一类具有镇痛作用的钠离子通道1.7抑制剂

摘要

本发明公开了多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗疼痛的药物中的应用，所述多氧取代环己烯类化合物为式(I)所示的化合物，其中，在式(I)中R1，R2，R3，R4，R5各自独立为H、n为1‑5的整数，R为氢、卤素、甲基、甲氧基或硝基。将含有本发明提供的多氧取代环己烯类化合物的药物用于预防或治疗疼痛时能够获得良好的预防或治疗疼痛的效果。

权利要求

1.多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗疼痛的药物中的应用，其特征在于，所述多氧取代环己烯类化合物为式(I)所示的化合物，其中，R1为 R2为H，R3为 R4为H，R5为H；

或者，R1为 R2为 R3为 R4为H，R5为H；

或者，R1为 R2为H，R3为 R4为CH2CH3，R5为H；

或者，R1为 R2为 R3为 R4为CH2CH3，R5为H；

或者，R1为 R2为 R3为 R4为 R5为H；

或者，R1为 R2为H，R3为 R4为 R5为H；

所述疼痛选自神经性疼痛或伤害性疼痛，所述伤害性疼痛是指由伤害性刺激引起的疼痛，所述伤害性刺激为外物打击或极端温度。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，在所述药物中，所述多氧取代环己烯类化合物的含量为0.1-20重量％。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，在所述药物中，所述多氧取代环己烯类化合物的含量为5-10重量％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其中，所述药物包括所述多氧取代环己烯类化合物及其立体异构体、其在药学上可接受的盐中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述药物为丸剂、膏剂、片剂、口服液剂、皮下注射剂和静脉注射剂中的一种或多种。

说明书

一类具有镇痛作用的钠离子通道1.7抑制剂

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，具体地，涉及多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗疼痛的药物中的应用。

背景技术

[0002] 疼痛主要分为急性疼痛和慢性疼痛，急性疼痛包括炎性疼痛和伤害性疼痛等，慢性疼痛包括神经性疼痛、肌原性疼痛和纤维肌疼痛等。由于在大量病例中疼痛严重影响了患者的生活质量，因此，由疼痛造成的社会损失是不可估量的。

[0003] 目前，用于轻度疼痛的治疗药物主要为作用于神经末梢的阿司匹林、对乙酰氨基酚等非甾体类抗炎药；用于中度或重度疼痛的治疗药物主要为作用于中枢神经系统的类阿片类镇痛药，如吗啡等。但是，当使用非甾体类抗炎药用于疼痛治疗时，除了具有镇痛效果不充分的缺点以外，其对消化系统等的副作用也是问题。当使用类阿片类镇痛药时，容易出现恶心、呕吐、便秘、依赖性等副作用。另外，这些含有吗啡的镇痛剂虽然对急性疼痛具有效果，但是对神经性疼痛往往显示不出充分的效果。因此，开发一种具有良好镇痛效果，特别适用于神经性疼痛，同时副作用少的新型药物具有十分重大的意义。

[0004] 电压门控钠离子通道(Nav)与神经系统活动密切相关。目前，已经报道了九种Nav亚型，这些亚型分别具有不同的表达分布和生理作用。从药理学的角度，根据对河豚毒素敏感性的不同，电压门控钠离子通道通常可分为河豚毒素敏感型(TTX-S)和河豚毒素不敏感型(TTX-R)两大类，其中，Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7均属于TTX-S型；Nav1.5、Nav1.8和Nav1.9属于TTX-R型。

