ACLT小鼠与假
手术操作的对照相比显著增加的骨小梁模式因子(Tb.Pf)指示(图1d)，指示未偶联的骨再
塑。软骨中的蛋白聚糖损失在手术后30天观察到并在60天时进一步恶化(图1a(中图))。值
得注意地，蛋白聚糖损失在关节软骨的深区域(deep zone)检测到(箭头)。H&E染色显示，钙
化软骨区的厚度随着潮线移动接近关节表面而增加。(图1a(下图)，双箭头线)。OARSI评分
揭示关节软骨退化在ACLT后14天开始并逐渐发展(图1e)。TRAP染色显示，软骨下骨中的破
骨细胞的数目早在手术后7天增加，且持续的破坏骨的骨吸收在30天时产生大的骨髓腔(图
1f(上图)和a(上图))。免疫染色证明，手术后，pSmad2/3+细胞的数目增加7天，保持在高浓
度直到30天且然后在60天时逐渐减少回到基线(图1f(下图))。结果说明，改变的机械负荷
引起软骨下骨吸收和软骨下骨中提高的TGF-β浓度。
[0097] 实施例2：活性TGF-β1在骨中的表达引起骨关节炎.在卡-恩二氏病(CED)中，TGF-β1由于TGFB1基因中的点活化突变在分泌后被活化，且有趣地，患有CED的人群易于发展骨关
节炎。为了检查软骨下骨中活性TGF-β1的高浓度是否引发骨关节炎，我们使用CED活化突变
小鼠模型，其中TGF-β1在软骨下骨髓中在分泌后被成骨细胞活化。胫骨软骨下骨的横截面、冠状和矢状视图的三维μCT图像显示CED小鼠中的骨量相对于其野生型同窝不均匀分布，指
示受损的骨形成(图2a)。类似于ACLT小鼠模型，相对于其野生型同窝，CED小鼠中胫骨软骨
下骨TV和Tb.Pf增加而SBP的厚度减少。值得注意地，显著的蛋白聚糖损失在邻近软骨下板
的钙化软骨区域检测到(图2b(上图))。钙化软骨层的厚度显著增加而透明软骨层减少，伴
随明显的细胞过少(图2b(下图))。OARSI评分揭示了相对于其年龄匹配的同窝，CED小鼠中
关节软骨的显著退化(图2c)。
节炎。为了检查软骨下骨中活性TGF-β1的高浓度是否引发骨关节炎，我们使用CED活化突变
小鼠模型，其中TGF-β1在软骨下骨髓中在分泌后被成骨细胞活化。胫骨软骨下骨的横截面、冠状和矢状视图的三维μCT图像显示CED小鼠中的骨量相对于其野生型同窝不均匀分布，指
示受损的骨形成(图2a)。类似于ACLT小鼠模型，相对于其野生型同窝，CED小鼠中胫骨软骨
下骨TV和Tb.Pf增加而SBP的厚度减少。值得注意地，显著的蛋白聚糖损失在邻近软骨下板
的钙化软骨区域检测到(图2b(上图))。钙化软骨层的厚度显著增加而透明软骨层减少，伴
随明显的细胞过少(图2b(下图))。OARSI评分揭示了相对于其年龄匹配的同窝，CED小鼠中
关节软骨的显著退化(图2c)。
[0098] 我们还使用microfil对比增强血管造影术测量了这些小鼠中的血管发生，因为其是骨关节的病理学表现炎。相对于其野生型同窝，CED小鼠中软骨下骨中血管的体积比例和
数目显著增加(图2d)。一致地，CD31+内皮祖细胞的数目也增加(图2e)。对主要在成人骨髓
MSC中表达的巢蛋白的免疫染色，揭示与野生型对照相比，CED小鼠的软骨下骨髓中巢蛋白+
细胞的显著更高数目(图2f)。定型为成骨细胞谱系后，MSC表达osterix，osterix是骨原细
胞的一种标志物。相比于野生型对照，软骨下骨髓中osterix+骨原细胞的数目也显著增加
(图2f)，指示巢蛋白+MSC经历成骨细胞分化用于从头骨形成。此外，我们还测量了在骨关节
炎的不同阶段，人类膝关节的软骨下骨中的活性TGF-β1。ELISA分析显示，人类骨关节炎膝
关节的软骨下骨中活性TGF-β1的浓度比健康对照显著更高(图2g)。总之，CED小鼠中膝关节
骨关节炎表型的发展与在ACLT小鼠模型中观察到的相似，揭示，活性TGF-β1的高浓度引起
的异常软骨下骨形成可以有助于关节软骨的退化。
