南方红豆杉的林木遗传育种方法

摘要

本发明公开了一种南方红豆杉的林木遗传育种方法，包括如下步骤：花粉采集、授粉、施肥、挂果、沙藏、播种、移栽。本发明方法解决红豆杉属植株种间花期不同步导致授粉育种困难的问题，简便易行，且采用喷施的方式进行大量的生产实践。本发明对于南方红豆杉属植物资源的深度开发和广泛应用具有重要而深远的意义，应用前景广阔。

权利要求

1.南方红豆杉的林木遗传育种方法，所述方法包括如下步骤：

（1）采集花粉：采集曼地亚红豆杉的雄株的花粉，自然干燥，剔除杂质后，置于EP管4℃冷藏备用，并保持干燥；

（2）授粉：取出步骤（1）制备的花粉，室温放置一小时使其恢复常温；按照花粉：超纯水= 

1：1000 的重量比例配置成花粉液，将曼地亚红豆杉花粉授粉南方红豆杉雌株，每隔四天使用喷壶喷施一次，共授粉3次；

（3）施肥：授粉后，按照氮、磷、钾的重量比例为1:3:1，喷施3次叶面肥；

（4）挂果：挂果后喷施营养液，营养液成分为：N200mg/L、P33mg/L、 K66mg/L，磷肥以NH4H2PO4 形式加入，钾肥以KNO3形式加入，氮肥除以NH4H2PO4和KNO3的形式加入外，不足部分用（NH4）2SO4 补充；待种子成熟后，采集种子；

（5）沙藏：将采集的种子冷水浸种6天，每天换水一次，浸种后将种子表面水分晾干，低温沙藏，按沙子：种子为4:1的重量比进行；

（6）播种：春季，将沙藏的种子灭菌后，用280mg/L GA3+20mg/L 6-BA +30mg/L KT+8mg/L ABT浸泡种子24小时，后播种，获得无菌试管苗；

（7）移栽：将无菌试管苗炼苗10～15天，然后将其取出，洗净根部的培养基，将其根部浸泡在复合微生物制剂中30min，促进南方红豆杉植株新根的生长；

所述复合微生物制剂包括以下重量配比的原料：假丝酵母菌发酵液：地衣芽孢杆菌发酵液：产黄纤维单胞菌发酵液：粪产碱杆菌发酵液：赤霉素：活性炭：磷酸氢二钾＝4：2：2：3：

1：2：1；

所述假丝酵母菌为假丝酵母菌（Candida utilis）ATCC No.22023;所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCC NO.2276；

所述产黄纤维单胞菌为产黄纤维单胞菌（cellulomonas flavigena）ATCC No.482；

所述粪产碱杆菌为粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）ATCC 31555。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合微生物制剂的制备方法为：首先将假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌、产黄纤维单胞菌、粪产碱杆菌分别按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到108个/克获得发酵液，将上述发酵液、活性炭、赤霉素和磷酸氢二钾按照重量配比混合即得。

3.权利要求1或2所述的方法用于南方红豆杉育种的应用。

说明书

南方红豆杉的林木遗传育种方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物的林木遗传育种方法，具体涉及南方红豆杉的林木遗传育种方法，属于木本植物品种选育的技术领域。

背景技术

[0002] 林木遗传育种一般指以下研究：森林遗传学，森林树木不同性状在群体、个体、细胞及分子水平上的遗传变异规律和进化机制，为森林资源的保存、经营及林木的遗传改良提供理论基础。林木遗传改良，林木改良的策略和程序，制定育种方案，引种、选择育种、杂交育种（包括产量、品质、抗性和适应性育种等）理论与方法，以及林木良种繁育途径和方法。林业生物技术，利用基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程等生物技术，对林木进行遗传改良或对林木良种进行高效繁育。林木遗传育种对植物品种的开发和推广利用都具有着非常重要的意义。

