一种用于神经调控的光电转换纳米粒子及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种用于神经调控的光电转换纳米粒子及其制备方法和应用，所述光电转换纳米粒子包括亲水改性的TiO2纳米粒子、和连接于所述亲水改性的TiO2纳米粒子表面的金纳米粒子。本发明的光电转换纳米材料，在405 nm光照下产生光电流，可有效使神经细胞去极化，在癫痫斑马鱼上表现显著的抗癫痫治疗效果。

权利要求

1.一种光电转换纳米粒子，其特征在于，由亲水改性的TiO2纳米粒子、和连接于所述亲水改性的TiO2纳米粒子表面的金纳米粒子组成；所述TiO2纳米粒子为锐钛矿型；所述TiO2纳米粒子的平均直径为15～20 nm，所述金纳米粒子的粒径小于5 nm；所述TiO2纳米粒子与金纳米粒子的质量比为（6～10）:1。

2.根据权利要求1所述的光电转换纳米粒子，其特征在于，所述亲水改性的TiO2纳米粒子是巯基功能化聚乙二醇修饰的TiO2纳米粒子，所述金纳米粒子通过与所述巯基连接而连接于所述TiO2纳米粒子上。

3.根据权利要求2所述的光电转换纳米粒子，其特征在于，所述巯基功能化聚乙二醇是DSPE-PEG2000-SH。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的光电转换纳米粒子，其特征在于，在特定波长光激发下，所述光电转换纳米粒子中的TiO2纳米粒子产生电子空穴对，其中电子流动到所述金纳米粒子上，从而使所述光电转换纳米粒子表面带负电。

5.一种权利要求1至4中任一项所述的光电转换纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采用高温热解法制备疏水TiO2纳米粒子；

（2）用巯基功能化聚乙二醇对疏水TiO2纳米粒子进行改性和修饰；

（3）使金纳米粒子连接到巯基功能化聚乙二醇的巯基上而连接到TiO2纳米粒子表面。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）包括：在疏水TiO2纳米颗粒的氯仿溶液中，加入一定浓度的DSPE-PEG2000-SH氯仿溶液，然后旋转蒸发，再用水清洗。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）包括：将金纳米粒子水溶液加入经巯基功能化聚乙二醇改性的TiO2纳米粒子水溶液中，搅拌一段时间后，进行离心清洗。

8.一种权利要求1至4中任一项所述的光电转换纳米粒子在制备神经调控剂中的应用。

说明书

一种用于神经调控的光电转换纳米粒子及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于纳米生物医学研究领域，涉及一种用于神经调控的光电转换纳米粒子及其制备方法和应用，即利用半导体TiO2在适当波长光照下产生电子空穴对，与TiO2连接的金纳米粒子作为光生电子受体，使TiO2产生的电子流动到金纳米粒子，与神经细胞表面的正电荷相互作用，使神经细胞去极化而达到神经调控的目的，可用于神经细胞功能的研究、神经疾病的治疗等方面。

背景技术

[0002] 大脑是生命体内结构与功能最复杂的器官，多数脑部疾病的发病原因依然不为人们所知。确定与神经疾病相关的细胞群对疾病的治疗具有重大意义，而对单个神经细胞进行精准调控是精确解析脑神经细胞功能、确定发病原因的前提。因此，调控脑神经细胞活动的无损、精准远程控制技术，对神经细胞活动的研究和相关神经疾病的治疗具有极其重要的作用。在已有的神经调控技术中，光刺激是一种可远程调控细胞活动的方式，并且避免了电极刺激的侵入性和低特异性等缺点。例如，有文献报道可通过红外光产热对神经细胞进行刺激。光遗传学是一种光学神经调控的成熟技术，它将遗传工程与光学相结合，用于控制特定神经细胞的活动，为确定它们在调控脑部功能中的角色提供证据。然而，必需且繁杂的靶细胞基因修饰过程限制了光遗传学的广泛应用。

[0003] 生命体的各种感觉和运动功能都是与之对应的神经细胞接收刺激后产生动作电位的结果。当传导过程受阻或失调的神经细胞产生异常神经兴奋时，便会发生运动障碍疾病。研究表明，刺激与疾病相关的脑部神经区域可以缓解症状。目前，主要的神经刺激方式是电极的深层脑部刺激，这种治疗技术已经在临床上用于治疗活动障碍神经疾病，例如帕金斯综合症。然而，电极的长期植入会对组织造成不可逆的损伤。