数目显著增加(图2d)。一致地，CD31+内皮祖细胞的数目也增加(图2e)。对主要在成人骨髓
MSC中表达的巢蛋白的免疫染色，揭示与野生型对照相比，CED小鼠的软骨下骨髓中巢蛋白+
细胞的显著更高数目(图2f)。定型为成骨细胞谱系后，MSC表达osterix，osterix是骨原细
胞的一种标志物。相比于野生型对照，软骨下骨髓中osterix+骨原细胞的数目也显著增加
(图2f)，指示巢蛋白+MSC经历成骨细胞分化用于从头骨形成。此外，我们还测量了在骨关节
炎的不同阶段，人类膝关节的软骨下骨中的活性TGF-β1。ELISA分析显示，人类骨关节炎膝
关节的软骨下骨中活性TGF-β1的浓度比健康对照显著更高(图2g)。总之，CED小鼠中膝关节
骨关节炎表型的发展与在ACLT小鼠模型中观察到的相似，揭示，活性TGF-β1的高浓度引起
的异常软骨下骨形成可以有助于关节软骨的退化。
[0099] 实施例3软骨下骨TGF-β抑制减弱软骨退化.我们接着检查了TGF-β活性的抑制对ACLT关节的作用。TβRI抑制剂(SB505124)的注射已经显示挽救活性TGF-β1的高浓度引起的
未偶联的骨形成。我们用ACLT小鼠筛选TβRI抑制剂的不同剂量以鉴定最佳剂量(图9)。TβRI抑制剂的低浓度(0.1或0.5mg kg-1)对软骨下骨具有极小作用，而开始于1mg kg-1的较高浓
度改进软骨下骨结构(图3a)。相反，关节软骨中的蛋白聚糖损失在较高浓度(2.5或5mg kg
-1)被诱导(图9a)。注意，较高剂量抑制剂引起的蛋白聚糖损失主要在关节软骨的浅表至中
间区域观察到(图9a)。以1mg kg-1TβRI抑制剂改进小梁连接性和微结构通过软骨下骨TV的
正常化(图3b)、SBP厚度的保持(图3c)和Tb.Pf的体积减少(图3d)来证明。值得注意地，ACLT
小鼠中关节软骨的蛋白聚糖损失和钙化在手术后2个月减弱，这是通常用于分析非稳定的
骨关节炎小鼠模型的时间点(图3e)。相比于运载体处理的ACLT小鼠，TβRI抑制剂对TβRI抑
制剂处理的ACLT小鼠中关节软骨的保护作用使用OARSI系统定量(图3f)。相比于运载体处
理的ACLT组，抑制剂对软骨细胞中MMP13或X型胶原提高的浓度不具有显著作用(图3g,h)。
未偶联的骨形成。我们用ACLT小鼠筛选TβRI抑制剂的不同剂量以鉴定最佳剂量(图9)。TβRI抑制剂的低浓度(0.1或0.5mg kg-1)对软骨下骨具有极小作用，而开始于1mg kg-1的较高浓
度改进软骨下骨结构(图3a)。相反，关节软骨中的蛋白聚糖损失在较高浓度(2.5或5mg kg
-1)被诱导(图9a)。注意，较高剂量抑制剂引起的蛋白聚糖损失主要在关节软骨的浅表至中
间区域观察到(图9a)。以1mg kg-1TβRI抑制剂改进小梁连接性和微结构通过软骨下骨TV的
正常化(图3b)、SBP厚度的保持(图3c)和Tb.Pf的体积减少(图3d)来证明。值得注意地，ACLT
小鼠中关节软骨的蛋白聚糖损失和钙化在手术后2个月减弱，这是通常用于分析非稳定的
骨关节炎小鼠模型的时间点(图3e)。相比于运载体处理的ACLT小鼠，TβRI抑制剂对TβRI抑
制剂处理的ACLT小鼠中关节软骨的保护作用使用OARSI系统定量(图3f)。相比于运载体处
理的ACLT组，抑制剂对软骨细胞中MMP13或X型胶原提高的浓度不具有显著作用(图3g,h)。
[0100] 在9月龄的ACLT小鼠中观察到相似的结果。在用1mg kg-1TβRI抑制剂处理的年老ACLT小鼠中，软骨下骨结构被改进且关节软骨退化被减弱(图12)。而且，用猫道系统的步态
分析揭示手术后两个月两个后爪的最大接触时间百分比(Maxcontactat％)之间的显著不
一致，这在抑制剂处理的ACLT组中被拯救(图3i)。总之，结果指示，TGF-β在软骨下骨和关节软骨中起不同的作用，且软骨下骨中TGF-β活性的抑制可阻止骨关节炎发展期间关节软骨