[0003] 南方红豆杉，常绿乔木，树皮淡灰色，纵裂成长条薄片；芽鳞顶端钝或稍尖，脱落或部分宿存于小枝基部。叶2列，近镰刀形，长1.5～4.5厘米，背面中脉带上无乳头角质突起，或有时有零星分布，或与气孔带邻近的中脉两边有1至数条乳头状角质突起，颜色与气孔带不同，淡绿色，边带宽而明显。种子倒卵圆形或柱状长卵形，长7～8毫米，通常上部较宽，生于红色肉质杯状假种皮中。种子可榨油；树皮含单宁；木材可供作用材。南京和上海都有栽培；用种子繁殖，也可扦插。分布于长江流域以南各省区，以及河南和陕西。国家一级重点保护野生植物。南方红豆杉是中国亚热带至暖温带特有成分之一，在阔叶林中常有分布。耐荫树种，喜温暖湿润的气候，通常生长于山脚腹地较为潮湿处。自然生长在海拔1000米或1500米以下的山谷、溪边、缓坡腐殖质丰富的酸性土壤中，要求肥力较高的黄壤，黄棕壤，中性土、钙质土也能生长。耐干旱瘠薄，不耐低洼积水。对气候适应力较强，年均温11～16℃，最低极值可达-11℃。具有较强的萌芽能力，树干上多见萌芽小枝，但生长比较缓慢。很少有病虫害，寿命长。南方红豆杉是国家一级重点保护野生植物，为优良珍贵树种。在贵州省的分布区虽较广，但本种在其分布区内种群数量稀少，若不加以保护，有处于渐危状态的危险。南方红豆杉多属鸟类取食带传播，故很分散、零星。由于材质好，色泽美观，破坏更为严重，当前首要的是停止对现有资源的破坏，同时加强繁育工作，引为庭园观赏树种，扩大栽培，达到保存物种的目的。

[0004] 红豆杉属植物，雌雄异株，雄球花单生于叶腋，雌球花的胚珠单生于花轴上部侧生短轴的顶端，基部有圆盘状假种皮，假种皮杯状，红色。本属树种为浅根植物，其主根不明显、侧根发达，耐荫性强，耐修剪、耐寒、耐病虫害，在天然林中生长缓慢，分布星散，野生树木日渐减少，是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。由于红豆杉属植物不同种之间雄花的花期不同，且同种红豆杉的雌雄株花期不同步，造成授粉困难，严重影响了红豆杉属植物的杂交育种进程。

发明内容

[0005] 本发明解决的技术问题是提供了一种南方红豆杉的林木遗传育种，解决红豆杉属植株种间花期不同步导致授粉育种困难的问题。

[0006] 为了达到上述目的，本发明提供了南方红豆杉的林木遗传育种方法，包括如下步骤：

[0007] （1）花粉采集：于2月份，采集曼地亚红豆杉（Taxus × media）的雄株的花粉，自然干燥，剔除杂质后，分别置于EP管4℃冷藏备用，并保持干燥；

[0008] （2）授粉：到3月份，南方红豆杉雌株进入吐水期，取出储存的花粉，室温放置一小时使其恢复常温；按照花粉：超纯水= 1:1000 的重量比例配置成花粉液，将曼地亚红豆杉花粉授粉南方红豆杉雌株，喷施雌株，每隔四天使用喷壶喷施一次，共授粉3次；单株处理可采用灭菌棉签沾花粉涂抹吐水期雌花进行授粉；授粉后所有授粉植株进行分株隔离以防止外来花粉的干扰。

[0009] （3）施肥：授粉后，施肥，按照氮、磷、钾比例为1:3:1，喷施3次叶面肥；

[0010] （4）挂果：挂果后喷施营养液，营养液成分为：N200mg/L、P33mg/L、 K66mg/L，磷肥以NH4H2PO4 形式加入，钾肥以KNO3形式加入，氮肥除以NH4H2PO4和KNO3的形式加入外，不足部分用（NH4）2SO4 补充。