[0004] 新兴的纳米机器人技术是制备零部件在纳米级别的机械或机器人，灵活的设计可赋予纳米机器人多样化的功能，在生物医学中有广泛应用。一些课题组已经尝试利用纳米机器人进行神经调控，例如，利用碳纳米角和金纳米粒子的光热效应进行神经细胞的刺激。最近，有科学家利用磁热Fe3O4纳米粒子进行深层脑部神经刺激。然而，这种利用热刺激的技术仅对热敏感的细胞(即表达有瞬态电压感受器阳离子通道(TRPV1)的细胞)起作用，极大地限制了其应用范围；另外，热辐射不可避免会对目标区域外的细胞产生刺激，从而极大地降低神经调控精确性。

发明内容

[0005] 本发明的发明人经研究得出以下见解：大脑通过电方式和化学方式进行交流，而电方式是控制细胞功能最为直接、有效的方式。可产生电流的纳米机器人将直接对细胞进行刺激，会成为一种更通用和精确的神经调控方式。半导体在适当波长光照下可以产生电子-空穴对，但电子和空穴在纳秒内复合，无法形成定向电流。如果用贵金属纳米粒子修饰半导体，则贵金属纳米粒子不仅可以作为光生电子受体促进电子和空穴的分离，还可以通过表面等离子共振效应，使宽禁带半导体的吸收扩展到可见光区域。另外，TiO2纳米粒子和金纳米粒子由于其生物相容性，在生物医学领域受到越来越多的关注。

[0006] 针对现有技术存在的问题以及基于发明人的以上见解，本发明的目的是提供一种用于神经调控的纳米材料，利用纳米材料的光电转换效应使神经细胞在电刺激下去极化，克服了利用热刺激方式进行神经调控的应用范围窄、精确性低及电极刺激侵入性的缺点，提供一种更通用、精确高效的神经调控技术。

[0007] 一方面，本发明提供一种光电转换纳米粒子(简称NCs)，其包括亲水改性的TiO2纳米粒子、和连接于所述亲水改性的TiO2纳米粒子表面的金纳米粒子。

[0008] 在特定波长(例如405nm)光激发下，NCs中的TiO2产生电子空穴对，其中电子流动到氧化钛表面的金纳米粒子上，当NCs粘附于神经细胞膜表面时，电子流会与神经细胞膜外的正电荷相互作用，使神经细胞迅速发生去极化。该光电转换纳米粒子具有以下特点：1)可在可见光(例如405nm光)照射下产生电流；2)由于TiO2纳米粒子和金纳米粒子均具有生物相容性，且TiO2纳米粒子进行了亲水化改性，因此其生物相容性良好，能有效使神经细胞发生去极化；3)在癫痫斑马鱼上表现出显著的抗癫痫治疗效果。综上所述，本发明是一种有望实现无损、精确调控神经的新技术，对未来更加精细的脑功能研究的实验设计和神经疾病的新型治疗技术的开发具有重要的借鉴意义。

[0009] 较佳地，所述亲水改性的TiO2纳米粒子是巯基功能化聚乙二醇修饰的TiO2纳米粒子，所述金纳米粒子通过与所述巯基连接而连接于所述TiO2纳米粒子上。巯基功能化聚乙二醇一方面可以通过聚乙二醇对TiO2纳米粒子进行亲水改性，同时又可以提供表面官能团巯基修饰，从而使金纳米粒子连接于TiO2纳米粒子上。

[0010] 优选地，所述巯基功能化聚乙二醇是DSPE-PEG2000-SH。DSPE-PEG2000-SH兼具了磷脂的两亲性和PEG的亲水高分子特性，且带有巯基，从而易于对疏水性TiO2纳米粒子进行亲水改性和提供表面官能团巯基修饰。