的退化。
分析揭示手术后两个月两个后爪的最大接触时间百分比(Maxcontactat％)之间的显著不
一致，这在抑制剂处理的ACLT组中被拯救(图3i)。总之，结果指示，TGF-β在软骨下骨和关节软骨中起不同的作用，且软骨下骨中TGF-β活性的抑制可阻止骨关节炎发展期间关节软骨
的退化。
[0101] 实施例4：MSC簇的增加导致软骨下骨髓中的类骨质岛.为了检查细胞机制，我们分析TβRI抑制剂对软骨下骨中MSC的作用。我们通过免疫染色发现，相比于假手术对照，ACLT
小鼠中手术后30天时软骨下骨髓中巢蛋白+MSC的数目显著增加(图4a)。这一作用被TβRI抑
制剂阻止(图4a)。类似地，osterix+骨原细胞主要位于假手术对照的骨表面上(图4a)且在
运载体处理的ACLT组中在骨髓中检测到的骨原细胞簇的显著增加的数目被TβRI抑制剂处
理减弱(图4a)。这些结果在来自软骨下骨的巢蛋白+MSC和osterix+骨原细胞的流式细胞术
分析中证实(图4c)。骨钙素+成骨细胞和作为岛的类骨质在ACLT软骨下骨的骨髓中被观察
+
到。注射TβRI抑制剂减少类骨质岛的异常局部化，因为骨钙素成骨细胞和类骨质主要发现
于骨表面上，类似于其在假手术对照中的定位(图4b)。在荧光双重标记实验中，相比于运载
体处理组，类骨质岛的形成被TβRI抑制剂减少(图4d)。
小鼠中手术后30天时软骨下骨髓中巢蛋白+MSC的数目显著增加(图4a)。这一作用被TβRI抑
制剂阻止(图4a)。类似地，osterix+骨原细胞主要位于假手术对照的骨表面上(图4a)且在
运载体处理的ACLT组中在骨髓中检测到的骨原细胞簇的显著增加的数目被TβRI抑制剂处
理减弱(图4a)。这些结果在来自软骨下骨的巢蛋白+MSC和osterix+骨原细胞的流式细胞术
分析中证实(图4c)。骨钙素+成骨细胞和作为岛的类骨质在ACLT软骨下骨的骨髓中被观察
+
到。注射TβRI抑制剂减少类骨质岛的异常局部化，因为骨钙素成骨细胞和类骨质主要发现
于骨表面上，类似于其在假手术对照中的定位(图4b)。在荧光双重标记实验中，相比于运载
体处理组，类骨质岛的形成被TβRI抑制剂减少(图4d)。
[0102] 内皮祖细胞中Smad1的磷酸化可被TGF-β1活化。我们检查TGF-β1是否活化MSC中Smad1的磷酸化。我们发现，TGF-β1在低浓度刺激Smad2/3和Smad1/5/8二者的磷酸化，但磷
酸化的Smad1/5/8的最大增加在更高剂量的TGF-β1(5ng ml-1)实现(图4e)。软骨下骨的免疫
染色显示，相对于假手术对照，TβRI抑制剂处理的ACLT小鼠中pSmad1+细胞的数目保持相对
稳定。(图4f)。与之相比，pSmad2/3+细胞在ACLT小鼠中大大增加且该增加被TβRI抑制剂处
理阻止(图4f)，说明，Smad2/3的磷酸化是软骨下骨MSC中TGF-β的主要下游信号。一致地，相对于假手操作的对照小鼠，以运载体或抑制剂处理的ACLT小鼠中ALK1的表达水平保持不
变，而ALK5的表达在ACLT小鼠中相对于对照小鼠显著增加，且该增加因注射TβRI抑制剂被
抑制(图4f)。ACLT小鼠的软骨下骨中CD31+内皮祖先相对于假手术对照显著增加，其通过注
射TβRI抑制剂减少。(图4g)。软骨下骨的Microfil对比增强血管造影术证实，抑制剂减少血管发生(图4h)。在MRI灌注分析中，ACLT后1个月时运载体处理的小鼠中的对比信号显著增
加，且该增加在抑制剂处理的组中被阻止，指示减少新血管形成(图4i)。通过micro-MRI检
测的胫骨软骨下骨中的骨髓损伤在ACLT-抑制剂处理的小鼠中相比于ACLT-运载体处理的
小鼠中尺寸也明显较小(图4j)，说明骨髓损伤与类骨质岛关联。这些结果指示，活性TGF-β
