一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法

摘要

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠星形胶质细胞的分离纯化和培养方法。本发明综合使用多种培养基从新生裸鼹鼠大脑皮层分离并纯化培养星形胶质细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠星形胶质细胞的合理培养方法。本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠星形胶质细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠星形胶质细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

权利要求

1.一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，包括以下步骤：

A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞：

分离出生1-9天裸鼹鼠大脑皮层组织，将组织剪碎，加入组织消化液混匀之后，于37℃中消化30-40min；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；随后将单细胞悬液种于无菌培养瓶中；

B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：

将步骤A得到的混合神经细胞用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中，培养25--

40天；自混合神经细胞接种之后，每7天采取半量换液的方法更换混合神经细胞培养基；

C、裸鼹鼠星形胶质细胞的分离及纯化培养：

将步骤B培养的混合神经细胞于35±2℃、恒温震荡摇床转速为220rpm的条件下恒温震荡培养20小时，期间保持培养瓶口旋紧以减少瓶内外空气交换；然后将上清丢弃，并将剩余贴于培养瓶底部的细胞用胰酶消化，混合神经细胞培养基终止消化；随后离心保留沉淀，用星形胶质细胞培养基重悬并吹打成单细胞悬液，种于未包被左旋多聚赖氨酸的培养皿中，并将培养皿置于三气培养箱中，其中，所述的混合神经细胞培养基为含有10％胎牛血清的低糖DMEM；

所述的星形胶质细胞培养基为添加体积分数为2％N2的Neurobasal；

在步骤B和步骤C中，所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为

5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。

2.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，其特征在于，步骤A中，所述的组织消化液为浓度为0.25％质量浓度的胰酶和浓度为0.4mg/ml DNA酶I的混合液。

3.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，其特征在于，步骤A中，取出生1-9天裸鼹鼠大脑，剥除脑膜后分离皮层组织，用显微剪将组织剪碎至1mm3，加入组织消化液混匀之后，于37℃中消化35min。

4.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，其特征在于，步骤A中，所述组织消化液的消化时间为35分钟。

5.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，其特征在于，步骤B中，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中，培养35天。

6.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，其特征在于，步骤C中，所述胰酶质量浓度为0.25％。

7.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，其特征在于，步骤C中，所述离心参数为：室温下800rpm离心5分钟。

说明书

一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠星形胶质细胞的分离纯化和培养方法。背景技术：

[0002] 星形胶质细胞(Astrocyte)是哺乳动物中枢神经系统中比例最高的一类细胞。随着越来越多的研究发现星形胶质细胞在突触形成、突触信号传递效率，以及突触可塑性中发挥作用，星形胶质细胞逐渐开始引起了科研人员更多的关注。

[0003] 裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度仅有6％左右的不通风洞穴中能够保持脑结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动。而研究发现星形胶质细胞常常会伸出伪足贴附在脑内毛细血管周围，以随时密切感受来自血管中氧浓度、以及离子环境的变化，并及时作出相应的反应，例如分泌神经营养因子或免疫相关因子等由于在体微环境非常复杂，无法在体直接观察星形胶质细胞在低氧环境中的功能改变情况及其适应机制，并且在体的结果可能容易受到微环境中其他细胞组分和结构的影响(Astrocyte-mediated ischemic tolerance.Yuri Hirayama,Yuri Ikeda-Matsuo,Shoji Notomi,Hiroshi Enaida,Hiroyuki Kinouchi,and Schuichi Koizumi.J Neurosci.2015Mar 4；35(9):3794-805.)。因此需要建立离体的裸鼹鼠星形胶质细胞模型以弥补在体观察的缺陷。

[0004] 目前，研究人员已经建立出大鼠及小鼠星形胶质细胞的培养方法(Yan Gu,Mulan He,Xiaoqin Zhou,Jinngjing Liu,Nali Hou,Tan Bin,Yun Zhang,Tingyu Li and Jie Chen.Endogenous IL-6 of mesenchymal stem cell improves behavioral outcome of hypoxic-ischemic brain damage neonatal rats by supressing apoptosis in astrocyte.Sci Rep.2016 Jan 14；6:18587.doi:10.1038/srep18587.)。中国专利申请CN201210223545.X，申请公布号为CN102703387A，公开了一种SD乳鼠星形胶质细胞的分离和培养方法，包括大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后筛网过滤、细胞原代培养、细胞传代培养4个实验步骤；其中细胞原代培养所用培养基为DMEM培养液和终浓度为20％的小牛血清；其中细胞传代培养所用培养基为DMEM培养基和终浓度为10％的小牛血清。

[0005] 但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的星形胶质细胞分离纯化和培养方法均不适用于裸鼹鼠，目前国内外文献尚无有关裸鼹鼠星形胶质细胞分离纯化和培养方法的相关报道。发明内容：