[0011] 较佳地，所述TiO2纳米粒子为锐钛矿型。根据本发明，可以更为有效地产生电子空穴对。

[0012] 较佳地，所述TiO2纳米粒子的平均直径为15～20nm。根据本发明，可以与金纳米粒子形成粒径较小核壳结构的纳米粒子。

[0013] 较佳地，所述金纳米粒子的粒径小于5nm。根据本发明，可以较为均匀地分散在TiO2纳米粒子周围形成核壳结构的纳米粒子。

[0014] 较佳地，TiO2纳米粒子与金纳米粒子的质量比为(6～10):1。根据本发明，可以较为有效地导出电子流。

[0015] 另一方面，本发明还提供上述光电转换纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

[0016] (1)采用高温热解法制备疏水TiO2纳米粒子；

[0017] (2)用巯基功能化聚乙二醇对疏水TiO2纳米粒子进行改性和修饰；

[0018] (3)使金纳米粒子连接到巯基功能化聚乙二醇的巯基上而连接到TiO2纳米粒子表面。

[0019] 本发明的制备方法简单易行、成本低、效率高，低污染且重复性好，可以进行大规模应用。

[0020] 较佳地，步骤(2)包括：在疏水TiO2纳米颗粒的氯仿溶液中，加入一定浓度的DSPE-PEG2000-SH氯仿溶液，然后旋转蒸发，再用水清洗。

[0021] 较佳地，步骤(3)包括：将金纳米粒子水溶液加入经巯基功能化聚乙二醇改性的TiO2纳米粒子水溶液中，搅拌一段时间后，进行离心清洗。

[0022] 再一方面，本发明还提供上述光电转换纳米粒子在制备神经调控剂中的应用。

[0023] 本发明的光电转换纳米材料，在405nm光照下产生光电流，可有效使神经细胞去极化，在癫痫斑马鱼上表现显著的抗癫痫治疗效果。与传统的刺激方式相比，具有无损、精确性高、响应时间快的优点。该技术可用于更加精细的脑功能实验研究和部分神经疾病的高效治疗。

附图说明

[0024] 图1为本发明实施例1所制得的TiO2疏水纳米颗粒分散于环己烷中的透射电镜(TEM)照片；

[0025] 图2为本发明实施例1所制得的TiO2纳米颗粒的XRD图谱；

[0026] 图3为本发明实施例1所制得的Au纳米颗粒分散于水中的透射电镜(TEM)照片；

[0027] 图4为本发明实施例1所制得的NCs的分散于水中的透射电镜(TEM)照片；

[0028] 图5为本发明实施例1所制得的NCs的紫外可见吸收光谱；

[0029] 图6为本发明实施例1所制得的NCs的在间歇405nm光照下的i-t曲线；

[0030] 图7为本发明实施例1所制得的NCs的细胞毒性实验结果，每一组柱状图中，左边指NCs，右边指NCs+405nm光照；

[0031] 图8为本发明实施例1所制得的NCs使细胞去极化过程中的细胞电位成像(125μg/mL)：(a)细胞膜电位荧光染料的实时荧光强度变化；(b)细胞膜电位荧光染料的最大荧光强度变化；

[0032] 图9为本发明实施例1所制得的NCs使细胞去极化过程中的钙离子荧光成像(125μg/mL)：(a)钙离子荧光染料的实时荧光强度变化；(b)钙离子荧光染料的最大荧光强度变化；

[0033] 图10为本发明实施例1所制得的NCs在细胞上的吞噬情况：a–d分别为培养30min,1h,2h,4h的结果，第一到四列分别为DAPI的荧光，FITC的荧光，亮场图像和融合图像；

[0034] 图11为本发明实施例1所制得的NCs在斑马鱼上进行抗癫痫作用评价时各组斑马鱼的运动轨迹图：(a)正常斑马鱼1h内的运动轨迹；(b)癫痫斑马鱼注射PBS后1h内的运动轨迹；(c)癫痫斑马鱼注射NCs后1h的运动轨迹；(d)癫痫斑马鱼进行405nm光照射2min后1h内的运动轨迹；(e)癫痫斑马鱼注射NCs并进行405nm光照射2min后1h内的运动轨迹，(黑色线(参见(a)中的点状线)代表运动速度小于4mm/sec的慢速运动轨迹，绿色线(参见图中圆圈的背景色)代表运动速度大于4mm/sec小于20mm/sec的中速运动轨迹，红色线(参见(c)中颜色最深的线)代表运动速度大于20mm/sec快速运动轨迹)；