的高浓度增加巢蛋白+MSC的数目，导致软骨下骨髓中类骨质岛和血管发生，代表ACLT后软
骨下骨的病理学改变。
酸化的Smad1/5/8的最大增加在更高剂量的TGF-β1(5ng ml-1)实现(图4e)。软骨下骨的免疫
染色显示，相对于假手术对照，TβRI抑制剂处理的ACLT小鼠中pSmad1+细胞的数目保持相对
稳定。(图4f)。与之相比，pSmad2/3+细胞在ACLT小鼠中大大增加且该增加被TβRI抑制剂处
理阻止(图4f)，说明，Smad2/3的磷酸化是软骨下骨MSC中TGF-β的主要下游信号。一致地，相对于假手操作的对照小鼠，以运载体或抑制剂处理的ACLT小鼠中ALK1的表达水平保持不
变，而ALK5的表达在ACLT小鼠中相对于对照小鼠显著增加，且该增加因注射TβRI抑制剂被
抑制(图4f)。ACLT小鼠的软骨下骨中CD31+内皮祖先相对于假手术对照显著增加，其通过注
射TβRI抑制剂减少。(图4g)。软骨下骨的Microfil对比增强血管造影术证实，抑制剂减少血管发生(图4h)。在MRI灌注分析中，ACLT后1个月时运载体处理的小鼠中的对比信号显著增
加，且该增加在抑制剂处理的组中被阻止，指示减少新血管形成(图4i)。通过micro-MRI检
测的胫骨软骨下骨中的骨髓损伤在ACLT-抑制剂处理的小鼠中相比于ACLT-运载体处理的
小鼠中尺寸也明显较小(图4j)，说明骨髓损伤与类骨质岛关联。这些结果指示，活性TGF-β
的高浓度增加巢蛋白+MSC的数目，导致软骨下骨髓中类骨质岛和血管发生，代表ACLT后软
骨下骨的病理学改变。
[0103] 实施例5：中和软骨下TGF-β减少骨关节炎严重度.为了验证在骨关节炎发作时TGF-β在软骨下骨中的作用，我们直接在大鼠ACLT关节的胫骨软骨下骨中植入藻酸盐/酯珠
中的TGF-β抗体(1D11)。手术后3个月收获膝关节。类似于TβRI抑制剂的系统应用，局部应用抗体相比于运载体-处理的ACLT大鼠改善了骨的微结构(图5a-d)。大鼠ACLT关节的骨髓腔
中osterix+祖先簇的数目在抗体处理的大鼠中相比于运载体处理的大鼠显著减少(图5e)。
值得注意地，关节软骨的退化通过在软骨下骨中施用抗体被减弱，如OARSI评分反映的(图
5f(上图),g)。而且，MMP13+和X型胶原+软骨细胞的百分比显著减少，指示从关节软骨退化的保护(图5f)。与之相比，MMP13和ColX表达未被系统注射TβRI抑制剂显著减少(图3g,h)，因
为TGF-β是关节软骨的内稳态必需的。因此，在软骨下骨中特异性施用TGF-β抗体减少异常
的骨形成，但不抑制关节软骨中的TGF-β信号传导。我们的大鼠骨关节炎模型中对关节软骨
的保护作用主要是经由通过部位特异性施用TGF-β抗体改善软骨下骨。结果进一步证实，
TGF-β在软骨下骨中的作用不同于其在关节软骨中的作用；软骨下骨中活性TGF-β1的高浓
度引起异常骨形成，导致骨关节炎的发展。
中的TGF-β抗体(1D11)。手术后3个月收获膝关节。类似于TβRI抑制剂的系统应用，局部应用抗体相比于运载体-处理的ACLT大鼠改善了骨的微结构(图5a-d)。大鼠ACLT关节的骨髓腔
中osterix+祖先簇的数目在抗体处理的大鼠中相比于运载体处理的大鼠显著减少(图5e)。
值得注意地，关节软骨的退化通过在软骨下骨中施用抗体被减弱，如OARSI评分反映的(图
5f(上图),g)。而且，MMP13+和X型胶原+软骨细胞的百分比显著减少，指示从关节软骨退化的保护(图5f)。与之相比，MMP13和ColX表达未被系统注射TβRI抑制剂显著减少(图3g,h)，因
为TGF-β是关节软骨的内稳态必需的。因此，在软骨下骨中特异性施用TGF-β抗体减少异常
的骨形成，但不抑制关节软骨中的TGF-β信号传导。我们的大鼠骨关节炎模型中对关节软骨
的保护作用主要是经由通过部位特异性施用TGF-β抗体改善软骨下骨。结果进一步证实，
