一种用于细胞内溶酶体pH成像的新型比率型荧光探针转让专利
申请号 : CN201610047157.9
文献号 : CN105693703B
文献日 : 2018-12-25
发明人 : 林伟英 , 董宝利 , 宋学真 , 王超 , 孔秀琪 , 唐永和
申请人 : 济南大学
摘要 :
本发明提供了一种用于细胞内溶酶体pH成像的新型比率型荧光探针，采用如下方法制备而成：将1mmol的a1、1mmol的a2、2mmol的1‑（3‑二甲氨基丙基）‑3‑乙基碳二亚胺、1.5mmol的1‑羟基苯并三氮唑、2.2mmol的三乙胺和5mL的N,N‑二甲基甲酰胺加入到50mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，过滤，烘干；将所得固体进行柱层析纯化，即得。本发明制备的荧光探针可以定量检测不同形态的荧光强度来测定溶酶体中的pH。
权利要求 :
1.一种用于细胞内溶酶体pH成像的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，方法为：将1mmol的a1、1mmol的a2、2mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1.5mmol的1-羟基苯并三氮唑、2.2mmol的三乙胺和5mL的N,N-二甲基甲酰胺加入到50mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，过滤，烘干；将所得固体进行柱层析纯化，即得；
所述a1的化学式为：
所述a2的化学式为：
所得荧光探针的化学结构通式如式(Ⅰ)所示：其中：R1＝R2＝H。
说明书 :
一种用于细胞内溶酶体pH成像的新型比率型荧光探针
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于细胞内溶酶体pH成像的新型比率型荧光探针及其应用，属于分析化学技术领域。
背景技术
[0002] 细胞内pH值(pHi)作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数，在细胞周期调控、细胞的生长与凋亡、离子转运、酶活性、钙调控、肌肉收缩和多药耐药性等细胞生理调控和病理过程中发挥着重要作用，细胞的内吞作用、吞噬作用以及受体配体的内化作用等内化通路也同样受pHi的影响。pHi 异常会导致生物体内细胞和组织器官功能紊乱、酶和蛋白质活性受到抑制，人体的免疫力下降，最终引发炎症、癌症以及阿尔茨海默症等疾病。此外，细胞内 pHi变化同时与细胞凋亡密切相关。癌细胞在细胞凋亡初期，一般会引起细胞内的酸化作用，且细胞内酸化已成为细胞凋亡的一个重要的早期特征。细胞内酸化与细胞凋亡的相互关系也引起了许多科研工作者的研究兴趣。因此，对细胞内 pHi进行灵敏、准确的实时原位监测，有助于从分子水平上理解细胞的生理和病理过程。
[0003] 溶酶体(lysosomes)是真核细胞中的一种细胞器，为单层膜包被的囊状结构，多为球形，但也存在橄球形，大小约0.025 0.8微米。溶酶体内含蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、脂肪~酶、磷酸酯酶及硫酸脂酶等50多种水解酶，可分解各种外源和内源的蛋白质等大分子物质，为细胞内的消化器官，具有溶解或消化的功能。溶酶体内的降解酶在弱酸性条件下（pH约为
5）可具有最好的活性，当溶酶体内的pH异常时，由于各种降解酶的活性发生变化，其溶解消化功能会受到严重的影响，进而导致类风湿关节炎、休克或肿瘤等疾病的发生。因此，检测细胞内溶酶体的pH值可以为研究相关生理和病理过程，以及预防相关疾病提供重要的信息。
5）可具有最好的活性，当溶酶体内的pH异常时，由于各种降解酶的活性发生变化，其溶解消化功能会受到严重的影响，进而导致类风湿关节炎、休克或肿瘤等疾病的发生。因此，检测细胞内溶酶体的pH值可以为研究相关生理和病理过程，以及预防相关疾病提供重要的信息。
[0004] 荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应时间短、操作简单等优点，而且对细胞基本没有损伤，已经广泛用于各种离子及生物物种的检测或细胞荧光成像。用于检测细胞内pH值的荧光探针也得到了迅速发展，其中一些已经商品化。但是，目前报道的和已经商品化的溶酶体pH荧光探针大都是荧光增强型探针。探针分子对pH的响应信号易受探针浓度、温度、激发光强度等因素的干扰，影响检测结果。相比之下，比率型荧光探针以两个荧光信号的比值为输出信号，可有效的避免或降低这些因素的干扰。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，比率型pH荧光探针具有重要的意义。
发明内容
[0005] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种能快速检测细胞内溶酶体pH的比率型荧光探针及其应用。
[0006] 本发明所述的检测细胞内溶酶体pH的比率型荧光探针为含有不同取代基团的香豆素-萘酰亚胺衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式（）所示：
[0007]
[0008] 其中：R1 = R2 = H，命名为1a；或R1 = H，R2 =Cl，命名为2a；或R1 = CH3，R2 = H，命名为3a；或R1 = CH3，R2 =Cl，命名为4a。
[0009] 本发明所述检测细胞内溶酶体pH的比率型荧光探针优选的实施方式是：所述荧光探针的化学结构通式如式（）所示，其中：R1 = R2 = H。
[0010]
[0011] 本发明所述检测细胞内溶酶体pH的荧光探针的制备方法为：将式（Ⅱ）所示的化合物a1 (1 mmol)、a2 (1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL)加入到50 mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析纯化，得到浅黄色产物即为本发明所述检测细胞内溶酶体pH的比率型荧光探针。
[0012] 本发明所述的比率型荧光探针在检测细胞内溶酶体pH的应用。
[0013] 本发明所述的检测生物体系内次氯酸的比率型荧光探针可应用于细胞内溶酶体pH的定性和定量评价。该探针作为溶酶体pH的特异性探针，可在不同pH环境下，通过香豆素部分羟基的电离和萘酰亚胺部分吗啉基团的质子化，生成具有不同荧光发射能力的形态，通过定量检测不同形态的荧光强度来测定溶酶体中的pH。
