一种用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶

摘要

本发明涉及医药领域，具体涉及一种用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶。该皮下注射用原位凝胶医药学上可接受的辅料和以下重量比的原料制成：盐酸阿霉素25~50重量份、HIV‑1‑TAT蛋白47‑57多肽片段1~4重量份。上述原料与泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M和去离子水制备的原位凝胶具有良好的缓释效果。其中HIV‑1‑TAT蛋白47‑57多肽片段能够显著提高盐酸阿霉素的抗肿瘤效果，降低其毒性作用。

权利要求

1.一种用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶，其特征在于，所述皮下注射用原位凝胶由医药学上可接受的辅料和以下重量比的原料制成：盐酸阿霉素25～50重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段1～4重量份；所述医药学上可接受的辅料由泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M和去离子水组成；所述皮下注射用原位凝胶的制备方法包括如下步骤：

1)取处方量盐酸阿霉素、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为20％，泊洛沙姆P188的重量百分比为1.2％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.3％；

3)将配液B液4℃下溶胀24h， 过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

2.根据权利要求1所述的皮下注射用原位凝胶，其特征在于，所述原料的重量比为：盐酸阿霉素28重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段2重量份。

3.根据权利要求1所述的皮下注射用原位凝胶，其特征在于，所述原料的重量比为：盐酸阿霉素48重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段3重量份。

4.根据权利要求1所述的皮下注射用原位凝胶，其特征在于，所述原料的重量比为：盐酸阿霉素34重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段2重量份。

5.根据权利要求1所述的皮下注射用原位凝胶，其特征在于，所述原料的重量比为：盐酸阿霉素40重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段3重量份。

说明书

一种用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及一种用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶。

背景技术

[0002] 骨肉瘤是儿童和青少年常见的原发骨恶性肿瘤，其发病率约为3/100万，其中约 80％～90％的骨肉瘤发生于四肢长管状骨干骺端，尤其是股骨远端、胫骨近端和肱骨近端。 
20世纪70年代以前，对骨肉瘤一般采取截肢手术的方法进行治疗，其5年生存率仍不足
20％，且截肢给患者生活带来极大的不便。

[0003] 化疗药物的出现，为骨肉瘤的治疗提供了新的方法。阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤、长春新碱、环磷酰胺等均对骨肉瘤表现出良好的治疗作用，可显著延长骨肉瘤患者生存期(牛晓辉,徐海荣.骨肉瘤的化疗进展.中国癌症杂志.2012年第22卷第9期，第663-668页)。其中阿霉素和顺铂对骨肉瘤的治疗效果更佳，已被广泛用于骨肉瘤的治疗，术前及术后也可联合手术使用(汪新媛,田京.骨肉瘤化疗研究进展.国际骨科学杂志.2010年第31卷第3期.159- 161页.)。

[0004] 然而，化疗药物通常临床用药剂量较大，且具有显著的毒性作用，如阿霉素存在心脏毒性、骨髓抑制、消化道和肾脏毒性等，其中以心脏毒性尤为危险。阿霉素引起心脏毒性的机制目前尚不明确。

[0005] 国内已报道水飞蓟宾、蛇床子素等中药中发现的活性成分对阿霉素心肌毒性具有保护作用。但，迄今为止，尚缺乏理想的药物能够降低阿霉素毒性，同时维持或增强其疗效。

[0006] 改变给药途径和提高药物对瘤组织的靶向性是避免化疗药物在体内向非瘤组织分布，提高其疗效，提高其安全性的方法之一。

发明内容

[0007] 针对上述现有技术，本发明的目的提供一种用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶。

[0008] 为实现上述的目的，本发明采用的技术方案为：

[0009] 一种用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶，由医药学上可接受的辅料和以下重量比的原料制成：盐酸阿霉素25～50重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段1～4重量份。

[0010] 作为本发明的皮下注射用原位凝胶的一个优选方案，所述原料的重量比为：盐酸阿霉素 28重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段2重量份。