TGF-β在软骨下骨中的作用不同于其在关节软骨中的作用；软骨下骨中活性TGF-β1的高浓
度引起异常骨形成，导致骨关节炎的发展。
[0104] 实施例6：敲除MSC中的TGFBR2减少骨关节炎严重度.TGF-β结合TGF-βII型受体(TβRII)与TβRI的复合体以诱导下游Smad2/3的磷酸化。TGFBR2的缺失确保TGF-β信号传导级联
的封闭。我们诱导了ACLT小鼠的巢蛋白+MSC中TGFBR2的敲除以证实MSC中的TGF-β信号传导
在骨关节炎发作时的关键作用。对巢蛋白-CreTMER::TβRIIfl/f小鼠注射他莫昔芬以缺失非
响应于TGF-β的巢蛋白MSC中的TGFBR2(TβRII-/-)，而其他细胞类型包括软骨细胞中的TGF-β信号传导途径保持完整(图13)。类似于TβRI抑制剂处理的那些，手术后2个月ACLT TβRII-/-小鼠中的微结构和Tb.Pf相对于ACLT野生型同窝显著改进(图6a)。类似于ACLT野生型同窝，
+ TM
软骨下骨中的Osterix 骨原细胞保持主要在骨表面上(图6b)。而且，巢蛋白-Cre ER::
Rosa26LacZfl/fl小鼠的软骨下骨中β-gal和骨钙素的共染色揭示，β-gal+MSC谱系细胞在运载体处理的ACLT小鼠的骨髓中检测到，而β-gal+细胞主要分布在骨表面上，在假手术对照
和TβRI抑制剂处理的ACLT小鼠中是骨钙素+(图6c)。关节软骨中的蛋白聚糖损失在ACLT Tβ
-/-
RII 小鼠中被减少(图6d(上图))。关节软骨的钙化也被减弱，且钙化软骨的厚度相对于
ACLT野生型小鼠保持不变(图6d(下图))。免疫染色证明，MMP13的浓度和X型胶原表达在
ACLT TβRII-/-小鼠中相对于其ACLT野生型同窝被显著抑制，指示关节软骨退化的抑制(图
6g)。ACLT TβRII-/-小鼠中对关节软骨的保护作用反映在OARSI评分中(图6e)。野生型ACLT
小鼠中两个后爪的最大接触时间百分比(Maxcontactat％)之间的不一致在其ACLT Tβ
RII-/-同窝中不发生，如步态分析揭示的(图6f)。如此，这一数据进一步证明，TGF-β的高浓度起始软骨下骨MSC中的病理学改变，有助于骨关节炎的发作。
的封闭。我们诱导了ACLT小鼠的巢蛋白+MSC中TGFBR2的敲除以证实MSC中的TGF-β信号传导
在骨关节炎发作时的关键作用。对巢蛋白-CreTMER::TβRIIfl/f小鼠注射他莫昔芬以缺失非
响应于TGF-β的巢蛋白MSC中的TGFBR2(TβRII-/-)，而其他细胞类型包括软骨细胞中的TGF-β信号传导途径保持完整(图13)。类似于TβRI抑制剂处理的那些，手术后2个月ACLT TβRII-/-小鼠中的微结构和Tb.Pf相对于ACLT野生型同窝显著改进(图6a)。类似于ACLT野生型同窝，
+ TM
软骨下骨中的Osterix 骨原细胞保持主要在骨表面上(图6b)。而且，巢蛋白-Cre ER::
Rosa26LacZfl/fl小鼠的软骨下骨中β-gal和骨钙素的共染色揭示，β-gal+MSC谱系细胞在运载体处理的ACLT小鼠的骨髓中检测到，而β-gal+细胞主要分布在骨表面上，在假手术对照
和TβRI抑制剂处理的ACLT小鼠中是骨钙素+(图6c)。关节软骨中的蛋白聚糖损失在ACLT Tβ
-/-
RII 小鼠中被减少(图6d(上图))。关节软骨的钙化也被减弱，且钙化软骨的厚度相对于
ACLT野生型小鼠保持不变(图6d(下图))。免疫染色证明，MMP13的浓度和X型胶原表达在
ACLT TβRII-/-小鼠中相对于其ACLT野生型同窝被显著抑制，指示关节软骨退化的抑制(图
6g)。ACLT TβRII-/-小鼠中对关节软骨的保护作用反映在OARSI评分中(图6e)。野生型ACLT
小鼠中两个后爪的最大接触时间百分比(Maxcontactat％)之间的不一致在其ACLT Tβ