[0035] 图12为本发明实施例1所制得的NCs在斑马鱼上进行抗癫痫作用评价时各组斑马鱼的快速运动距离，其中I：正常斑马鱼1h内以速度大于20mm/sec运动的距离；II：癫痫斑马鱼注射PBS后1h内以速度大于20mm/sec运动的距离；III：癫痫斑马鱼注射NCs后1h内以速度大于20mm/sec运动的距离；IV：癫痫斑马鱼在405nm光照2min后1h内以速度大于20mm/sec运动的距离；V：癫痫斑马鱼注射NCs并在405nm光照2min后1h内以速度大于20mm/sec运动的距离；

[0036] 图13为本发明的NCs的结构及其作用机理的示意图。

具体实施方式

[0037] 以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

[0038] 本发明设计了一种由表面修饰金纳米粒子的TiO2纳米粒子组成的光电转换纳米粒子(NCs)。优选地，其由TiO2纳米粒子经亲水改性后连接金纳米粒子而得。该NCs可将光能转换为电。在特定波长光激发下，NCs中的TiO2产生电子空穴对，其中电子流动到TiO2表面的金纳米粒子上。当NCs粘附于神经细胞表面时，电子流与神经细胞膜外的正电荷相互作用，使神经细胞迅速发生去极化。

[0039] 可以通过在TiO2纳米粒子表面连接巯基功能化聚乙二醇来实现TiO2纳米粒子的亲水改性。同时其中的巯基可以为金纳米粒子提供连接位点。该巯基功能化聚乙二醇包括但不限于DSPE-PEG2000-SH。其中DSPE可以与TiO2纳米粒子(尤其是疏水的TiO2纳米粒子)连接，PEG2000对TiO2纳米粒子进行亲水改性，金纳米粒子通过配位作用与SH连接而连接于TiO2纳米粒子上。

[0040] NCs中的TiO2纳米粒子优选为锐钛矿型。TiO2纳米粒子的平均直径优选为15～20nm。NCs中的金纳米粒子的粒径优选为小于5nm。另外，NCs中，TiO2纳米粒子与金纳米粒子的质量比可为(6～10):1。

[0041] 图13示出NCs的结构以及NCs的作用机理的示意图。如图13所示，多个金纳米粒子均匀分布于TiO2纳米粒子表面，二者之间通过巯基功能化聚乙二醇(例如DSPE-PEG2000-SH)连接。当NCs材料粘附于神经细胞膜表面时，在特定波长(例如405nm)光照下，TiO2可产生电子-空穴对，TiO2表面的金纳米粒子起着光生电子受体的功能，TiO2产生的光生电子流动到金纳米粒子上，使NCs表面带负电，并与神经细胞外表面的正电荷相互作用，使神经细胞去极化，从而起到神经调控的作用。该去极化过程可用膜电位荧光染料和钙离子荧光染料监控、表征。

[0042] 本发明的NCs的可通过如下方法制备：首先制备TiO2疏水纳米颗粒，然后用巯基功能化聚乙二醇对TiO2进行改性和修饰，最后将金纳米粒子连接到经巯基修饰的TiO2纳米粒子表面。以下，具体说明本发明的NCs的制备方法。