[0011] 保证植株养分供给；待种子成熟后，分别从母本植株上采集不同父本授粉育种种子，获得纯种和杂交种种子；

[0012] （5）沙藏：将采集的种子冷水浸种6天，每天换水一次，浸种后将种子表面水分晾干，低温沙藏，按沙子：种子为4:1的重量比进行；

[0013] （6）播种：春季，将沙藏的种子灭菌后，用280mg/L GA3+20mg/L 6-BA +30mg/L KT+8mg/L ABT浸泡种子24小时，后播种，获得无菌试管苗；

[0014] （7）移栽：将无菌试管苗炼苗10～15天，然后将其取出，洗净根部的培养基，将其根部浸泡在复合微生物制剂中30min，促进新根的生长；

[0015] 所述复合微生物制剂包括以下重量配比的原料：假丝酵母菌发酵液：地衣芽孢杆菌发酵液：产黄纤维单胞菌发酵液：粪产碱杆菌发酵液：赤霉素：活性炭：磷酸氢二钾＝4：2：2：3：1：2：1；

[0016] 所述假丝酵母菌为假丝酵母菌（Candida utilis）ATCC No.22023;

[0017] 所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCC NO.2276；(参见CN101215537A);

[0018] 所述产黄纤维单胞菌为产黄纤维单胞菌（cellulomonas flavigena）ATCC No.482；

[0019] 所述粪产碱杆菌为粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）ATCC 31555；

[0020] 所述复合微生物制剂的制备方法为：首先将假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌、产黄纤维单胞菌、粪产碱杆菌分别按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到108个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例4：2：2：3混合，按照重量配比添加活性炭、赤霉素和磷酸氢二钾即得。

[0021] 移栽30天后成活率达到97.3%。

[0022] 本发明杂交育种方法具有以下优点：

[0023] 1、杂交亲本：

[0024] 植物杂交育种领域，最重要的不同就在于针对的每一亲本的不同选择，选择不同的亲本就必须对具体的杂交组合的培育方法进行多次重复试验，不同原始种间杂交败育很高，杂交后，虽然有较高果实率，果实里面也有种子，但是检测后种子里面没有胚。南方红豆杉生长速度快、紫杉醇含量低；曼地亚红豆杉生长速度慢，紫杉醇含量高。红豆杉是异花授粉植物。将南方红豆杉与曼地亚红豆杉杂交，得到杂交后代，使其兼有双亲优势，可以有效解决紫杉醇制药原料短缺的问题，且获得杂交组合的F1代种子萌发率，可育率最高；

[0025] 2、层积前先用冷水进行预处理，由于层积催芽是一个缓慢的吸水过程，同时也是一个缓慢的转化和缓慢发芽的过程，种子萌动与种子含水率相关，只有种子的含水率接近或达到饱和含水率时才开始萌动，而达到饱和含水率所需要的时间与种子开始层积时的含水率相关，层积前含水率越低，吸水越缓慢，达到饱和含水率的时间越长，适宜催芽的时间也会越长；发明人通过实验发现，层积前将种子进行冷水浸种6天，每天换水一次，浸种后将种子表面水分晾干，低温沙藏，按沙子：种子为4:1的重量比进行，这样的预处理后，可以使得层积两个月左右便达到饱和状态，缩短催芽时间，且该预处理能够增加田间发芽率。

[0026] 3、激素种类和浓度对种子的生长发育有非常显著的作用，由于红豆杉属植物种子萌发困难，本申请通过大量实验发现，用280mg/L GA3+20mg/L 6-BA +30mg/L KT+8mg/L ABT浸泡种子24小时，后播种，能够显著改善杂交种子的发芽率，单因子实验结果表明，采用该激素浸泡后，种子发芽率提高了36.3％，且大大缩短了萌发时间。

[0027] 4、移栽时，赤霉素的浓度适中，刺激根系细胞的伸展旺盛，搭配假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌、产黄纤维单胞菌、粪产碱杆菌形成一个良好的微生态系统，各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，微生物分泌根系促生素和抑菌素能够呵护幼苗根系感染腐霉根腐病、疫霉根腐病、细菌性根腐病和茎基腐病及立枯病、猝倒病等苗期病害,从而有效控制苗期的死苗烂棵现象，磷酸氢二钾给根系源源不断供给营养，维持苗强苗壮势头，极大的提高植株的适应性，提高整个成活率。