RII-/-同窝中不发生，如步态分析揭示的(图6f)。如此，这一数据进一步证明，TGF-β的高浓度起始软骨下骨MSC中的病理学改变，有助于骨关节炎的发作。
[0105] 实施例7：软骨下骨髓中的类骨质岛可通过MRI T1-加权图像可视化，因为骨髓损伤是关节退化的生物标志物.关节疼痛和软骨下骨髓损伤或水肿是关节退化的早期症状。
目前，关于软骨下骨的改变与疼痛和关节软骨退化的发展的关系是未知的，且不存在阻止
关节退化的有效的疾病缓和治疗。
目前，关于软骨下骨的改变与疼痛和关节软骨退化的发展的关系是未知的，且不存在阻止
关节退化的有效的疾病缓和治疗。
[0106] 越来越多的证据说明，软骨下骨和关节软骨作为关节中的功能单位起作用。在骨软骨连接处和软骨下骨中的改变与MRI下可视的关节退化的早期迹象诸如骨髓损伤或水
肿、软骨下板和钙化软骨区域的增加的厚度相关。然而，软骨下骨髓损伤的病理学形成是不
清楚的。我们已经显示，TGF-β1在破坏骨的骨吸收期间被活化，并诱导骨髓间质干细胞
(MSC)向用于新骨形成的吸收陷窝的迁移，用作偶联因子。成骨细胞中活性TGFβ1的转基因
表达导致未偶联的骨再塑与异常骨形成。更重要地，我们已经显示，软骨下骨中活性TGFβ1
的高水平起始软骨下骨髓中的类骨质岛，导致不同OA动物模型中关节软骨的钙化。我们的
数据揭示，类骨质岛的形成与软骨下骨髓损伤相关，已知软骨下骨髓损伤导致关节退化期
间的关节软骨损失和疼痛。因此，软骨下骨髓中类骨质岛的形成是退化关节软骨的开始。
肿、软骨下板和钙化软骨区域的增加的厚度相关。然而，软骨下骨髓损伤的病理学形成是不
清楚的。我们已经显示，TGF-β1在破坏骨的骨吸收期间被活化，并诱导骨髓间质干细胞
(MSC)向用于新骨形成的吸收陷窝的迁移，用作偶联因子。成骨细胞中活性TGFβ1的转基因
表达导致未偶联的骨再塑与异常骨形成。更重要地，我们已经显示，软骨下骨中活性TGFβ1
的高水平起始软骨下骨髓中的类骨质岛，导致不同OA动物模型中关节软骨的钙化。我们的
数据揭示，类骨质岛的形成与软骨下骨髓损伤相关，已知软骨下骨髓损伤导致关节退化期
间的关节软骨损失和疼痛。因此，软骨下骨髓中类骨质岛的形成是退化关节软骨的开始。
[0107] 具体地，我们通过免疫染色发现，软骨下骨髓中的巢蛋白+MSC的数目在手术后30天在ACLT小鼠中相比于假手术对照显著增加(图15a)。这一作用被TβRI抑制剂阻止(图
15a)。类似地，假手术对照中osterix+骨原细胞主要位于骨表面上，且运载体处理的ACLT组
中的骨髓中检测到的骨原细胞簇的显著增加的数目被TβRI抑制剂处理减弱(图15a)。这些
结果在来自软骨下骨的巢蛋白+MSC和osterix+骨原细胞的流式细胞术分析中证实(图15c)。
骨钙素+成骨细胞和类骨质在软骨下骨髓中作为骨髓损伤被观察到(图15h)。注射TβRI抑制
剂减少异常局部化，因为骨钙素+成骨细胞和类骨质主要发现于骨表面上，类似于它们在假
手术对照中的定位(图15b)。在荧光双重标记实验中，软骨下骨髓中的这些类骨质岛导致未
偶联的骨形成，相比于运载体处理的组，其被TβRI抑制剂拯救(图15d)。
15a)。类似地，假手术对照中osterix+骨原细胞主要位于骨表面上，且运载体处理的ACLT组
中的骨髓中检测到的骨原细胞簇的显著增加的数目被TβRI抑制剂处理减弱(图15a)。这些
结果在来自软骨下骨的巢蛋白+MSC和osterix+骨原细胞的流式细胞术分析中证实(图15c)。
骨钙素+成骨细胞和类骨质在软骨下骨髓中作为骨髓损伤被观察到(图15h)。注射TβRI抑制
剂减少异常局部化，因为骨钙素+成骨细胞和类骨质主要发现于骨表面上，类似于它们在假
手术对照中的定位(图15b)。在荧光双重标记实验中，软骨下骨髓中的这些类骨质岛导致未