[0011] 作为本发明的皮下注射用原位凝胶的另一优选方案，所述原料的重量比为：盐酸阿霉素48重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段3重量份。

[0012] 作为本发明的皮下注射用原位凝胶的又一优选方案，所述原料的重量比为：盐酸阿霉素 34重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段2重量份。

[0013] 作为本发明的皮下注射用原位凝胶的再一优选方案，所述原料的重量比为：盐酸阿霉素 40重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段3重量份。

[0014] 作为本发明技术方案的进一步优化，上述皮下注射用原位凝胶中所述医药学上可接受的辅料包括泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M和去离子水；所述皮下注射用原位凝胶的制备方法包括如下步骤：

[0015] 1)取处方量盐酸阿霉素、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段加入去离子水，制成配液 A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0016] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为18～40％，泊洛沙姆P188的重量百分比为1.0～3.0％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.2～1.0％；

[0017] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0018] 作为上述制备方法的进一步优化，上述步骤2)中，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为20％，泊洛沙姆P188的重量百分比为1.2％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.3％。

[0019] 本发明的技术方案中所述的HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段，氨基酸序列为 YGRKKRRQRRR，CAS号为191936-91-1，属于已上市产品，这是本领域技术人员所公知的。

[0020] 在治疗过程中，可将本发明的皮下注射用原位凝胶通过瘤周皮肤进行皮下注射给药或在肿瘤患处进行瘤内注射。局部给药尤其是皮下注射给药在患处附近或患病部位给药更有利于药物到达患处，这对本领域技术人员而言是公知的常识。

[0021] 本发明的发明人在研究中发现，HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段对盐酸阿霉素具有显著的增效减毒作用，其中采用原位凝胶形式进行皮下注射给药的增效减毒效果更优。本发明的用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶对阿霉素具有缓释效果，能够提高药物在骨肉瘤组织的分布，提高阿霉素的疗效，同时降低阿霉素的毒性。

具体实施方式

[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步的解释。应当理解的是，以下实施例仅用于解释本发明，而不是限制本发明的保护范围。

[0023] 实施例1用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的制备

[0024] 1)取盐酸阿霉素280g、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段20g，加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0025] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为20％，泊洛沙姆P188的重量百分比为1.2％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.3％；

[0026] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0027] 实施例2用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的制备

[0028] 1)取盐酸阿霉素480g、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段30g，加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0029] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为20％，泊洛沙姆P188的重量百分比为1.2％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.3％；

[0030] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0031] 实施例3用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的制备

[0032] 1)取盐酸阿霉素340g、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段20g，加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0033] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为20％，泊洛沙姆P188的重量百分比为1.2％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.3％；

[0034] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0035] 实施例4用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的制备

[0036] 1)取盐酸阿霉素400g、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段30g，加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0037] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为20％，泊洛沙姆P188 的重量百分比为1.2％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.3％；

[0038] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0039] 实施例5用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的制备

[0040] 1)取盐酸阿霉素290g、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段30g，加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0041] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为20％，泊洛沙姆P188 的重量百分比为1.2％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.3％；

[0042] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0043] 实施例6用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的制备

[0044] 1)取盐酸阿霉素290g、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段20g，加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0045] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为20％，泊洛沙姆P188 的重量百分比为1.2％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.3％；

[0046] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0047] 实施例7用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的制备

[0048] 1)取盐酸阿霉素290g、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段20g，加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0049] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为20％，泊洛沙姆P188 的重量百分比为1.2％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.3％；

[0050] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0051] 实施例8用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的制备

[0052] 1)取盐酸阿霉素300g、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段20g，加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0053] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为39％，泊洛沙姆P188 的重量百分比为2.6％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.9％；

[0054] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0055] 实施例9用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的制备

[0056] 1)取盐酸阿霉素300g、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段20g，加入去离子水，制成配液A，配液A中阿霉素浓度为10mg/ml；