[0006] 本发明的目的在于提供一种裸鼹鼠星形胶质细胞的分离纯化和培养方法，以方便、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠星形胶质细胞，为体外建立裸鼹鼠星形胶质细胞提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠星形胶质细胞的活化、以及低氧耐受能力、以及裸鼹鼠星形胶质细胞低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或靶分子的筛选提供强大的保障。

[0007] 我们试用了目前小鼠、大鼠的星形胶质细胞分离纯化和培养方法，结果发现均无法培养获得纯度高、状态好的裸鼹鼠星形胶质细胞，而且裸鼹鼠星形胶质细胞增殖的数量也较少。

[0008] 关于裸鼹鼠星形胶质细胞的培养尚没有建立出可行的实验方法，我们分析其原因，主要是：1)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠生存在较为阴暗潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求；3)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索。

[0009] 因此，裸鼹鼠星形胶质细胞的培养中最重要的摸索到合适的温度、湿度和氧气浓度，以及摸索到适合的培养基。

[0010] 为达到此目的，本发明的裸鼹鼠星形胶质细胞的分离纯化方法包括以下步骤：

[0011] A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞：

[0012] 分离出生1-9天裸鼹鼠大脑皮层组织，将组织剪碎，加入组织消化液混匀之后，于37℃中消化30-40min；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；随后将单细胞悬液种于无菌培养瓶中；

[0013] 所述的组织消化液，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，辅以DNA酶I以解除DNA片段粘连所致的细胞聚集。

[0014] 优选的组织消化液：含有0.25％胰酶和终浓度为0.4mg/ml DNA酶I的混合液。

[0015] 所述的混合神经细胞培养基，可以为常规的含血清混合神经细胞培养液，例如低糖DMEM等。优选的混合神经细胞培养基为含有10％胎牛血清的低糖DMEM。

[0016] B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：

[0017] 将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中培养25--40天；自混合神经细胞接种之后，每7天采取半量换液的方法更换混合神经细胞培养基。

[0018] C、裸鼹鼠星形胶质细胞的分离及纯化培养：

[0019] 将步骤B培养的混合神经细胞恒温震荡培养，恒温35±2℃，然后将上清丢弃，并将剩余贴于培养瓶底部的细胞用胰酶消化，混合神经细胞培养基终止消化，随后离心后保留沉淀并用星形胶质细胞培养基重悬并吹打成单细胞悬液并种于未包被左旋多聚赖氨酸的培养皿中。

[0020] 所述的星形胶质细胞培养基，为添加无血清营养因子的Neurobasal培养基等，优选为添加体积分数为2％N2的Neurobasal。

[0021] 所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。

[0022] 进一步，步骤A中，取出生1-9天裸鼹鼠大脑，剥除脑膜后分离皮层组织，用显微剪将组织剪碎至1mm3，加入组织消化液混匀之后，于37℃中消化35min。然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液。随后将单细胞悬液种于无菌T25培养瓶中。

[0023] 进一步，步骤A中，所述组织消化液为含有0.25％胰酶(质量体积分数)和终浓度为0.4mg/ml DNA酶I的混合液，消化时间为35分钟。

[0024] 进一步，步骤B中，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中培养35天。

[0025] 进一步，步骤B中，所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。

[0026] 进一步，步骤C中，混合神经细胞于35℃恒温震荡摇床中进行震荡培养，期间保持培养瓶口旋紧以减少瓶内外空气交换。

[0027] 进一步，步骤C中，所述恒温震荡摇床转速为220rpm。

[0028] 进一步，步骤C中，所述震荡培养时间为20小时。

[0029] 进一步，步骤C中，所述胰酶质量浓度为0.25％。

[0030] 进一步，步骤C中，所述离心参数为：室温下800rpm离心5分钟。

[0031] 本发明的有益效果在于：①综合使用多种培养基从新生裸鼹鼠大脑皮层分离并纯化培养星形胶质细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠星形胶质细胞的合理培养方法。我们发现5％氧浓度条件下，细胞状态能够得到较好的保持，并能够保持增长；②操作方法简单，具有较高的可重复性，差速贴壁法获得的星形胶质细胞纯度可达98％以上；③额外添加的生长因子种类少，只需要在Neurobasal培养基中添加2％的N2就可以维持星形胶质细胞的增殖和较好的功能状态。

[0032] 综上所述，本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠星形胶质细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠星形胶质细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。附图说明：

[0033] 图1为体外培养的混合神经细胞；

[0034] 图2为体外培养的星形胶质细胞(光镜)；

[0035] 图3为体外纯化培养的星形胶质细胞免疫细胞化学染色鉴定，其中A为GFAP，B为Hoechst，C为GFAP与Hoechst合并染色结果。具体实施方式：