偶联的骨形成，相比于运载体处理的组，其被TβRI抑制剂拯救(图15d)。
[0108] ACLT小鼠的软骨下骨中的CD31+内皮祖先相对于假手术对照显著增加，其被注射TβRI抑制剂减少。(图15e)。软骨下骨的Microfil对比增强血管造影术证实，抑制剂减少血管发生(图15f)。在MRI灌注分析中，ACLT后1个月时运载体处理的小鼠中的对比信号显著增
加，且该增加在抑制剂处理的组中被阻止，指示减少新血管形成(图15f)。通过micro-MRI检
测的胫骨软骨下骨中的骨髓损伤在ACLT-抑制剂处理的小鼠中相比于ACLT-运载体处理的
小鼠中尺寸也明显较小(图15h)。这些结果指示，活性TGF-β的高浓度增加巢蛋白+MSC的数
目，导致软骨下骨髓中类骨质岛形成和血管发生，代表ACLT后软骨下骨的病理学改变。
Dunkin Hartley豚鼠发展自发性骨关节炎。我们观察到膝关节中的软骨下骨髓骨损伤。当
对豚鼠注射TGFβI型受体抑制剂3个月时，骨髓损伤显著减少(图16)。总之，软骨下骨髓中的类骨质岛与由MRI可视的损伤相关，其可被TGFβI型受体抑制剂抑制。
加，且该增加在抑制剂处理的组中被阻止，指示减少新血管形成(图15f)。通过micro-MRI检
测的胫骨软骨下骨中的骨髓损伤在ACLT-抑制剂处理的小鼠中相比于ACLT-运载体处理的
小鼠中尺寸也明显较小(图15h)。这些结果指示，活性TGF-β的高浓度增加巢蛋白+MSC的数
目，导致软骨下骨髓中类骨质岛形成和血管发生，代表ACLT后软骨下骨的病理学改变。
Dunkin Hartley豚鼠发展自发性骨关节炎。我们观察到膝关节中的软骨下骨髓骨损伤。当
对豚鼠注射TGFβI型受体抑制剂3个月时，骨髓损伤显著减少(图16)。总之，软骨下骨髓中的类骨质岛与由MRI可视的损伤相关，其可被TGFβI型受体抑制剂抑制。
[0109] 讨论
[0110] 已知TGF-β对关节软骨内稳态的合成作用，通过刺激细胞外基质蛋白的产生和阻止软骨细胞的终末分化。在这一研究中，我们发现，ACLT动物模型中，关节上机械负荷的改
变早在手术后7天增加软骨下骨中破骨细胞的数目。TGF-β1的高浓度在破骨细胞骨吸收期
间被活化，以募集巢蛋白+MSC用于随后的未偶联的骨形成。值得注意地，破坏骨的骨吸收与
TGFβ1引起的巢蛋白+MSC的募集在时空上未偶联并导致异常骨形成，其由CED小鼠中骨关节
炎样改变的发展进一步证实。相对于小鼠ACLT模型中未偶联的相继骨吸收和形成的单阶
段，人类骨关节炎表现更复杂，具有多个阶段。分析来自经历膝关节置换的晚期骨关节炎受
试者的样本时，我们发现关节软骨的一些区域仍然完整或处在骨关节炎发展的中间阶段。
一致地，骨关节炎样本中软骨下板的厚度是不均匀的，而软骨下板的分布百分比一般变得
更厚(图7)。而且，软骨下骨与关节软骨中活性TGF-β的浓度与健康对照相比更高。观察结果说明，软骨下骨中TGF-β活性的抑制仍然可具有治疗效果，即使患有骨关节炎的个体并非处
在早期阶段。我们的发现揭示，TGF-β在软骨下骨中起到不同作用，与其对关节软骨的合成
作用相对。如此，软骨下骨中提高的TGF-β1浓度的定位触发事件的级联，导致骨关节炎的发展。
变早在手术后7天增加软骨下骨中破骨细胞的数目。TGF-β1的高浓度在破骨细胞骨吸收期
间被活化，以募集巢蛋白+MSC用于随后的未偶联的骨形成。值得注意地，破坏骨的骨吸收与
TGFβ1引起的巢蛋白+MSC的募集在时空上未偶联并导致异常骨形成，其由CED小鼠中骨关节
炎样改变的发展进一步证实。相对于小鼠ACLT模型中未偶联的相继骨吸收和形成的单阶
段，人类骨关节炎表现更复杂，具有多个阶段。分析来自经历膝关节置换的晚期骨关节炎受
试者的样本时，我们发现关节软骨的一些区域仍然完整或处在骨关节炎发展的中间阶段。
一致地，骨关节炎样本中软骨下板的厚度是不均匀的，而软骨下板的分布百分比一般变得