[0057] 2)向配液A中依次加入泊洛沙姆P407、泊洛沙姆P188、羟丙基甲基纤维素K4M，充分搅拌，分散均匀，得配液B，配液B中泊洛沙姆P407的重量百分比为29％，泊洛沙姆P188 的重量百分比为1.8％，羟丙基甲基纤维素K4M的重量百分比为0.5％；

[0058] 3)将配液B液4℃下溶胀24h,过0.22μm微孔滤膜，分装即得。

[0059] 实施例10用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的缓释效果研究

[0060] SPF级雄性昆明小鼠，体重20～26g。取昆明小鼠60只，随机分为10组，每组6只，用棉球沾8％硫化钠水溶液(7％淀粉、4％蔗糖、5％甘油、1％硼砂)将动物背毛充分润湿，毛根变色后用纸巾沿同一方向将被毛抹去，温水洗净皮肤表面，分别于脊柱两侧皮肤皮下注射实施例1-9制备的皮下注射用原位凝胶20μl(每侧10μl)或市售注射用盐酸阿霉素(山西普德药业，注射用水稀释，于脊柱两侧皮肤皮下注射，每侧0.1mg，相当于皮下注射用原位凝胶10μl中盐酸阿霉素的含量)。

[0061] 注射完毕后于给药后第4、8、36、72、144h尾静脉采血。按照文献方法(文旭,范健, 缪玉山.大鼠血浆及组织中阿霉素含量测定方法(HPLC内标法)的建立.南京铁道医学院学报. 2001年第20卷第2期，第77-79页.)测定血浆中盐酸阿霉素含量。

[0062] 色谱条件：色谱柱: C18柱(150mm×3.9mm,粒径为4μm)；流动相：甲醇- 乙腈-0.01mol/L磷酸二氢铵-冰醋酸(体积比为50∶22∶28∶0.6)；流速:1.0ml/min；检测波长:激发波长为479nm，发射波长为587nm；柱温：30℃。

[0063] 血浆中样品的提取与分离：取0.3ml血浆,加入30μl甲醇及30μl柔红霉素,混合均匀,用氯仿∶甲醇(体积比为4∶1)萃取液2ml提取，密塞，混合3min,3000rpm离心10min ，定量吸取下层有机相，26℃下氮气吹干，残留物用60μl甲醇溶解，吸取50μl进样，记录色谱峰。各时间点大鼠血浆中盐酸阿霉素含量结果如下(μg/l，数据为平均值，n＝6)：

[0064]4h 8h 36h 72h 144h
实施例1 74.9 46.2 33.5 11.8 3.4
实施例2 71.5 42.8 24.2 9.1 4.7
实施例3 61.8 37.7 22.1 12.6 3.1
实施例4 73.0 41.4 28.7 14.1 5.3
实施例5 85.1 30.9 9.5 3.2 0
实施例6 53.6 26.1 14.9 5.4 0
实施例7 66.8 31.2 11.0 6.9 0
实施例8 90.1 43.5 19.9 4.0 0
实施例9 79.3 40.7 23.3 8.1 0
市售 10.9 6.1 4.2 0 0

[0065] 由上述结果可见，皮下注射给药后，实施例1-9的原位凝胶中盐酸阿霉素释放速度显著慢于市售注射用盐酸表阿霉素。其中实施例1-4制备的原位凝胶注射后144h血浆中盐酸表阿霉素仍维持较高浓度，实施例5-9制备的原位凝胶注射后72h血浆中盐酸表阿霉素仍维持较高浓度，而市售注射用盐酸阿霉素注射后72h血浆中已无法检测到盐酸阿霉素。说明实施例1-9制备的原位凝胶具有明显的缓释效果。

[0066] 实施例11用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的抗肿瘤效果研究[0067] 为验证不同组方皮下注射用原位凝胶的抗肿瘤效果，本研究制备了以下对比例：

[0068] 对比例1：组方与实施例1相似，区别在于组方不含HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段；制备方法同实施例1，区别在于步骤1)不加入HIV—1-TAT蛋白47-57多肽片段。

