一种分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法

摘要

本方法公开了一种分离分析伏立康唑前药有关物质的HPLC方法，采用高效液相色谱法，以C18、苯基柱、氰基柱为色谱柱，缓冲液（pH值2～9）与有机溶剂以一定比例组成流动相，该方法可以快速有效准确的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐的有关物质。

权利要求

1.一种分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，其特征在于以C18、苯基或氰基硅烷键合硅胶为填充剂；缓冲液与有机溶剂以一定配比组合为流动相；流速为

0.1～1.5ml/min；柱温为0～50℃；检测波长：200～400nm；进样体积为0.1～100μl；使用梯度或等度进行洗脱分离。

2.根据权利要求1所述的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，其特征在于所述的缓冲液为离子对试剂：醋酸-醋酸钠缓冲液体系、离子对试剂：磷酸二氢钠-磷酸体系、离子对试剂：磷酸二氢钾-磷酸体系、离子对试剂：磷酸氢二钠-磷酸体系、离子对试剂：磷酸氢二钾-磷酸体系、离子对试剂：磷酸氢二铵-磷酸体系或离子对试剂：磷酸二氢铵-磷酸体系。

3.根据权利要求1所述的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，其特征在于所述的缓冲液pH值为1.0～9.5。

4.根据权利要求1所述的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，其特征在于所述有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、正丙醇、异丙醇；所述的有机溶剂一种或几种与缓冲液混合。

5.根据权利要求1所述的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，其特征在于所述的检测波长为240-280nm。

6.根据权利要求1所述的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，所述的流速为1.0～1.5ml/min。

7.根据权利要求1所述的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，其特征在于所述有机溶剂：缓冲液的体积比为10%～50%：90%～50%。

8.根据权利要求1所述的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，所述的柱温为20～40℃。

9.根据权利要求1所述的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，所述的等度条件为有机相-水相体积比为20:80。

10.根据权利要求1所述的分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，所述的梯度条件为0～15分钟时，混合后流动相中的有机相比例为5%～30%，在15～60分钟时，逐渐增加有机相比例至40%～70%，保持0～50分钟，然后在5分钟内将有机相比例降回5%～30%。

说明书

一种分离分析伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种高效液相分析方法，具体的说是一种伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质分离分析测定。

背景技术

[0002] 伏立康唑磷酸酯或其药用盐是伏立康唑的前体药物，伏立康唑磷酸酯或其药用盐进入体内可以通过碱性磷酸酶的作用，代谢为伏立康唑，从而发挥药效作用。伏立康唑是一种广谱的三唑类抗真菌药其适应症如下：治疗侵袭性曲霉病，治疗对氟康唑耐药的念珠菌引起的严重侵袭性感染（包括克柔念珠菌），治疗由足放线病菌属和镰刀菌属引起的严重感染本品应主要用于治疗免疫缺陷患者中进行性的可能威胁生命的感染。

[0003] 我们在开发伏立康唑磷酸酯或其药用盐的过程中发现该化合物没有现成分离有关物质的方法，而且在公开发表的文献中也没有发现该化合物有关物质的分离方法。这种现状使得该化合物有关物质分析没有统一的标准，极大的阻碍了该化合物的引用和推广。因此，建立一套有效、稳定的有关物质测定分离方法是十分必要的。

[0004] 伏立康唑磷酸酯或其药用盐及其中间体及杂质的结构式如下：

[0005]

[0006] 伏立康唑磷酸酯或其药用盐（X代表H、Na、K、氨基酸）

[0007]

[0008] (2R,3S)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇（杂质A）

[0009]

[0010] (2R,3S)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(5-氟-4-嘧啶)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁基亚磷酸酯（杂质B）

[0011]

[0012] 3-(6-氯-5-氟嘧啶-4-基)-2-(2,4-二氟苯基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁基亚磷酸酯（杂质C）

[0013]

[0014] 3-(6-氯-5-氟嘧啶-4-基)-2-(2,4-二氟苯基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁基磷酸酯（杂质D）

[0015]

[0016] 3-(6-氯-5-氟嘧啶-4-基)-2-(2,4-二氟苯基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇（杂质E）

[0017]

[0018] 2-(2,4-二氟苯基)-3-(嘧啶-4-基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇（杂质F）[0019]

[0020] 4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯嘧啶（杂质G）

[0021]

[0022] 2'4'-二氟-2-[1-(1H-1,2,4-三唑基)]苯乙酮（杂质H）

[0023]

[0024] 4-乙基-5-氟-6-羟基嘧啶（杂质I）

[0025]

[0026] 4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶（杂质J）

[0027]

[0028] 4-乙基-5-氟嘧啶（杂质K）

[0029]

[0030] 2-(2,4-二氟苯基)-3-(嘧啶-4-基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁基亚磷酸酯(杂质L)

[0031]

[0032] 2-(2,4-二氟苯基)-3-(嘧啶-4-基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁基磷酸酯（杂质M）