具体实施方式

[0028] 实施例1

[0029] 一种红豆杉的杂交育种方法，包括如下步骤：

[0030] （1）花粉采集：确定南方红豆杉（Taxus wallichiana var. mairei）和曼地亚红豆杉（Taxus × media）的雌雄株，并调查花期的具体时间。结果发现南方红豆杉雄花的始花期比曼地亚红豆杉的早10天以上，雌花的始花期基本一致；两种红豆杉雌花单花的吐水期2天，整株雌花吐水期持续2周左右。2月下旬采集曼地亚红豆杉的雄株的花粉，自然干燥，剔除杂质后置于EP管4℃冷藏备用，并保持干燥。

[0031] （2）授粉：3月1号起，观察南方红豆杉和曼地亚红豆杉雌株上雌花吐水情况，自发现有雌花进入吐水期开始第二天取出储存的花粉，室温放置一小时使其恢复常温；按照花粉：超纯水= 1：1000 的比例配置成花粉液，将曼地亚红豆杉花粉授粉南方红豆杉雌株，喷施雌株，每隔四天使用喷壶喷施一次，共授粉3次；单株处理可采用灭菌棉签沾花粉涂抹吐水期雌花进行授粉；授粉后所有授粉植株进行分株隔离以防止外来花粉的干扰。

[0032] （3）施肥：授粉后，施肥，按照氮、磷、钾比例为1:3:1，喷施3次叶面肥；

[0033] （4）挂果：挂果后喷施营养液，营养液成分为：N200mg/L、P33mg/L、 K66mg/L，磷肥以NH4H2PO4 形式加入，钾肥以KNO3形式加入，氮肥除以NH4H2PO4和KNO3的形式加入外，不足部分用（NH4）2SO4 补充。

[0034] 保证植株养分供给；待种子成熟后，采集杂交种子

[0035] 5）沙藏：将采集的种子冷水浸种6天，每天换水一次，浸种后将种子表面水分晾干，低温沙藏，按沙子：种子为4:1的重量比进行；

[0036] （6）播种：春季，将沙藏的种子灭菌后，用280mg/L GA3+20mg/L 6-BA +30mg/L KT+8mg/L ABT浸泡种子24小时，后播种，获得无菌试管苗；

[0037] （7）移栽：将无菌试管苗炼苗10～15天，然后将其取出，洗净根部的培养基，将其根部浸泡在复合微生物制剂中30min，促进南方红豆杉植株新根的生长；

[0038] 所述复合微生物制剂包括以下重量配比的原料：假丝酵母菌发酵液：地衣芽孢杆菌发酵液：产黄纤维单胞菌发酵液：粪产碱杆菌发酵液：赤霉素：活性炭：磷酸氢二钾＝4：2：2：3：1：2：1；

[0039] 所述假丝酵母菌为假丝酵母菌（Candida utilis）ATCC No.22023;

[0040] 所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCC NO.2276；(参见CN101215537A);

[0041] 所述产黄纤维单胞菌为产黄纤维单胞菌（cellulomonas flavigena）ATCC No.482；

[0042] 所述粪产碱杆菌为粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）ATCC 31555；

[0043] 所述复合微生物制剂的制备方法为：首先将假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌、产黄纤维单胞菌、粪产碱杆菌分别按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到108个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例4：2：2：3混合，按照重量配比添加活性炭、赤霉素和磷酸氢二钾即得。

[0044] 移栽30天后成活率达到97.3%，且所有成活植株均冬季耐寒；

[0045] 经本发明方法获得的南方红豆杉植株，长势强健，抗病，能够安全过冬，有效解决了红豆杉市场资源的空缺，具有广阔的应用前景。

[0046] 按照本发明方法栽培的红豆杉，生长周期快，在二年左右即可以采收枝叶用于提取紫杉醇。

[0047] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，或在实施案例之外的树种实施本方法，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。