[0005] Nav1.7主要表达在背根神经节、肠肌层神经元以及交感神经节神经元，特别是大部分为伤害性感受器的小直径背根神经元，其特征为产生快速失活的TTX-S钠电流、慢复活和慢关闭状态失活，与神经元兴奋的阈值高低相关。近年来，许多研究表明Nav1.7与炎性疼痛和神经性疼痛均密切相关。一方面，在大鼠后爪注射角叉菜胶后，Nav1.7mRNA在神经元中的表达上调，提示Nav1.7与神经元兴奋性增高和炎性疼痛有关。在伤害性感受器上敲除Nav1.7基因还被报道可缓解福尔马林、辣椒素、弗氏完全佐剂或神经生长因子等引起的炎性痛。上述内容有力地证实了Nav1.7在炎性疼痛过程中发挥着重要作用。另一方面，Nav1.7缺失鼠在出生后很快死亡，在伤害性感受器上敲除Nav1.7基因，可减弱慢性坐骨神经压迫性损伤模型的冷痛敏感。在感觉神经元上敲除Nav1.7基因，在慢性坐骨神经压迫性损伤模型大鼠上发现失去冷痛与机械痛。在交感神经与感觉神经元敲除Nav1.7基因，慢性坐骨神经压迫性损伤模型与脊神经切断手术中发现冷痛与机械痛均失去。上述内容表明，Nav1.7在神经性疼痛过程中也发挥着重要的作用。因此，寻找Nav1.7离子通道高度选择性抑制剂是近年来镇痛药物研发的热点。

发明内容

[0006] 本发明的目的是为了克服上述缺陷，提供了多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗疼痛的药物中的应用。

[0007] 为了实现上述目的，本发明提供了多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗疼痛的药物中的应用，其特征在于，所述多氧取代环己烯类化合物为式(I)所示的化合物，[0008]

[0009] 其中，R1，R2，R3，R4，R5各自独立为 n为1-5的整数，R为氢、卤素、甲基、甲氧基或硝基。

[0010] 将含有本发明所述的多氧取代环己烯类化合物的药物用于预防或治疗疼痛时能够取得很好的预防或治疗效果，并且，本发明所述的多氧取代环己烯类化合物的药物毒性低、生物利用度高。进一步地，从本发明提供的实施例的结果可以看出：多氧取代环己烯类化合物对Nav1.7通道具有明显的抑制作用，并且对神经性疼痛、炎性疼痛和伤害性疼痛均具有显著的保护作用。综上所述，将本发明所述的多氧取代环己烯类化合物应用于制备预防或治疗疼痛的药物中具有很好的开发前景。

[0011] 本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

[0012] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

[0013] 图1表示的是本发明提供的实施例中阳性药Antillatoxin(ATX)对Nav1.7通道的激动作用；

[0014] 图2表示的是本发明提供的实施例中阳性药Tetrodotoxin(TTX)对Nav1.7通道的抑制作用；

[0015] 图3表示的是在本发明的一种优选实施方式中化合物4对大鼠慢性坐骨神经压迫性损伤模型机械痛敏的影响；

[0016] 图4表示的是在本发明的一种优选实施方式中化合物4对大鼠慢性坐骨神经压迫性损伤模型热痛敏的影响；

[0017] 图5表示的是在本发明的一种优选实施方式中化合物4对小鼠醋酸扭体模型，扭体潜伏期的影响；

[0018] 图6表示的是在本发明的一种优选实施方式中化合物4对小鼠醋酸扭体模型，15min内扭体次数的影响；

[0019] 图7表示的是在本发明的一种优选实施方式中化合物4对小鼠热水甩尾模型尾部入水后至甩尾出水面潜伏期的影响。

具体实施方式

[0020] 以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0021] 本发明提供了多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗疼痛的药物中的应用，其特征在于，所述多氧取代环己烯类化合物为式(I)所示的化合物，

[0022]

[0023] 其中，R1，R2，R3，R4，R5各自独立为 n为1-5的整数，R为氢、卤素、甲基、甲氧基或硝基。

[0024] 根据本发明，在优选情况下，所述多氧取代环己烯类化合物为式(I)所示的化合物，R1为 R2为H或 R3为 R4为R5为H，n为1-2的整数，R为氢或甲基。