[0014] 具体测定方法为：室温条件下，配制5 μM 荧光探针的不同pH值的B-F缓冲液体中（含有5%甲醇），测定溶液荧光强度作为pH的评价指标。见图2。
[0015] 本发明所述的荧光探针在酸性条件下，萘酰亚胺荧光团的吗啉部分将会发生质子化，从吗啉到萘酰亚胺荧光团的PET作用将被抑制，此时荧光探针可以发射萘酰亚胺荧光团的绿色荧光（峰值约为531 nm）；在碱性条件下，萘酰亚胺荧光探针的荧光因来自于吗啉的PET作用而得到淬灭，香豆素荧光团的荧光则因羟基的电离而得到增强，此时荧光探针可以发射香豆素部分的蓝色荧光（峰值约为454 nm）。同时，由于吗啉具有溶酶体靶向功能，因此该荧光探针可以用于检测溶酶体内的pH。可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为380 nm，在420 700 nm之间进行荧光发射光谱的检测。~
[0016] 荧光探针在生物成像应用研究主要内容有探针对活细胞的毒性、染色能力、活细胞和活组织荧光成像。采用MTT比色法，通过分析细胞在加入荧光探针之后的存活率，讨论荧光探针对细胞的毒性。借助流式细胞仪，检测细胞在加入荧光探针培育之后的染色比例，进而考察荧光探针对细胞的染色能力。在此基础上，应用本发明所述的检测细胞内溶酶体pH的荧光探针对活细胞或活组织进行检测，能够对该样品中细胞内溶酶体pH实现荧光成像，达到对细胞中的pH快速准确检测的目的。
[0017] 本发明的有益效果为：
[0018] 本发明所述的检测细胞内溶酶体pH的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。
[0019] 本发明所述的检测细胞内溶酶体pH的荧光探针具有高特异性，在进行相应pH检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内溶酶体pH的实时测定，具有广阔的应用前景。
[0020] 本发明所述的检测细胞内溶酶体pH的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（400 500 nm），通过绘制标准曲线进行细胞内溶酶体pH测定，可以实现对细胞中的~pH快速准确检测的目的。
附图说明
[0021] 图1是荧光探针的1H NMR图谱。
[0022] 图2是荧光探针在不同pH条件下的荧光光谱。
[0023] 图3是荧光探针与pH的线性关系数据。
[0024] 图4是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱。
[0025] 图5是荧光探针在活细胞中的成像应用。
具体实施方式
[0026] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护内容不仅限于此。
[0027] 实施例1
[0028] 本发明所述检测细胞内溶酶体pH的荧光探针的制备
[0029] 将式（Ⅱ）所示的化合物a1 (1 mmol)、a2 (1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL)加入到50 mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析(二氯甲烷:甲醇=20:1 )纯化，得到浅黄色产物即为本发明所述检测细胞内溶酶体pH的比率型荧光探针，产率52%。
[0030] 上述检测细胞内溶酶体pH的荧光探针的H NMR图谱见图1。
[0031] 实施例2
[0032] 本发明所述检测细胞内溶酶体pH的荧光探针在不同pH条件下的荧光光谱
[0033] 预先准备10份5mL的 5 μM探针B-F缓冲溶液，含5%甲醇，pH 依次为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0。然后进行荧光检测（λEx= 380 nm）；计算各体系中荧光强度；评估该探针对pH的响应性能（见图2）。分析溶液pH在4.0 6.5范围内，~
531nm处与454nm处的荧光强度比值I531/I454与pH呈线性关系，见图3。该探针对pH有明显的响应，从pH 4到pH 10，531nm处的荧光峰逐渐降低，而454nm处的荧光峰逐渐增强。在pH 4.0~6.5范围内，荧光强度比值I531/I454与pH呈线性关系，R值为0.98。
531nm处与454nm处的荧光强度比值I531/I454与pH呈线性关系，见图3。该探针对pH有明显的响应，从pH 4到pH 10，531nm处的荧光峰逐渐降低，而454nm处的荧光峰逐渐增强。在pH 4.0~6.5范围内，荧光强度比值I531/I454与pH呈线性关系，R值为0.98。
[0034] 实施例3
[0035] 荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱
[0036] 预先准备10份5mL的 5 μM探针B-F缓冲溶液(含5%甲醇，pH = 7.4)，然后分别向该体系中依次加入50 μL浓度为10 mM的NaClO、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、CH3COOOH、HClO4、cys、GSH、NaNO2、VC等的PBS溶液。然后进行荧光检测（λEx= 380 nm）；计算各体系中荧光强度；评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性。图4表明，NaClO、Na2S等物质对探针检测pH无显著干扰。
[0037] 实施例4
[0038] 荧光探针在活细胞中的成像应用
[0039] 将Hela细胞放在培养基(DMEM培养液和10%胎牛血清)中，放置于条件为37℃、5% CO2和20% O2的培养箱中培养24 -48h。用微量进样器吸取本发明所述检测细胞内溶酶体pH的荧光探针 (10 μM)和溶酶体定位试剂 Lyso-Tracker Red注入含有Hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。之后用PBS (磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞3次，然后进行荧光成像，见图5。在酸性条件下（pH= 4），细胞具有强烈的绿色荧光和微弱的蓝色荧光，随着pH的增大，绿色荧光逐渐减弱，而蓝色荧光逐渐增强，因此，此探针可以用于检测细胞内的pH。