[0036] 以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0037] 实施例1：裸鼹鼠星形胶质细胞分离纯化及培养

[0038] 1、实验材料

[0039] 出生1-9天的清洁级裸鼹鼠由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。将新生裸鼹鼠置于-20℃冰板进行麻醉后置于75％乙醇中浸泡10min，然后断头，并用青霉素100U/ml和0.1mg/ml链霉素混合液擦拭裸鼹鼠头部表面，然后剪开头部皮肤及颅骨，将大脑剥离并置于预冷的解剖液中。

[0040] DNA酶I购自Solarbio生物科技有限公司，胰蛋白酶、青链霉素混合液等购自Sigma公司，DMEM、低糖DMEM、澳洲来源胎牛血清、Neurobasal培养基、N2无血清添加因子等购自Thermo Fisher Scientific公司，培养皿、T25和T75培养瓶购自Corning公司。

[0041] 混合神经细胞培养基成分为低糖DMEM培养基含有体积分数为10％的胎牛血清，星形胶质细胞纯化培养基为添加体积分数为2％N2的Neurobasal。

[0042] 2、裸鼹鼠星形胶质细胞分离纯化及培养方法：

[0043] ①收集裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞：取出生1-9天裸鼹鼠大脑2个，剥除脑膜后获得皮层组织并置于1ml解剖液中，用显微剪将组织剪碎至1mm3，加入消化液(0.25％质量体积分数的胰酶1ml和终浓度为0.4mg/ml的DNA酶I浓度为)混匀之后，于37℃消化35min。然后用混合神经细胞培养基终止消化，800rpm条件下离心5分钟以去除上清，然后添加5ml混合神经细胞培养基中将细胞沉淀重悬并小心吹打成单细胞悬液(尽量避免气泡产生)。随后将单细胞悬液按照1×106密度种于包被有左旋多聚赖氨酸的T25培养瓶中，每瓶培养液体积为5ml。

[0044] ②裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞的培养：将①中得到的细胞，用混合神经细胞培养基于三气培养箱中培养35天。自细胞接种之后，每7天采取半量换液法更换培养基。

[0045] ③裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离及纯化培养：将②中培养的混合胶质细胞(如图1所示，圆形有光晕的为少突胶质前体细胞，底层细胞为星形胶质细胞)于35℃恒温震荡摇床中以220rpm的转速进行震荡培养20小时，以尽量将表层的小胶质细胞和少突胶质前体细胞摇下。震荡培养过程中保持培养瓶口旋紧以减少瓶内外空气交换。然后吸弃上清，用0.25％的胰酶将底层细胞于37℃消化3min后用3ml神经细胞混合培养基终止消化，然后于
800rpm离心5min，弃上清，并用神经细胞混合培养基重悬成单细胞悬液，种于培养皿或培养瓶中，培养于35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％的三气培养箱中。进行实验分析前将培养基提前半小时更换为添加体积分数为2％N2的Neurobasal的无血清培养基。

[0046] 实施例2：裸鼹鼠星形胶质细胞的鉴定

[0047] 采用实施例1所得的裸鼹鼠星形胶质细胞的鉴定：利用4％多聚甲醛对处于无血清培养基中的星形胶质细胞进行固定，并结合形态学鉴定、免疫细化化学等方法进行鉴定。

[0048] 1、细胞形态学鉴定：

[0049] 鉴定方法如文献中所述(Chung WS,Clarke LE,Wang GX,Stafford BK,Sher A,Chakraborty C,Joung J,Foo LC,Thompson A,Chen C,Smith SJ,Barres BA.Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways.Nature,2013,504(7480):394-400.)。

[0050] 结果如图2所示，光镜下，星形胶质细胞胞体和胞核均较大，胞质体积亦较大，胞体折光度较差，从胞体向周围伸出不规则的伪足样突起。

[0051] 2、免疫细胞化学鉴定：

[0052] 鉴定方法如文献所述( E,Arias C.Cholesterol-induced astrocyte activation is associated with increased amyloid precursor protein expression and processing.Glia 2015,63:2010–2022.)。

[0053] 结果如图3所示，将纯化的星形胶质细胞进行爬片实验，在无血清培养基中培养12小时后，利用4％多聚甲醛将细胞固定，然后利用抗星形胶质细胞表面特异抗原GFAP的抗体进行免疫细胞化学染色。结果显示，在无血清培养基中，细胞能够保持GFAP阳性(红色荧光)。

[0054] 根据上述实验结果，本发明分离纯化的裸鼹鼠星形胶质细胞具备典型的星形胶质细胞形态，呈GFAP阳性，并且具数只不规则的伪足，并在无血清培养基中能够保持良好的增殖状态。

[0055] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。