[0043] TiO2疏水纳米颗粒可通过高温热解法制备。在一个示例中，TiO2疏水纳米颗粒的制备方法包括：

[0044] 将钛盐溶于油酸和十八烯中，得到前驱体溶液；

[0045] 将第一部分前驱体溶液加入油胺、十八烯和油酸的混合溶液中，于280～300℃保温5～15℃分钟，以形成晶种；

[0046] 将第二部分前驱体溶液缓慢注入反应体系中，加入完毕后，自然冷却；

[0047] 冷却到室温后，分离出TiO2纳米离子并清洗，即可得到TiO2疏水纳米颗粒。

[0048] 优选地，TiO2疏水纳米颗粒的制备过程在保护气氛下进行。

[0049] 在一个示例中，采用高温热解法制备TiO2疏水纳米颗粒的过程包括如下步骤。

[0050] a)在四氟化钛中加入油酸和十八烯，在80℃下加热并搅拌，以促进四氟化钛的溶解，所得溶液为前驱体溶液；

[0051] b)在烧瓶中放入油胺、十八烯和油酸，在120℃下脱气1小时；

[0052] c)降温冷却，1.5mL前驱体溶液在60℃下加入到烧瓶中；

[0053] d)溶液快速升温到290℃，保温10分钟，以形成晶种，然后将8mL前驱体溶液用注射泵以0.3mL/min的速度加入反应体系中；

[0054] e)反应前驱体加入完毕后，自然冷却；

[0055] f)冷却到室温后，反应溶液首先用少量甲苯稀释，6000转/分钟离心收集，然后将TiO2纳米离子分散在甲苯中，用异丙醇和甲醇的混合液使纳米粒子沉淀下来，6000转/分钟离心重获纳米粒子，清洗过程重复两遍，最后将TiO2纳米粒子分散在三氯甲烷中。

[0056] 优选地，上述步骤a)-e)均在氮气气氛中进行。

[0057] 然后，对TiO2疏水纳米颗粒进行改性和修饰。将含有TiO2疏水纳米颗粒、巯基功能化聚乙二醇和有机溶剂的混合溶液旋转蒸发，即可对TiO2疏水纳米颗粒进行改性和修饰。在一个示例中，对TiO2纳米粒子进行DSPE-PEG2000-SH改性和修饰操作如下：在TiO2纳米颗粒的氯仿溶液中，加入一定浓度的DSPE-PEG2000-SH氯仿溶液，然后在60℃下旋转蒸发1小时，再用去离子水清洗两遍。

[0058] 金纳米粒子可通过如下方法制备：在碱性溶液中，加入还原剂和氯金酸，即可得到金纳米粒子。所述碱性溶液可为0.15～0.25M的氢氧化钠水溶液。所述还原剂可为四羟甲基氯化磷。在一个示例中，粒径小于5nm的金纳米粒子的合成过程如下：将0.2M氢氧化钠水溶液加入50mL水中并搅拌，加入还原剂四羟甲基氯化磷，快速加入氯金酸溶液。最后将所得金纳米粒子溶液放在4℃下保存备用。

[0059] 然后，将TiO2纳米粒子与金纳米粒子结合以得到光电转换纳米粒子。将金纳米粒子水溶液加入经巯基功能化聚乙二醇(例如DSPE-PEG2000-SH)改性的TiO2纳米粒子水溶液中，搅拌2～4小时，进行离心清洗，即可得到光电转换纳米粒子。TiO2纳米粒子和金纳米粒子的投料比可为使得制备的NCs中TiO2纳米粒子与金纳米粒子的质量比为(6～10):1。

[0060] 所制得的光电转换纳米粒子具有良好的分散性、稳定性及生物相容性，可用于细胞及活体研究。

[0061] 本发明提供了一种新型的神经调控方法，克服了传统电极刺激技术的侵入性和光遗传学技术繁杂的基因转染等缺陷，为脑功能探索和神经疾病的治疗提供了一种极具应用潜力的新技术。本发明的NCs材料注射到癫痫模型斑马鱼脑部中，用405nm光照射，可使癫痫斑马鱼的游动趋向正常，具有显著的抗癫痫治疗效果。

[0062] 下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

[0063] 实施例1

[0064] 光电转换纳米粒子NCs的制备

[0065] a.高温热分解法制备TiO2纳米粒子及其表面改性

[0066] 称取0.01mol(1.2386g)TiF4，加入15.89mL油酸和34.11mL十八烯，在氮气保护下加热到80℃并搅拌，以促进TiF4的溶解，将该前驱体溶液保存备用；在三口烧瓶中分别加入10.2mL十八烯、9.9mL油胺和0.48mL油酸，在氮气保护下于120℃除气1小时。脱气后将1.5mL的前驱体溶液在60℃下加入烧瓶中，然后将溶液快速加热到290℃，保温10min，以形成晶种，随后，将8mL前驱体溶液用注射泵以0.3mL/min的速度加入反应溶液中，加入完毕后移除加热套，使烧瓶在自然条件下冷却。待溶液冷却到室温后，反应溶液首先用甲苯稀释，并在
6000转下离心收集。随后，将纳米粒子分散在甲苯中，再加入异丙醇和甲醇的混合液使纳米粒子沉淀，然后离心收集。该清洗过程重复两遍，最后，将TiO2纳米粒子分散在三氯甲烷中。
取2mL TiO2的三氯甲烷溶液放置于单口烧瓶中，加入150μL浓度为100mg/mLDSPE-PEG2000-SH的三氯甲烷溶液，在60℃下旋转蒸发1小时。加入5ml去离子水并超声，使改性后的TiO2纳米粒子分散在水中，并用去离子水离心清洗两遍。

