用于连接和释放遗传物质，特别是DNA/RNA，的新型聚乙烯亚胺-基共聚物及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种共聚物，所述共聚物是根据通式I的化合物，可以低成本并且耗时短地来制备所述共聚物，所述共聚物是根据需要特制的，并且对于对于广泛有效的用途具有高官能性，而不限制它们对遗传物质(特别是DNA/RNA)的粘合力。所述新型共聚物是通过通式III的合成来制备的。

权利要求

1.用于连接和释放遗传物质的聚乙烯亚胺-基共聚物，所述聚乙烯亚胺-基共聚物由乙烯亚胺单元和2-噁唑啉单元构成，以通式I的化合物代表：其中，

a、b：各单体单元的比例，a、b>0，d：侧链的长度，1-20，

X：双键或三键，

共聚物链长为2-1000000个单元。

2.用于连接和释放遗传物质的聚乙烯亚胺-基共聚物，其中所述共聚物具有根据通式II的不同的噁唑啉单元：其中，

a、b、c：各单体单元的比例，a、b、c>0，d：侧链的长度，1-20，

X：双键或三键，

R：H或有机基团，

共聚物链长为2-1000000个单元。

3.根据权利要求1或2所述的聚乙烯亚胺-基共聚物，其中所述遗传物质是DNA/RNA。

4.制备用于连接和释放遗传物质的聚乙烯亚胺-基共聚物的方法，所述聚乙烯亚胺-基共聚物由乙烯亚胺单元和2-噁唑啉单元构成，其特征在于通式III的合成：

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述遗传物质是DNA/RNA。

6.根据权利要求4所述的方法，其中在-OH或-NHS作为酸的情况下，在活化剂的存在下引入官能化。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述活化剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC或二环己基碳二亚胺DCC。

8.根据权利要求4所述的方法，其中通过采用不饱和酸酐 或酰卤进行在后官能化来引入功能性侧链。

9.根据权利要求1或2所述的聚乙烯亚胺-基共聚物的用途，所述聚乙烯亚胺-基共聚物用于将基底表面官能化，从而连接和释放遗传物质。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述基底是珠粒和颗粒。

11.根据权利要求1或2所述的聚乙烯亚胺-基共聚物的用途，所述聚乙烯亚胺-基共聚物用于制备结构化水凝胶层或用作结构化水凝胶层的组分，从而连接和释放遗传物质。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述结构化水凝胶层是珠粒和颗粒。

说明书

用于连接和释放遗传物质，特别是DNA/RNA，的新型聚乙烯亚

胺-基共聚物及其制备方法和用途

[0001] 本发明涉及由乙烯亚胺单元和2-噁唑啉单元构成的新型聚乙烯亚胺-基共聚物，但是与已知的聚乙烯亚胺-基共聚物(PEI)相比，本发明的聚乙烯亚胺-基共聚物令人惊奇地具有高官能度。这种类型的聚乙烯亚胺-基共聚物已知用于连接和释放DNA/RNA。而且，本发明还包括本发明提出的聚乙烯亚胺-基共聚物的制备方法和特定功能的用途。

[0002] 本发明提出的的聚乙烯亚胺-基共聚物可用于，例如，将表面官能化，开发用于移动分析的DNA芯片系统和用作传感器的防污涂料。

[0003] 2-(3-丁烯基)-2-噁唑啉已知用作单体(A.Gress,A. H.Schlaad；Thio-click modification of poly[2-(3-butenyl)-2-oxazoline]Macromolecules 40,2007,7928-7933)，2-(3-丁烯基)-2-噁唑啉是通过用N-琥珀酰亚氨基-4-戊酸酯(N-succinimidyl-4-pentenate)将(2-氯乙基胺)-氢氯化物官能化，然后进行闭环制得的。使在三个步骤中制得的单体2-(3-丁烯基)-2-噁唑啉聚合，得到聚(2-(3-丁烯基)-2-噁唑啉)。这种比较耗时的方法得到的均聚物不包含连接遗传物质(特别是DNA/RNA)所需的游离氨基。