[0025] 在本发明中，在优选情况下，所述多氧取代环己烯类化合物包括式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物、式(IV)所示的化合物、式(V)所示的化合物、式(VI)所示的化合物和式(VII)所示的化合物中的一种或多种，更优选的，所述多氧取代环己烯类化合物包括式(V)所示的化合物。

[0026]

[0027] 根据本发明，对所述药物中多氧取代环己烯类化合物的含量没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，只要能够获得良好的镇痛效果即可，例如，所述多氧取代环己烯类化合物的含量可以为0.1-20重量％，优选为5-10重量％。

[0028] 在本发明中，对所述多氧取代环己烯类化合物的制备方法没有特别的限定，本领域技术人员可以根据本领域内的公知常识制备本发明所述的多氧取代环己烯类化合物，或者通过市售获得本发明所述的多氧取代环己烯类化合物。在优选情况下，本发明所述的多氧取代环己烯类化合物可以根据文献(Griffen J A，White J C， et al.New aminocyclitols with quaternary stereocentres via acylnitroso 
cycloaddition with an ipso，ortho arene dihydrodiol[J].Tetrahedron，2013，69(29)：5989-5997)中提供的方法制备得到。

[0029] 根据本发明，所述药物可以包括所述多氧取代环己烯类化合物及其立体异构体、其在药学上可接受的盐和溶剂化物中的一种或多种。其中，本发明对所述立体异构体没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，例如可以包括多氧取代环己烯类化合物的对映异构体或非对映异构体。另外，本发明对所述在药学上可接受的盐也没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，例如可以选自多氧取代环己烯类化合物的盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐和碳酸盐中的一种或多种，优选为盐酸盐或碳酸盐。进一步的，本发明对所述溶剂化物也没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，在优选情况下，所述溶剂化物包括将多氧取代环己烯类化合物溶于二甲基亚砜、吐温80、生理盐水、盐酸和乙醇中的一种或多种，优选为二甲基亚砜、吐温80或生理盐水。

[0030] 根据本发明，对所述药物的剂型没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，只要其可以实现便于使用且可以获得较好的镇痛效果的目的即可。在优选的情况下，所述药物可以为丸剂、膏剂、片剂、口服液剂、皮下注射剂和静脉注射剂中的一种或多种，进一步优选为皮下注射剂或静脉注射剂。当所述药物以上述剂型的形式被使用时，该药物还可以包括赋形剂、稳定化剂、保存剂、缓冲剂、助溶剂、乳化剂、稀释剂或等渗剂。

[0031] 在本发明中，对上述丸剂、膏剂、片剂、口服液剂、皮下注射剂和静脉注射剂的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员所公知的方法，在此不再赘述。

[0032] 根据本发明，所述疼痛可以包括由各种原因导致的疼痛，在优选的情况下，本发明所述的疼痛包括神经性疼痛、炎性疼痛和伤害性疼痛中的一种或多种，具体可以为神经病理性疼痛、炎性疼痛、术后疼痛、关节痛、神经病变引起的疼痛、神经损伤导致的疼痛、糖尿病性神经病变引起的疼痛、内脏疼痛、神经根痛、坐骨神经痛、头痛、背痛、颈痛、顽固性疼痛、红斑性肢痛症、阵发性剧痛症和癌痛中的一种或多种。

[0033] 在本发明中，术语“慢性疼痛”是指疼痛在不能确定原因的状态下的持续状态。术语“神经性疼痛”是指由于神经组织的损伤、刺激或压迫等而发病的疼痛。根据发病部位不同，神经性疼痛包括三叉神经痛和坐骨神经痛。术语“炎性疼痛”是指由于炎症反应引发的疼痛。术语“伤害性疼痛”是指由伤害性刺激引起的疼痛，其中，所述伤害性刺激可以为外物打击或极端温度。