[0033] 以上各杂质从结构上考察，部分杂质与伏立康唑磷酸酯或其药用盐结构非常相似，从极性角度考虑，又有部分杂质与伏立康唑磷酸酯或其药用盐存在极大的极性差异；所以在同一色谱条件下将上述各杂质完全有效分离是非常困难的，这使得寻找一种既要求相似结构杂质能有效分离又要兼顾弱极性杂质能够有效检出的色谱条件成为必要。

发明内容

[0034] 本发明的目的就是针对现有技术的缺陷，提供一种伏立康唑磷酸酯或其药用盐及含有伏立康唑磷酸酯或其药用盐的相关制剂进行有关物质的分离分析方法。

[0035] 根据需要，我们在开发伏立康唑磷酸酯或其药用盐的过程中，重点研究了伏立康唑磷酸酯或其药用盐的高效液相色谱分离方法。

[0036] 本方法所说的用高效液相色谱法分析分离伏立康唑磷酸酯或其药用盐有关物质的方法，是以C18、氰基、苯基键合硅胶为填充剂，缓冲液（pH值1～9.5）与有机溶剂以一定配比组合为流动相；流速为0.5～5.0ml/min；柱温为0～50℃；进样体积为0.1～100μl；检测器为紫外检测器和二极管阵列检测器；检测波长为200～400nm；使用等度或梯度进行洗脱分离。

[0037] 本发明所述的填充剂选自下列键合硅胶：C18硅烷键合硅胶、氰基硅烷键合硅胶、苯基硅烷键合硅胶。

[0038] 本发明所述的有机溶剂选自下列溶剂：乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、正丙醇、异丙醇。

[0039] 本发明所述的缓冲液的pH值为1.0～9.5，所述的缓冲液的pH值优选为2.0～5.0；最优选为2.5～3.5。

[0040] 本发明所述的缓冲液为离子对试剂：醋酸-醋酸钠缓冲液体系、离子对试剂：磷酸二氢钠-磷酸体系、离子对试剂：磷酸二氢钾-磷酸体系、离子对试剂：磷酸氢二钠-磷酸体系、离子对试剂：磷酸氢二钾-磷酸体系、离子对试剂：磷酸氢二铵-磷酸体系、离子对试剂：磷酸二氢铵-磷酸体系；优选为离子对试剂：磷酸二氢钾-磷酸体系、离子对试剂：磷酸二氢钠-磷酸体系；最优选离子对试剂：磷酸二氢钾-磷酸体系。

[0041] 本发明所述的检测波长为200～400nm；优选240～280nm；最优选250～260nm。

[0042] 本发明所述的流速为0.5～5.0ml/min；优选0.8～2.0ml/min；最优选1.0～1.5ml/min。

[0043] 本发明所述的柱温为0～50℃；优选20～40℃；

[0044] 本发明所述的等度条件为有机相-水相（20:80）

[0045] 本发明所述的梯度条件为0～15分钟时，混合后流动相中的有机相比例为5%～30%，在15～60分钟时，逐渐增加有机相比例至40%～70%，保持0～50分钟，然后在5分钟内将有机相比例降回5%～30%。

[0046] 本发明所述的有关物质的分离分析方法，可按照以下方法实现：

[0047] （1）取伏立康唑磷酸酯或其药用盐适量，采用适宜介质溶解稀释配制成供试品溶液。

[0048] （2）取上述杂质适量，采用适宜介质溶解稀释配制成杂质溶液。

[0049] （3）流动相：A相：取庚烷磺酸钠0.606g、磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用磷酸调节pH至3.00；B相：乙腈。

[0050] （4）梯度条件时间（min） A相（%） B相（%）
0 82 18
15 82 18
45 50 50
55 50 50
60 82 18
70 82 18

[0051] （5）流速为1.0ml/min；检测波长256nm；柱温25℃；苯基柱。

[0052] （6）取（1）的供试品溶液和（2）的杂质溶液10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，具体如实施例1所示。

[0053] 具体实施方式：

[0054] 以下结合实施例对本发明作进一步说明，但这些实施例不得用于解释本发明保护范围的限制。

[0055] 实施例1

[0056] 实验仪器及条件

[0057] 高效液相色谱仪：Thermo高效液相色谱仪 Ultimate 3000；

[0058] 色谱柱：C18 150×4.6mm 5μm；

[0059] 流动相：乙腈：缓冲液（取庚烷磺酸钠0.606g、磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用磷酸调节pH至3.00）=20:80；

[0060] 流速1.0ml/min；

[0061] 检测波长：256nm；

[0062] 柱温20℃；

[0063] 进样体积10μl。

[0064] 取伏立康唑磷酸酯或其药用盐及上述杂质，用适宜介质溶解稀释制成供试品溶液和杂质溶液，取供试品溶液及杂质溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，结果如下：样品 保留时间（min） 分离度
杂质I 4.839 9.03
杂质K 6.708 2.08
伏立康唑磷酸酯 7.032 1.77
杂质H 8.127 1.50
杂质B 8.006 9.34
杂质M 10.205 12.54
杂质L 13.803 9.10
杂质J 15.621 13.84
杂质D 18.263 18.09
杂质F 28.293 16.32
杂质C 32.560 29.54
杂质A 50.127 20.81
杂质G 68.29 14.18
杂质E 73.82 ——