[0004] 通过所谓的迈克尔反应(Michael reaction)来实现用N-异丙基丙烯酰胺将聚乙烯亚胺-基共聚物官能化也是已知的(H.Tian,F.Li,J.Chen,Y.Huang,X.Chen:N-Isopropylacrylamide-modified Polyethyleneimines as Effective Gene Carriers,Macromolecular.Bioscience 12,2012,1680-1688)。这些合成的衍生物对质粒DNA显示出粘合力(bonding affinity)。然而，通过所述迈克尔反应将PEI官能化得到侧链，但是侧链没有可能的多重键，因此官能化是有限的。特别地，以这种方式不可能制备具有官能化表面的基底或结构化水凝胶，例如对于珠粒和颗粒等，从而用于连接和释放遗传物质。

[0005] 也已知在温和的条件下，N-羟基琥珀酰胺(NHS)或极性稍微更大的N-羟基琥珀酰胺(NHS)与含羧基的组分(例如，丁酸)反应，得到“氨基酰基酯”(D.Sehgal,I.K.Vijay:A method for the high efficiency of water-soluble carbodiimide-mediated amidation,Anal.Biochem.218,1994,87-91)。

[0006] 通过这些氨基酰基酯，可以将氨基基团官能化，但是该官能化仅限于伯胺基团。而且，没有提及在聚合物中引入官能化的侧链。如上所述，多重键在这里也不可能出现，因此还是不能制备具有官能化表面或结构化水凝胶的基底，例如，对于珠粒和颗粒等，从而连接或释放遗传物质，特别是DNA/RNA。

[0007] 而且，通过EDAC/NHS用乙酸酯、丁酸酯和己酸酯将支化PEI官能化也是已知的(A.M.Doody,J.N.Korley,K.P.Dang,P.N.Zawaneh,D.Putnam:Characterizing the structure/function parameter space of hydrocarbon-conjugated branched polyethylenimine for DNA delivery in vitro,J.Control.Release 116,2006,227-237)。如前所述，官能化还是仅限于伯氨基基团。而且，通过乙酸酐、丙酸酐和丁酸酐将聚乙烯亚胺官能化也有描述(S.Nimesh,A.Aggarwal,P.Kumar,Y.Singh,K.C.Gupta,R.Chandra:
Influence of acyl chain length on transfection mediated by acylated PEI nanoparticles,Int.J.Pharm.337,2007,265-274)。在这两种情形中，存在对遗传物质(例如DNA/RNA)的粘合力，但是仍然没有提及引入的侧链具有多重键，因此，上述有限的应用官能性的缺点仍然存在。

[0008] 此外，已知具有可调的降解速率的聚亚烷基亚胺水凝胶(M.Carnahan,J.Butlin:Crosslinked Polyalkyleneimine Hydrogels with Tunable Degradation Rates,WO 
2009/102952A2)。这里，通过活化的乙二醇使经过不同的官能化的聚亚烷基亚胺(其反应历程没有经过证实)、或者支化的聚乙烯亚胺交联，从而PEI仅有一部分原始的氨基可用于将来的生物应用。仅通过起始聚合物的量与交联剂的量的比率来间接控制交联度。在该方法中，重点在于水凝胶网状结构的合成。没有进一步讨论已有的官能性的后续用途，例如用在表面上，或者用于合成用于连接和释放遗传物质的结构化水凝胶。

[0009] 此外，已知聚(N-乙酰基乙烯亚胺)的部分碱性水解(Y.Chujo,Y.Yoshifuji,K.Sada,T.Saegusa:A Novel Nonionic Hydrogel from 2-2-methyl-2-oxazoline,Macromolecules 22,1989,1074-1077)。只有通过已有的乙烯亚胺单元才可能发生上文已经描述的随后交联形成聚合物网状结构。这些不再可用于连接遗传物质和以后释放遗传物质。在制得的水凝胶中，不能准确量化游离的乙烯亚胺单元。而且，没有提及在聚合物中引入官能化的侧链，因此，排除例如表面官能化的应用。在水解方法中不能引入具有不饱和官能性的侧链。

[0010] 聚乙烯亚胺的烷基化或者酰化和对从这些共聚物释放的质粒的分析是公知的(M.Thomas,A.M.Klibanov:Enhancing polyethylenimine’s delivery of plasmid DNA into mammalian cells,PNAS 99,2002,14640-14645)。这里仍然没有提及引入不饱和官能团和通过交联剂将共聚物转化成水凝胶的可能性。

[0011] 而且，详细具体地分析了通过乙酸酐将聚乙烯亚胺部分乙酰化(M.L.Forrest,G.E.Meister,J.T.Koerber,D.W.Packl:Partial Acetylation of Polyethylenimine Enhances In Vitro Gene Delivery,Pharm.Res.21,2004,365-371)。由于侧链缺乏多重键，仍然存在限制可能的用途的上述缺点。