[0034] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

[0035] 以下实施例中，在没有特别说明的情况下，所使用的各种试剂和材料均来自市售。

[0036] 在以下实施例中，所使用的多氧取代环己烯类化合物(化合物1-6)根据文献(Griffen J A，White J C， et al.New aminocyclitols with quaternary stereocentres via acylnitroso cycloaddition with an ipso，ortho arene dihydrodiol[J].Tetrahedron，2013，69(29)：5989-5997)中提供的方法制备得到。

[0037] 在以下实施例中，化合物对Nav1.7通道的作用是通过FLIPR-TERA仪器(Molecular Devices公司)进行检测的。

[0038] Fluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)是一种均质、动态、细胞水平的荧光检测方法，可用于胞内钙离子、钠离子、膜电位和pH的检测，其原理为荧光信号快速、准确检测，可达到亚秒级水平，允许短暂信号的检测，尤其适用于钙指示剂检测胞内钙。

[0039] 在以下实施例中，使用大鼠慢性坐骨神经压迫性损伤(chronic constriction injury，CCI)模型评价药物对神经性疼痛的作用。CCI模型是目前应用最为广泛的评价药物对慢性坐骨神经痛作用的模型。

[0040] 在以下实施例中，通过小鼠醋酸扭体实验反映药物对炎性疼痛的作用。

[0041] 在以下实施例中，通过小鼠热水甩尾实验反映药物对伤害性疼痛的作用。

[0042] 在以下实施例中，所使用的实验SD雄性大鼠均购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，雄性，体重230g-250g，鼠龄8周。实验用ICR小鼠均购自南通大学实验动物中心，雌雄各半，体重18g-22g。

[0043] 实施例1

[0044] 本实施例用于说明本发明提供的多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗疼痛药物中的应用。

[0045] (1)稳定转染Nav1.7的细胞系的获得和培养

[0046] 稳定转染Nav1.7的CHO细胞系由University of California，Davis Christoph Lossin教授提供。

[0047] 将稳定转染Nav1.7的CHO细胞接种至96孔黑色底透培养板(Corning公司，3603)中，每孔2×104个细胞，细胞使用FLIPR Membrane Potential Blue染料(FMP Blue，Molecular Device公司)常温避光孵育30min，将培养板放置于FLIPR-TERA仪器中，在开始检测120s时加入终浓度为0.1-30nM的Nav1.7激动剂Antillatoxin(ATX，合成过程参见Okura K，Matsuoka S，Goto R，et al.The twisted side chain of antillatoxin is important for potent toxicity：total synthesis and biological evaluation of antillatoxin and analogues[J].Angewandte Chemie，2010，122(2)：339-342.)，溶剂为1体积‰DMSO(FMP Blue染料稀释)，通过FLIPR-TERA仪器检测300s，激发波长510-545nm，发射波长565-625nm的荧光信号，以对所建立的细胞模型进行验证，并且根据量效曲线下面积计算ATX的半数有效浓度(EC50)，结果如图1所示。

[0048] 另外，将稳定转染Nav1.7的CHO细胞接种至96孔黑色底透培养板中，每孔2×104个细胞，细胞使用FLIPR Membrane Potential Blue染料常温孵育30min，将培养板放置于FLIPR-TERA仪器中，在开始检测120s时加入1-3000nM Nav1.7抑制剂河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX，货号：Abs44200985a，爱必信(上海)生物科技有限公司)，溶剂为1体积‰醋酸，并于420s时加入溶于1体积‰DMSO中的ATX(10nM)，通过FLIPR-TERA仪器检测激发波长510_545nm，发射波长565_625nm的荧光信号，以对所建立的细胞模型进行验证，并且根据量效曲线下面积计算TTX的半数抑制浓度(IC50)，结果如图2所示。

[0049] 根据图1和图2的结果可以看出，ATX对Nav1.7通道的EC50值为8.7nM。另外，在10nM ATX激活Nav1.7通道的情况下，TTX对Nav1.7通道的IC50值为14.5nM。以上结果表明该细胞模型可以很好地反映药物对Nav1.7通道的作用，适用于进行药物对Nav1.7通道的体外评价。