[0067] b.制备粒径小于5nm的金纳米粒子

[0068] 在三口烧瓶中加入45.5mL去离子水和1.5mL 0.2M NaOH水溶液并搅拌，将1.2mL 80％的四羟甲基氯化磷稀释到100mL，取1mL加入反应溶液中，再加入25mM氯金酸溶液2mL，即可得到粒径小于5nm的金纳米粒子。将制得的金纳米粒子水溶液保存在4℃下备用。

[0069] c.制备光电转换纳米粒子NCs

[0070] 将5mL经DSPE-PEG2000-SH改性的TiO2水溶液中加入2mL金纳米粒子水溶液，搅拌2小时，随后进行离心清洗，分散在5mL去离子水中。

[0071] d.制备FITC(异硫氰酸荧光素)标记的光电转换纳米粒子

[0072] 将NCs与FITC水溶液混合，室温避光搅拌12h。离心富集材料，并用去离子水清洗至上清液无色。将所得的FITC标记的NCs分散在细胞培养液中，于4℃下避光保存待用。

[0073] 图1为本实施例所制得的TiO2疏水纳米颗粒分散于环己烷中的透射电镜(TEM)照片，由图1可见：所制得的纳米颗粒为立方体形，分散性良好，平均直径为17nm。

[0074] 图2为本实施例所制得的TiO2疏水纳米颗粒的XRD图谱，由图谱分析可知TiO2为锐钛矿晶型，结晶良好。

[0075] 图3为本发明实施例1所制得的Au纳米颗粒分散于水中的透射电镜(TEM)照片。由图3可见，所制得的Au纳米粒子粒径小于5nm，分散性良好。

[0076] 图4为本发明实施例1所制得的NCs分散于水中的透射电镜(TEM)照片。由图4可见，Au纳米粒子均匀地分布在TiO2表面。

[0077] 图5为本发明实施例1所制得的NCs的紫外可见吸收光谱。由图5可见，NCs在可见光区域内有吸收，说明NCs可用可见光激发。

[0078] 实施例2

[0079] NCs在水溶液中的光电流测试

[0080] 测试NCs的光电流-时间的曲线，Pt为对电极，Ag/AgCl为参比电极，NCs水溶液涂覆在FTO玻璃上为工作电极，硫酸钠为电解液，光源为氙灯加405nm滤光片，测试i-t曲线。

[0081] 图6为本发明实施例1所制得的NCs在405nm光照和无光照循环下的i-t曲线。由图6可见，NCs在405nm光照下产生10^-5A的电流，而无光照时无电流产生，成功证明了NCs的光电转换效果。

[0082] 实施例3

[0083] 细胞毒性测试

[0084] 采用CCK-8方法评价细胞存活率，具体实验方法为：用含10％胎牛血清的培养液配成单细胞悬液，以每孔105-106个细胞接种到96孔板，每孔的液体体积100微升；加入NCs后与细胞共培养24h后，每孔加10μL的CCK-8溶液，共培养4h后，选择450nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。对有光照的实验组，需要在加入NCs后在405nm光下照射2min，再与细胞共培养24h。

[0085] 图7为本发明实施例1所制得的NCs的细胞毒性实验结果。由图7可见，NCs的生物相容性较好，NCs光照2min后对细胞的毒性较小。

[0086] 实施例4

[0087] NCs使细胞去极化过程中的膜电位荧光成像

[0088] 神经细胞发生去极化时，会导致细胞膜内外的电荷发生反转，因此，用膜电位荧光染料可检测细胞的去极化。将PC12细胞接种入共聚焦皿中，用含10％胎牛血清的培养液培养24h。用膜电压荧光染料Di-8-ANEPPS对细胞进行染色，随后，用HHBS清洗3遍，加入NCs的HHBS溶液(200μL,125μg/mL)，将NCs与PC12细胞共培养，在激光扫描共聚焦荧光显微镜下，观察用405nm照射时钙离子染料的荧光强度变化。