[0012] 也提及了用单官能、双官能或多官能组分使支化的聚乙烯亚胺官能化和交联。(P.Tarcha,T.Merdan,E.Wagner,J. Chemically modified polycation polymer for siRNA delivery,WO 2007/084797)。提及了通过迈克尔反应引入不饱和官能团的可能性，但是没有进一步描述实际实施。因此，这里也没有提及可能应用这些聚合物的以下可能应用：用于表面官能化或水凝胶的结构化，例如对于珠粒和颗粒等，从而用于连接和释放遗传物质(特别是DNA/RNA)。而且，在共聚物中通过交联剂连接已有的潜在的乙烯亚胺单元。

[0013] 也已知用长链酸性卤化物进行官能化(L.Yan,W.T.S.Huck,X.-M.Zhao,G.M.Whitesides:Patterning Thin Films of Poly(ethylene imine)(L.Van,WTS Huck,X.-M Zhao,GM Whitesides.Patterning Thin Films of poly(ethylene imine)on a Reactive SAM Using Microcontact Printing,Langmuir 15,1999,1208-1214)，但是仍然存在侧链缺失多重键和相关的应用可能性的缺点。

[0014] 已知合成具有各种组成的水溶性共聚物(WO 2011/162366 A1)。仅在侧链的乙二醇单元的上下文中描述了在支化的聚乙烯亚胺中引入多重键，其目的是合成水溶性聚合物。遗传物质的化学连接极大地受限于正电荷密度降低的百分比，特别是对于长的侧链。期望的溶解性特性特别是通过大数目的乙二醇单元实现的，但是，这导致难以连接，特别是难以连接DNA。但是，为了能够观察到对遗传物质的最有效连接，共聚物中的乙烯亚胺比例必须达到某个数量级。但是，从该组成出发，水溶性变得不再可能。没有提及这些不饱和的官能化共聚物例如用于水凝胶的结构化的应用。

[0015] 而且，已知聚(2-噁唑啉)的部分水解(F.Wiesbrock,F.Stelzer,C.Slugovic,N.Noormofidi,V.Kaltenhauser,E.Kreutzwiesner,K.Rametsteiner:Use of contact biocides based on poly(2-substituted)oxazolines,WO 2012/149591)。采用该反应方法不可能合成含有多重键的共聚物。水解导致在所需条件下破坏多重键的官能性。

[0016] 因此，本发明的目的是创造一种新型聚乙烯亚胺-基共聚物，可以低成本并且耗时短地来制备所述共聚物，所述共聚物是特制的(tailor-made)，并且对于对于广泛有效的用途具有高官能性，但是这并不限制它们连接遗传物质(特别是DNA/RNA)的能力。

[0017] 例如，可以由聚(乙烯亚胺)-基共聚物制备对DNA/RNA具有高粘合力的水凝胶。

[0018] 该目的通过用于连接和释放遗传物质的新型聚乙烯亚胺-基共聚物来实现，所述遗传物质特别是DNA/RNA，所述聚乙烯亚胺-基共聚物由乙烯亚胺单元和2-噁唑啉单元构成，所述聚乙烯亚胺-基共聚物具有通式I的化合物：

[0019]

[0020] 其中，

[0021] a、b：各单体单元的比例(a、b>0)，

[0022] d：侧链的长度(1-20)，

[0023] X：2-噁唑啉单元官能团(经由双键或三键)，

[0024] 共聚物链长为2-1000000个单元。

[0025] 这里，如果这些新型聚乙烯亚胺-基共聚物具有根据通式II的不同的噁唑啉单元会是有利的：

[0026]

[0027] 其中，

[0028] a、b、c：各单体单元的比例(a、b、c>0)，

[0029] d：侧链的长度(1-20)，

[0030] X：2-噁唑啉单元官能团(经由双键或三键)，

[0031] R：H或有机基团(例如，烷基和芳基基团)，

[0032] 共聚物链长为2-1000000个单元。

[0033] 可以通过核磁共振谱以简单快速的方式确认所述特制(tailored)共聚物的组成。与现有技术相比，所述新型共聚物的结构允许在共聚物主链中具有多重键，因此为官能性创造了条件，而不会限制对遗传物质的粘合力。因此，所述官能性允许充分支持连接/释放(特别是连接/释放DNA和RNA)的其他应用。例如，可以通过本身称为点击化学(click-chemistry)的手段(硫醇-烯光加成(thiol-ene photo addition)，叠氮化物点击(azide click))向所述共聚物中添加另外的组分。制得的共聚物的一大优点是该反应不会影响已有和准确量化的氨基基团。因此，它们的连接和释放遗传物质的亲和力(affinity)也保持不受影响，并且通过调节共聚物中的PEI含量仍然可以对其产生影响。重点仍然在于引入对生物应用没有影响的又短又简单的侧链，因此允许定量描述与遗传物质的连接。