[0050] (2)药物对Nav1.7通道的作用

[0051] 将上述稳定转染Nav1.7的CHO细胞接种至96孔黑色底透培养板中，每孔2×104个细胞，细胞使用FLIPR Membrane Potential Blue染料常温孵育30min，将培养板放置于FLIPR-TERA仪器中，在开始检测120s时分别加入7个浓度(30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0μM)溶于1体积‰DMSO中的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6，上述化合物的结构如表1所示，并于420s时加入ATX(10nM)，通过FLIPR-TERA仪器检测500s，激发波长510_545nm，发射波长565_625nm的荧光信号，并且根据量效曲线下面积计算上述化合物对Nav1.7通道的半数抑制浓度(IC50)，结果如表2所示。

[0052] 表1.化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的结构式。

[0053]

[0054] 表2.化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6对Nav1.7通道的半数抑制浓度(IC50)。

[0055]化合物 IC50
化合物1 56.2μM
化合物2 9.1μM
化合物3 3.38μM
化合物4 1.28μM
化合物5 1.05μM
化合物6 5.03μM

[0056] 实施例2

[0057] 本实施例用于说明本发明提供的多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗神经性疼痛药物中的应用。

[0058] 大鼠慢性坐骨神经压迫性损伤(chronic constriction injury，CCI)模型[0059] 1.实验动物

[0060] 购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场的25只雄性SD大鼠，实验前将大鼠放置在安静、避强光的环境中饲养一周以适应环境，光照与黑暗时间比为1∶1，室温控制在25℃，湿度55％，大鼠能够自由进食和饮水。

[0061] 2.实验药品

[0062] 化合物4                          实验室自行制备

[0063] 10％水合氯醛                    (批号：20130426，国药集团化学试剂有限公司)

[0064] 0.9％氯化钠溶液                 (批号：20023809，开开援生物制药股份有限公司)

[0065] 3.实验器材和设备

[0066] 眼科手术器械一套                (南京华璧科学仪器有限公司)

[0067] 4-0铬制肠线                     (上海浦东金环医疗用品股份有限公司)[0068] Von Frey hairs test纤维丝刺激针 (上海玉研科学仪器有限公司)

[0069] PL-200型全自动热痛刺激仪        (成都泰盟科技有限公司)

[0070] 玻璃分针、消毒纱布、手巾、棉签、微量注射器。

[0071] 4.实验方法

[0072] 4.1随机分组

[0073] 取5只笼子用标记笔依次编号，动物临时编号为第一笼1～5号，第二笼6～10号，依次至第5笼21～25号，随意抓取大鼠称重，每笼放入5只，并用苦味酸溶液按左前脚1、左后脚2、右前脚3、右后脚4、无标记为5的次序在大鼠的毛皮上临时记号。运用Excel软件将大鼠体重按从大到小排序，从统计学教科书中获取随机数字表，对动物进行重新分组。

[0074] 4.2建立模型

[0075] 腹腔注射10％水合氯醛(100mg/kg)。待大鼠麻醉后，选择左后侧肢，常规备皮，消毒，切开皮肤及皮下组织，钝性分离肌肉和坐骨神经后，以4-0铬制肠线间隔1mm松结扎4道，至神经外膜稍受压，但不影响神经外膜血运为止，打结时可见小腿肌肉轻微震颤，冲洗后逐层缝合，假手术组除不结扎坐骨神经外，其余操作相同。