[0089] 图8为本发明实施例1所制得的NCs(125μg/mL)使细胞去极化的膜电位荧光成像。(a)细胞膜电位荧光染料的实时荧光变化；(b)细胞膜电位荧光染料的最大荧光强度变化。
由图中的结果可以看出，仅同时进行NCs和光照处理的一组细胞的荧光染料强度增强，说明NCs在光照下可使细胞去极化。

[0090] 实施例5

[0091] NCs使神经细胞去极化过程中的钙离子成像

[0092] 在神经细胞去极化的过程中，钙离子也会内流进入细胞，因此，进一步用钙离子染料验证NCs使细胞去极化的过程。将PC12细胞接种入共聚焦皿中，用含10％胎牛血清的培养液培养24h。用钙离子染料cal-520对细胞进行染色，随后用HHBS清洗3遍，加入NCs的HHBS溶液(200μL,125μg/mL)，将NCs与PC12细胞共培养，在激光扫描共聚焦荧光显微镜下，观察用405nm照射时钙离子染料的荧光强度变化。

[0093] 图9为本发明实施例1所制得的NCs使细胞去极化的钙离子荧光成像(125μg/mL)。(a)膜电位荧光染料的实时荧光强度变化；(b)膜电位荧光染料的最大荧光强度变化。由图中的结果可以看出，仅同时进行NCs和光照处理的一组细胞的荧光染料强度增强，说明NCs在光照下可使细胞去极化。

[0094] 实施例6

[0095] NCs的神经细胞吞噬情况测试

[0096] NCs在光照下产生电流与细胞膜外的正电荷相互作用，从而使细胞去极化。因此，NCs的作用区域为细胞外，有必要研究细胞对NCs的吞噬情况。将PC12细胞接种入共聚焦皿中，用含10％胎牛血清的培养液培养24h。吸走旧培养液，加入1mL分散在细胞培养液中的FITC标记的NCs，与细胞共培养30min、1h、2h和4h后，用PBS清洗细胞两次，用DAPI染色细胞核，在激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察细胞荧光。

[0097] 图10为本发明实施例1所制得的NCs在细胞上的吞噬情况。图中第三列的绿色荧光，表示被细胞吞噬的FITC标记的NCs，由图可看出，2h前细胞对NCs基本无吞噬，而4h时细胞对NCs有少量吞噬。

[0098] 实施例7

[0099] NCs对斑马鱼抗癫痫作用评价：

[0100] 随机选取野生型AB系斑马鱼150尾于六孔板中，每孔30尾，用戊四唑(PTZ)诱发AB系斑马鱼癫痫模型。分别脑部注射给予PBS和NCs水溶液，注射容量为1nL/尾，注射分成5个实验组，即正常斑马鱼对照组(不做任何处理)、溶剂对照组(注射PBS)、材料组(注射NCs水溶液)、光照组(注射PBS并光照)和材料加光照组(注射NCs水溶液并光照)，30尾/组。光照组与材料加光照组分别在激光扫描共聚焦荧光显微镜405nm波长下照射2min。然后，将各组用运动/行为分析仪记录1h内斑马鱼的运动情况。斑马鱼癫痫发作时，会有快速运动，因此，可以用斑马鱼快速运动的距离评价其癫痫发作情况。

[0101] 图11为本发明实施例1所制得的NCs在斑马鱼上进行抗癫痫作用评价时各组斑马鱼的运动轨迹图。由图中可以看出，正常斑马鱼的快速运动较少，而癫痫斑马鱼有大量的快速运动。注射PBS、注射NCs水溶液和仅进行光照的癫痫斑马鱼有着大量的快速运动，而注射NCs并进行光照的癫痫斑马鱼快速运动大量减少。该结果证明NCs在光照下显著的抗癫痫效果。

[0102] 图12为实施例1所制得的NCs在斑马鱼上进行抗癫痫作用评价时各组斑马鱼的快速运动距离。根据斑马鱼的快速运动距离计算抗癫痫效果的公式：抗癫痫效率(％)＝(D1-D/D1–D0)×100％。D是注射NCs并进行光照的癫痫斑马鱼快速运动的距离；D1是注射PBS的癫痫斑马鱼的快速运动距离；D0是正常斑马鱼的快速运动距离。据公式计算出光照下NCs的抗癫痫效率为40.5％。