[0034] 在从属权利要求中，基于本发明提出的共聚物的上述官能性说明了这些共聚物的特定应用。例如，所述共聚物可以应用于经官能化的表面，允许在这些表面中连接和释放遗传物质。由于不完全的表面连接，存在游离的多重键，这些多重键可用于在期望的表面逐渐产生水凝胶层。另一个优点是将三维聚合物网状结构(所谓的水凝胶)结构化的可能性。借助于双官能连接剂(二硫基化合物)，共聚物可以交联形成这种水凝胶。这种聚合物网状结构的关键优点在于它们在所有溶剂中的绝对的不溶性。因此，不可能(像在共聚物的情形中那样)通过(溶液)核磁共振谱确定凝胶结构中的所述PEI含量。但是，基于上述对共聚物的表征以及随后通过不饱和官能团(氨基基团保持不受影响)交联，可以准确描述水凝胶中包含的PEI比例。

[0035] 例如，通过用UV光(365nm)辐照样品来简单快速地进行硫醇-烯光加成，也提供了原位定制(customized)水凝胶珠粒可能性。这里，也可以选择性地连接和释放遗传物质。

[0036] 根据本发明，通过通式III的合成来制备新型聚乙烯亚胺-基共聚物：

[0037]

[0038] 在-OH或-NHS作为酸的情况下，在活化剂的存在下引入官能化是有利的，所述活化剂特别是EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)或DCC(二环己基碳二亚胺)。

[0039] 但是，也可以通过采用不饱和酸酐或卤化物(-Cl、-Br、-I)的在后官能化来引入功能性侧链。

[0040] 归因于合成方法，本发明的共聚物同时具有不饱和官能性和游离氨基基团。根据本发明，式I或式II的共聚物的合成基于将均聚物聚乙烯亚胺在后官能化(式III)。

[0041] 所述合成方法允许以低成本进行节约时间和技术简单的方法，所述方法对于小规模和大批量技术均可用。制备特制的共聚物所得到的物质具有准确限定的组成，该组成可以根据具体的应用目的而变化。可以采用核磁共振光谱简单快速地确定它们的准确组成。因此，通过简单改变前体的量就可以创造具有不同组成的广泛的共聚物库。

[0042] 将通过各种具体实施方式来详细描述本发明。

[0043] 实施例1：

[0044] 以准确可调的PEI比例来合成水凝胶(用于后面连接和释放基因组(genomic herring)DNA)，其中以类似于Dargaville所述的方法，通过光引发的硫醇-烯光加成来使共聚物交联(TR Dargaville et al.:poly(2-oxazoline)hydrogel monoliths is carried out via thiol-ene coupling,Macromol.Rapid Commun.33,2012 1695-700)。

[0045] 下式示意性地显示了在UV光(365nm)下，在催化剂DMPA的存在下，用2,2′-(乙二基双氧代)双乙硫醇(2,2'-(ethylenedioxy)diethanthiol)对P(ButEnOx-co-EI)进行硫醇-烯光加成的制备方法。

[0046]

[0047] 聚[2-(3-丁烯)-2-噁唑啉-共-乙烯亚胺]基水凝胶：

[0048] 在微波小瓶中，使共聚物P(ButEnOx-co-EI)溶解在乙醇中。在另一个小瓶中，使光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和双官能醇2,2'-(乙二基双氧代)双乙硫醇也溶解在乙醇中(醇：双键为0.9：1.0)。用氮气将组合的澄清溶液(10重量％)脱气30分钟并且暴露于UV光(365nm)约24小时。开始形成凝胶显示出成功地合成了水凝胶。用甲醇和水反复洗涤得到的凝胶。在该方法之后进行冷冻干燥。

[0049] 可以由合适的共聚物开始来创造各种水凝胶的库。也可以广泛地表征合成的物质(源值(source value)、气相TGA、FT-IR、EA、固体1H-/13C-NMR、SEM)。