[0076] 4.3测痛阈

[0077] 4.3.1测量机械缩足反射阈值

[0078] 手术后1天开始，间隔1天使用Von Frey检测大鼠的机械缩足反射阈值(Paw withdraw mechanical threshold，PWMT)结果见图4，将大鼠放置于升高的网格状金属网上，盖以透明的有机玻璃罩。先让大鼠适应15分钟，以一组强度递增的纤维丝对大鼠手术同侧足底以及对侧足底进行机械刺激，观察大鼠是否出现缩足反应，开始使用小力度刺激大鼠后趾，若大鼠没有缩足反应，则选择其上的一级力度刺激后趾；若有缩足反应，则选择其下的一级力度刺激后趾。照此下去，在出现这一次与上一次不同的反应(有缩足反应至无缩足反应或无缩足反应至有缩足反应)时，继续刺激3次，包括以前的2次，一共5次，即可完成机械缩足反射阈值测定。若需要使用的力度超过15g或者低于1g，则该侧机械缩足反射阈值直接记为15g或1g。

[0079] 使用微量注射器于鞘内给予溶剂对照(5体积％DMSO，5体积％吐温80，90体积％生理盐水)，化合物4低剂量(5μg/10μl/只)，中剂量(10μg/10μl/只)，高剂量(20μg/10μl/只)，于给药后0h、2h、4h、6h、8h测量机械缩足反射阈值。结果如表3和图4所示。

[0080] 表3.化合物4对坐骨神经缩窄性疼痛机械痛阈敏感化的影响(n＝5)(均数±标准差)。

[0081]组别 剂量(μg/只) 0h机械痛阈 2h机械痛阈 4h机械痛阈 6h机械痛阈 8h机械痛阈假手术组 - 10.85±4.32 13.23±3.855 14.15±3.051 13.54±2.933 13.69±2.53
溶剂对照 - 1.33±0.49 2±1.51 2.6±2.25 2±1.51 1.87±1.73
化合物4 5 1.67±0.89 5.17±1.34* 9.75±5.01*** 4.00±2.26 2.33±1.07
化合物4 10 2.8±2.00 5.67±3.74** 6.87±4.91*** 2.13±1.06 1.60±0.83
化合物4 20 2.00±1.50 8.67±4.51*** 6.06±4.44** 5.50±5.07** 2.56±2.87

[0082] 注：分析结果中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001与溶剂对照组相比(使用ANOVA检验)。

[0083] 4.3.2测量热缩足反射潜伏期

[0084] 热缩足反射潜伏期(Paw withdraw thermal latency，PWTL)，结果见图5。手术后1天开始，间隔1天，在安静的实验室中，保持实验室室内温度稳定于22℃，将有机玻璃箱置于6mm厚的玻璃板上，将大鼠置于有机玻璃箱内，待大鼠适应15分钟后，用可移动光束照射大鼠损伤侧足底中部，从光束照射开始到大鼠出现抬腿或舔足的时间为PWTL(单位：S)，自动切断时间设置为30s，用于防止光束照射过久导致组织损伤，设定光强度刺激为30％，使PWTL基础值为14s左右，并在实验进展过程中保持一致。每只大鼠测定3次，间隔5分钟，取平均值。

[0085] 使用微量注射器于鞘内给予对照溶剂(5体积％DMSO，5体积％吐温80，90体积％生理盐水)，化合物4低剂量(5μg/10μl/只)，中剂量(10μg/10μl/只)，高剂量(20μg/10μl/只)后0h、2h、4h、6h、8h测量热缩足反射潜伏期。结果如表4和图5所示。

[0086] 5.统计学方法统计学处理用GraphPad Prism 5统计软件包进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±S)表示，组内、组间比较采用双因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

[0087] 表4.化合物4对坐骨神经缩窄性疼痛热痛阈敏感化的影响(n＝5)(均数±标准差)[0088]组别 剂量(μg/只) 0h热痛阈 2h热痛阈 4h热痛阈 6h热痛阈 8h热痛阈
假手术组 0 20.98±3.33 16.41±0.99 16.49±1.77 17.61±3.38 18.55±4.63
溶剂对照 0 13.11±2.35 14.93±2.01 12.99±1.96 15.28±4.32 13.44±3.60
化合物4 5 16.33±4.57 17.08±5.15 13.56±1.93 17.37±4.54 16.88±2.65
化合物4 10 15.01±2.61 20.3±4.90*** 15.87±4.33 15.89±3.85 11.82±4.54
化合物4 20 16.54±3.42 15.67±3.81 18.97±7.47*** 18.29±4.43 15.51±3.33