[0065] 该色谱条件，基本能检查所有杂质，最晚出峰的杂质E保留时间为73.82min，基本满足测定要求。

[0066] 实施例2

[0067] 实验仪器及条件

[0068] 高效液相色谱仪：Thermo高效液相色谱仪 Ultimate 3000；

[0069] 色谱柱：C18 150×4.6mm 5μm；

[0070] 流动相：A相：缓冲液（取庚烷磺酸钠0.606g、磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用磷酸调节pH至3.00）；B相：乙腈；梯度条件如下：时间（min） A相（%） B相（%）
0 80 20
15 80 20
45 50 50
50 82 18
60 82 18

[0071] 流速1.0ml/min；

[0072] 检测波长：256nm；

[0073] 柱温25℃；

[0074] 进样体积10μl。

[0075] 取伏立康唑磷酸酯或其药用盐及上述杂质，用适宜介质溶解稀释制成供试品溶液和杂质溶液，取供试品溶液及杂质溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，结果如下：样品 保留时间（min） 分离度
杂质I 4.782 9.91
杂质K 6.707 2.43
伏立康唑磷酸酯 7.202 4.88
杂质B 8.058 1.63
杂质H 8.129 9.27
杂质M 10.218 10.52
杂质L 13.817 9.96
杂质J 15.350 3.28
杂质D 16.174 1.58
杂质F 16.429 7.83
杂质C 18.945 10.68
杂质G 31.040 17.35
杂质A 32.228 2.05
杂质E 39.381 ——

[0076] 该色谱条件最长的杂质保留时间为39.381min，该方法可有效检出各杂质。

[0077] 实施例3

[0078] 实验仪器及条件

[0079] 高效液相色谱仪：Thermo高效液相色谱仪 Ultimate 3000；

[0080] 色谱柱：苯基柱 250×4.6mm 5μm；

[0081] 流动相：A相：缓冲液（取庚烷磺酸钠0.606g、磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用磷酸调节pH至3.00）；B相：乙腈；梯度条件如下：时间（min） A相（%） B相（%）
0 82 18
15 82 18
45 50 50
50 82 18
60 82 18

[0082] 流速1.0ml/min；

[0083] 检测波长：256nm；

[0084] 柱温25℃；

[0085] 进样体积10μl。

[0086] 取伏立康唑磷酸酯或其药用盐及上述杂质，用适宜介质溶解稀释制成供试品溶液和杂质溶液，取供试品溶液及杂质溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，结果如下：样品 保留时间（min） 分离度
杂质I 4.217 9.91
杂质K 6.867 2.43
伏立康唑磷酸酯 7.440 4.88
杂质B 9.063 12.54
杂质H 12.070 1.53
杂质M 12.769 14.52
杂质D 16.317 1.32
杂质L 16.448 1.68
杂质J 16.853 15.94
杂质C 21.620 19.42
杂质F 28.223 10.68
杂质G 31.807 2.87
杂质A 32.900 13.96
杂质E 40.630 ——

[0087] 该色谱条件最长的杂质保留时间为40.630min，该方法可有效检出各杂质。

[0088] 实施例4

[0089] 实验仪器及条件

[0090] 高效液相色谱仪：Thermo高效液相色谱仪 Ultimate 3000；

[0091] 色谱柱：苯基柱 250×4.6mm 5μm；

[0092] 流动相：A相：缓冲液（取庚烷磺酸钠0.606g、磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用磷酸调节pH至3.00）；B相：乙腈；梯度条件如下：时间（min） A相（%） B相（%）
0 80 20
15 80 20
50 50 50
55 80 20
65 80 20

[0093] 流速1.0ml/min；

[0094] 检测波长：256nm；

[0095] 柱温25℃；

[0096] 进样体积10μl。

[0097] 取伏立康唑磷酸酯或其药用盐及上述杂质，用适宜介质溶解稀释制成供试品溶液和杂质溶液，取供试品溶液及杂质溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，结果如下：样品 保留时间（min） 分离度
杂质I 4.019 10.23
杂质K 6.552 2.18
伏立康唑磷酸酯 7.149 4.62
杂质B 8.883 11.83
杂质H 11.921 1.66
杂质M 12.528 15.98
杂质D 16.052 1.47
杂质L 16.257 1.79
杂质J 16.719 17.43
杂质C 21.438 20.91
杂质F 28.028 12.43
杂质G 31.259 3.72
杂质A 32.692 15.32
杂质E 40.521 ——

[0098] 该色谱条件最长的杂质保留时间为40.521min，该方法可有效检出各杂质。