更厚(图7)。而且，软骨下骨与关节软骨中活性TGF-β的浓度与健康对照相比更高。观察结果说明，软骨下骨中TGF-β活性的抑制仍然可具有治疗效果，即使患有骨关节炎的个体并非处
在早期阶段。我们的发现揭示，TGF-β在软骨下骨中起到不同作用，与其对关节软骨的合成
作用相对。如此，软骨下骨中提高的TGF-β1浓度的定位触发事件的级联，导致骨关节炎的发展。
[0111] 临床和动物研究都报告，骨关节炎的发展伴有间质祖细胞在关节组织和滑液中的聚集。骨髓损伤已被鉴定为骨关节炎发展的预后因素，因为发现其定居于软骨破坏的位置。
我们观察到，在多种骨关节炎动物模型中，TGF-β1浓度升高导致软骨下骨髓中增加数目的
+
巢蛋白MSC。在正常再塑过程期间，成骨细胞和其祖先主要在骨表面上的吸收部位观察到。
然而，异常机械负荷引起的改变的微环境可导致骨髓腔中骨原细胞的“原处”定型。骨髓损
伤已被表征为较差矿化的新形成骨。这些成簇的骨髓骨原细胞可导致软骨下骨髓中的类骨
质岛，其是在MRI下作为骨髓损伤可视的。而且，巢蛋白+MSC中TGFBR2的敲除减弱了ACLT小
鼠中骨关节炎的发展。这一结果进一步证实我们的假设：MSC是骨关节炎发展期间异常TGF-
β信号的靶细胞。另外，骨形成通常与血管发生偶联在一起。已知内皮祖细胞中的TGF-β信号传导途径可促进血管发生且TGF-β可刺激MSC中的旁分泌机制，其进一步促进血管发生。我
们的数据揭示，通过microphil灌注实验的血管造影术中，ACLT和CED小鼠二者的软骨下骨
中血管增加。通过抑制TGF-β活性减少的血管发生可进一步减弱ACLT小鼠的骨关节炎关节
中软骨下骨的从新骨形成。
我们观察到，在多种骨关节炎动物模型中，TGF-β1浓度升高导致软骨下骨髓中增加数目的
+
巢蛋白MSC。在正常再塑过程期间，成骨细胞和其祖先主要在骨表面上的吸收部位观察到。
然而，异常机械负荷引起的改变的微环境可导致骨髓腔中骨原细胞的“原处”定型。骨髓损
伤已被表征为较差矿化的新形成骨。这些成簇的骨髓骨原细胞可导致软骨下骨髓中的类骨
质岛，其是在MRI下作为骨髓损伤可视的。而且，巢蛋白+MSC中TGFBR2的敲除减弱了ACLT小
鼠中骨关节炎的发展。这一结果进一步证实我们的假设：MSC是骨关节炎发展期间异常TGF-
β信号的靶细胞。另外，骨形成通常与血管发生偶联在一起。已知内皮祖细胞中的TGF-β信号传导途径可促进血管发生且TGF-β可刺激MSC中的旁分泌机制，其进一步促进血管发生。我
们的数据揭示，通过microphil灌注实验的血管造影术中，ACLT和CED小鼠二者的软骨下骨
中血管增加。通过抑制TGF-β活性减少的血管发生可进一步减弱ACLT小鼠的骨关节炎关节
中软骨下骨的从新骨形成。
[0112] 软骨下骨和关节软骨作为关节中的功能单位起作用。在人类骨关节炎关节中，软骨下板相对于健康受试者变得显著更厚。ACLT动物模型中软骨下骨在手术后被塑造且其厚
度显著波动。软骨细胞调整其功能状态以响应于机械负荷的改变的能力相比于相邻的软骨
下骨是相对有限的。因此骨软骨连接的改变可能参与钙化软骨区域的推进。关节软骨经由
异常软骨下骨改变的退化的准确基制仍不清楚。在我们建立的人类膝关节模拟模型中，软
骨下骨的扩张和增加的刚性(图14)改变了关节软骨应力的分布。因此，TGF-β引起的异常骨
形成可有助于软骨下骨的机械特性的改变并起始其扩张，导致关节软骨退化。
度显著波动。软骨细胞调整其功能状态以响应于机械负荷的改变的能力相比于相邻的软骨
下骨是相对有限的。因此骨软骨连接的改变可能参与钙化软骨区域的推进。关节软骨经由
异常软骨下骨改变的退化的准确基制仍不清楚。在我们建立的人类膝关节模拟模型中，软
骨下骨的扩张和增加的刚性(图14)改变了关节软骨应力的分布。因此，TGF-β引起的异常骨
形成可有助于软骨下骨的机械特性的改变并起始其扩张，导致关节软骨退化。