[0089] 注：分析结果中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001比较溶剂对照组(使用ANOVA检验)。

[0090] 实施例3

[0091] 本实施例用于说明本发明提供的多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗疼痛药物中的应用。

[0092] 小鼠醋酸扭体实验

[0093] 1.实验动物

[0094] 购自南通大学实验动物中心的25只ICR小鼠，体重18-22g，雌雄各半，实验前将小鼠放置在安静、避强光的环境中饲养3天以适应环境，光照与黑暗时间比为1∶1，室温控制在25℃，湿度55％，小鼠能够自由进食和饮水。

[0095] 2.实验药品

[0096] 阿司匹林           (南京华建化工有限公司)

[0097] 化合物4

[0098] 0.9％氯化钠溶液    (批号：20023809，开开援生物制药股份有限公司)

[0099] 醋酸               (货号：10120311333南京化学试剂有限公司)

[0100] 3.实验器材和设备

[0101] 微量注射器         (上海高鸽工贸有限公司)

[0102] 4.实验方法

[0103] 4.1随机分组

[0104] 取5只笼子用标记笔依次编号，动物临时编号为第一笼1～5号，第二笼6～10号，依次至第5笼21～25号，随意抓取小鼠称重，每笼放入5只，并用苦味酸溶液按左前脚1、左后脚2、右前脚3、右后脚4、无标记为5的次序在小鼠的毛皮上临时记号。运用Excel软件将小鼠体重按从大到小排序，从统计学教科书中获取随机数字表，对动物进行重新分组。

[0105] 4.2小鼠醋酸扭体实验

[0106] 给予阿司匹林组(300mg/kg)灌胃给药，溶剂对照(5体积％DMSO，5体积％吐温80，90体积％生理盐水)，化合物4(1mg/kg)，化合物4(2mg/kg)，化合物4(5mg/kg)，化合物4(10mg/kg)腹腔注射给药。于给药后2小时，同一位置腹腔注射0.6％的醋酸溶液0.1ml/10g。
观察扭体反应潜伏期并计算15min内小鼠扭体次数。

[0107] 评价标准：注射醋酸溶液后2-3min，小鼠出现腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高跷等行为反应，称为扭体反应。比较溶剂对照组、阳性药阿司匹林组、化合物4给药组的差异情况。扭体反应潜伏期结果如表5和图6所示。扭体反应次数结果如表6和图7所示。

[0108] 5.统计学方法统计学处理用GraphPad Prism 5统计软件包进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±S)表示，组内、组间比较采用双因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

[0109] 表5.化合物4对醋酸所致小鼠扭体潜伏期的影响(n＝10)

[0110]组别 剂量(mg/kg) 扭体潜伏期(s)(均数±标准差)
溶剂对照组 0 256.8±74.07
阿司匹林组 300 453.0±101.1
化合物4 1 289.3±57.17
化合物4 2 330.3±126.5
化合物4 5 455.4±201.8
***
化合物4 10 767.4±108.2

[0111] 注：分析结果中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001比较溶剂对照组(使用ANOVA检验)。

[0112] 表6.化合物4对醋酸所致小鼠扭体次数的影响(n＝10)

[0113]组别 剂量(mg/kg) 扭体次数(均数±标准差)
溶剂对照组 0 30.75±7.14
阿司匹林组 300 18.6±5.98
化合物4 1 21.00±1.41
化合物4 2 17.25±13.94
化合物4 5 13.60±6.148*
化合物4 10 1.40±1.14***