[0069] 对比例2：组方与实施例1相似，区别在于组方中HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量为9重量份，制备方法同实施例1。

[0070] 对比例3：组方与实施例1相似，区别在于组方中HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量为20重量份，制备方法同实施例1。

[0071] 对比例4：组方与对比例3相似，区别在于组方中不含盐酸阿霉素，制备方法同对比例 3，区别在于步骤1)不加入盐酸阿霉素。

[0072] 骨肉瘤动物模型建立方法如下：

[0073] SPF级Wistar大鼠，雄性，体重240～300g造模前适应性饲养14天。

[0074] 大鼠骨肿瘤细胞系UMR106(中科院上海生化与细胞生物学研究所上海细胞库提供)37 ℃复苏，用含10％胎牛血清1640培养液稀释细胞浓度为1×106/ml，接种于25ml培养瓶中，隔日换液，经0.2％胰蛋白酶消化、传代、繁殖。取对数生长期的骨肉瘤细胞，用无血清1640培养液稀释细胞为5×106/ml，于每只大鼠后肢股骨远端的骨髓腔中注射0.2ml。每天触摸注射部位，从可扪及肿瘤时起，每天测量肿瘤直径，肿瘤直径大于5mm视为造模成功。取造模成功大鼠54只，随机分为9组，每组6只，分别于瘤细胞注射部位，皮下注射实施例1-4或对比例1-4制备的原位凝胶或生理盐水，每3日给药1次，连续给药9次，每次注射剂量以盐酸阿霉素计算为10mg/kg。于首次给药后第1天和第30天测量肿瘤直径，计算抑瘤率，计算公式为：[1-(第30肿瘤直径-第1天肿瘤直径)/第30肿瘤直径] ×100％。实验结果如下：

[0075]  抑瘤率(％，平均值±标准差，n＝6)
实施例1 79.7±10.3 a，b，c
实施例2 72.1±8.5 a，b，c
实施例3 78.0±12.8 a，b，c
实施例4 70.4±21.6 a，b，c
对比例1 41.9±18.3 a，b，c
对比例2 61.8±22.6  a，b，c
对比例3 71.3±15.9 a，b，c
对比例4 14.7±2.7
生理盐水 12.2±1.9

[0076] a：p＜0.05与生理盐水组相比，b：p＜0.05与对比例4相比，c：p＜0.05与对比例1相比。

[0077] 上述结果表明，HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段对骨肉瘤无抑制作用(对比例4)，其抑瘤率与生理盐水组无显著差异。盐酸阿霉素与HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段联合用药后(实施例1-4，对比例2、3)盐酸阿霉素的抗肿瘤作用显著高于盐酸阿霉素单独用药(对比例1)。但HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量的增加并未导致盐酸阿霉素抗肿瘤作用的进一步升高，对比例2、3组的抗肿瘤作用与实施例1无显著差异。由此可见，HIV-1-TAT 蛋白47-57多肽片段在一定用量范围内对盐酸阿霉素由抗肿瘤增效作用。

[0078] 实施例12用于治疗骨肉瘤的皮下注射用原位凝胶的安全性研究

[0079] SPF级雄性昆明小鼠，体重20～26g。取昆明小鼠300只，随机分为5组，每组60只，皮下注射实施例1-4及实施例11中对比例1制备的皮下注射用原位凝胶。每组设定6个剂量，分别为8mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、70mg/kg，每组每个剂量均为10只动物。给药后观察各组动物1周内注射位点红斑、水肿等刺激现象及死亡情况，用 Bliss法计算各组半数致死量LD50。各组动物注射部位未见明显刺激现象。各组动物LD50 值如下(LD50单位为mg/kg)：

[0080]实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1
LD50 39.7mg 42.1mg 39.4mg 36.8mg 26.5mg

[0081] 有上述结果可见，实施例1-4的原位凝胶(加入HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段)其 LD50值显著高于对比例1的原位凝胶，说明HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段能够降低盐酸阿霉素的毒性。