[0050] DNA研究–溴乙菲啶测试P(ButEnOx-co-EI)基水凝胶：

[0051] 使水凝胶在HBG缓冲液(pH 7)中溶胀24小时。然后，添加基因组DNA溴乙菲啶溶液。以规定的次数，每次取一个等分试样，在测量荧光之后，将其用移液管移回。通过添加肝硫酯溶液并且将温度升高到70℃，在非常短的时间内实现了之前连接的DNA的目标释放。

[0052]

[0053] 图1：通过EB测试的具有不同PEI含量的水凝胶连接(A)和释放(B)基因组DNA的示意图

[0054] 结果：

[0055] 仅在PEI含量低于75％时才发生胶凝。

[0056] 除了具有期望的不溶性，水凝胶在水中表现出典型的溶胀性，这极大地依赖于凝胶的PEI含量和交联度(二硫基化合物的量)。连接和释放DNA的能力取决于水凝胶结构中的PEI比例。除了温度升高之外，受控释放也需要存在肝硫酯。还是在非常短的时间内(<60分钟)，几乎全部释放DNA。

[0057] 实施例2：

[0058] 类似于悬浮聚合通过硫醇-烯光加成配制水凝胶珠粒。

[0059] 通过制备本发明提出的新型共聚物作为水凝胶珠粒，实现了表面积的极大增加，因此实现了更有效的DNA连接。而且，通过改变反应条件可以将珠粒调节到准确限定的尺寸。

[0060] P(ButEnOx-co-EI)基水凝胶珠粒：

[0061] 采用共聚物P(ButEnOx-co-EI50％)作为起始原料。使该共聚物和适量的催化剂DMPA溶解在乙醇(8重量％)中，然后添加二硫基化合物2,2′-(乙二基双氧代)双乙硫醇。通过加入石蜡油和稳定剂 80，制得两相混合物。用N2脱气25分钟之后，通过在室温下搅拌(375rpm)和UV-辐照(365nm)，进行硫醇-烯光加成。2.5小时之后，分离得到的水凝胶并且用乙醇和水深度清洗。然后，使凝胶在水中溶胀六小时并且进行冷冻干燥。

[0062] 实施例3：

[0063] 在经硫醇-烯光加成而官能化的玻璃表面上添加单层和逐渐生成共价连接的水凝胶层。

[0064] 本发明提出的新型共聚物与硫醇-官能化的表面的共价连接使得DNA有效连接表面和从表面释放成为可能。通过结合上述二硫基化合物，取决于层厚度，可以逐渐建立具有不同的DNA亲和力的水凝胶层(概述1)。从经涂布的表面连接和释放遗传物质(特别是DNA/RNA)的这一应用可用于，例如，移动分析(芯片诊断)中。

[0065] 在圆锥形的微波小瓶中，使共聚物P(ButEnOx-co-E150％)和光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮一起溶解在乙醇中。放置预先在等离子体加热炉中烘烤并且用3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙硫醇官能化的1×1cm2的玻璃板，使得在插入的玻璃板下面仍然可以用磁力搅拌棒进行搅拌。用氮气将小瓶脱气30分钟，然后将小瓶暴露于UV光(365nm)约24小时。用水和甲醇反复洗涤经涂布的玻璃表面(第一点击)。代替添加共聚物，通过添加交联剂2,2′-(乙二基双氧代)双乙硫醇，以类似的方式进行第二点击。再次进行上述洗涤步骤。与所述共聚物重复反应(第三点击)，得到水凝胶层的形态形成(formal creation)。由于存在游离双键，可以逐步构建层状结构，直到第七点击，并且甚至更多层也是可能的。

[0066]

[0067] 概述1：涂层的化学背景

[0068] 采用荧光显微镜可以显示出成功地涂布了玻璃表面。为了该目的，用荧光素染料(～1％)标记上述共聚物，然后将以此方式标记的共聚物添加到待检测表面(点击步骤)。即便在深度洗涤之后，与没有染料的涂层相比经标记的样品具有增加的荧光，因此，经处理的表面显示出成功的共价连接。通过原子力显微镜测量经涂布的表面上的刮擦，显示出第一层(第一点击)的厚度为15nm。对于形成水凝胶层(第三点击)，可以确定35nm的高度。而且，通过使用红外光谱可以显示成功的连接。