[0114] 注：分析结果中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001比较溶剂对照组(使用ANOVA检测)。

[0115] 实施例4

[0116] 本实施例用于说明本发明提供的多氧取代环己烯类化合物在制备预防或治疗伤害性疼痛药物中的应用。

[0117] 小鼠热水甩尾实验

[0118] 1.实验动物

[0119] 购自南通大学实验动物中心的25只ICR小鼠，体重18-22g，雌雄各半，实验前将小鼠放置在安静、避强光的环境中饲养3天以适应环境，光照与黑暗时间比为1∶1，室温控制在25℃，湿度55％，小鼠能够自由进食和饮水。

[0120] 2.实验药品

[0121] 阿司匹林          (南京华建化工有限公司)

[0122] 化合物4           实验室自行制备

[0123] 0.9％氯化钠溶液   (批号：20023809，开开援生物制药股份有限公司)

[0124] 3.实验器材和设备

[0125] 微量注射器        (上海高鸽工贸有限公司)

[0126] 4.实验方法

[0127] 4.1随机分组

[0128] 取5只笼子用标记笔依次编号，动物临时编号为第一笼1～5号，第二笼6～10号，依次至第5笼21～25号，随意抓取小鼠称重，每笼放入5只，并用苦味酸溶液按左前脚1、左后脚2、右前脚3、右后脚4、无标记为5的次序在小鼠的毛皮上临时记号。运用Excel软件将小鼠体重按从大到小排序，从统计学教科书中获取随机数字表，对动物进行重新分组。

[0129] 4.2小鼠热水甩尾实验

[0130] 将小鼠尾下部垂直浸入45±1℃的恒温水浴锅(型号：HHS数显水浴锅；产地：杭州蓝天化验仪器厂)内，浸入长度为3cm；记录小鼠尾部回缩出水面的潜伏期作为测痛指标。首先测定各组小鼠的基础痛阈，正常值应当在5-20s，痛阂小于5s或大于20s者剔除；每只小鼠每隔15min测1次基础痛阈值，取3次测定数值的平均痛阈值作为基础痛阈。符合标准的小鼠，随机分组。对符合标准的小鼠进行热水甩尾实验前2h给药，200mg/kg阿司匹林组灌胃给药，溶剂对照(5体积％DMSO，5体积％吐温80，90体积％生理盐水)、化合物41mg/kg，2mg/kg，5mg/kg，10mg/kg腹腔注射给药。为防止尾部烫伤，本实验截止时间为30s，用药后小鼠潜伏期达到者停止实验并以30s计。

[0131] 小鼠尾部末端对热刺激非常敏感，将其浸入45±1℃热水中一定时间后会产生回缩出水面反应，上述反应被确定为反映疼痛强度的指标。将小鼠尾部浸入热水中到其出现上述反应为止的时间定义为痛阈。镇痛药可延长小鼠出现痛反应的时间，反映其镇痛效果，因此这一模型可用于评价药物的镇痛效果。结果如表7和图7所示。

[0132] 5.统计学方法统计学处理用GraphPad Prism 5统计软件包进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±S)表示，组内、组间比较采用双因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

[0133] 表7.化合物4在热水甩尾实验中对热刺激所致小鼠尾热水浴潜伏期影响(n＝10)[0134]

[0135] 注：分析结果中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001比较同组给药前热水浴潜伏期(s)(使用ANOVA检测)。

[0136] 由上述实施例的结果可以看出，本发明所述的多样取代环己烯类化合物对Nav1.7通道具有明显的抑制作用，并且可以显著性改善大鼠慢性坐骨神经压迫性损伤导致的机械痛敏感，减少小鼠由醋酸导致的扭体次数及延长扭体潜伏期，延长小鼠在热水中甩尾的时间。由此可知，将本发明所述的多氧取代环己烯类化合物应用于制备预防或治疗疼痛的药物中具有很好的开发前景。

[0137] 以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0138] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0139] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。