分子印记纳米磁珠分散固相萃取与质谱联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法

摘要

本发明公开了一种基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，步骤如下：1.制备印记磁珠，将制备好的印记磁珠加入到处理好的大鼠血浆中进行吸附，解析，收集解析液。将上述解析液氮气吹干，用流动相和参考物染料木素复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。采用本发明方法可以针对生物样品基质复杂的作用特点，通过富集代谢物质群，结合活性筛选，追溯中药原形成分，揭示中药虎杖“原形成分-代谢物质群-活性”的相关性，鉴定得到的目标代谢产物数量多，富集效果好。

权利要求

1.一种基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)制备印记磁珠：将Fe3O4@SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入硅烷偶联剂，氮气条件下加热回流12～48h，经磁性分离后，洗涤，真空干燥；氮气保护下，以甲醇为溶剂，依次与丙烯酸甲酯和乙二胺各反应1次，每次反应24～36h，得到纳米磁珠Fe3O4@EDA；将Fe3O4@EDA分散于甲醇溶液，加入三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，氮气条件下加热回流6～36h，经磁性分离后，洗涤，真空干燥，得Fe3O4@TMPTA；将模板分子虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷分别和Fe3O4@TMPTA置于致孔剂中室温下预聚1-2h，再加入甲基丙烯酸室温预聚0.5～2h，最后加入交联剂及引发剂，氮气保护下，依次在50℃下聚合6-24h后，60℃下聚合12-24h；所得聚合物分别用体积比为1:5-9的醋酸甲醇混合溶液洗脱模板分子，干燥，得到虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷分子印记磁珠，分别记为PD-MMIPs、EG-MMIPs；

(2)样品处理：按照给药量为4.0g/kg大鼠给药中药虎杖浸膏后，分别于给药后0分钟，5分钟，10分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，180分钟取血样，将血样分别放于含有抗凝剂的小管中，离心后取上清液得血浆，将每份样品取出相同的量制成混合血浆；随后混合血浆处理如下：取两份混合血浆，分别加入其3倍体积的甲醇，经涡旋、离心，分别取上清液氮气吹干，溶剂复溶，再分别加入PD-MMIPs和EG-MMIPs印记磁珠振摇，磁性分离，弃去上清液，甲醇洗去残留溶液后，加入解析溶液超声30分钟解析模板分子；

(3)样品分析：分别将上述得到的解析液氮气吹干，复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。

2.根据权利要求1所述的基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于步骤(3)中进行半定量分析采用的条件为：高效液相条件：流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：甲醇溶液；色谱柱型号：Hedera ODS-2C18column 4.6×250mm,5μm；梯度条件：0-10min,30-40％B；10-25min,40-60％B；25-

45min,60-80％B；45-60min,80-85％B或者0–5min,15–25％B；5–15min,25–35％B；15–

25min,35–60％B；25–45min,60–70％B；45-60min,70-100％B或者0-15min,15-35％B；15-

25min,35-60％B；25-45min,60-70％B；45-60min,70-80％B；流速：0.5ml/min；柱温：25℃；

进样体积：10μl；

质谱条件：N2流速：10.0l/min；N2温度：320℃；雾化气：45psig；毛细管电压：3500V；碰撞电压：120V；碰撞能：30V。

3.根据权利要求1中所述的基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的Fe3O4@SiO2纳米粒与硅烷偶联剂用量的比例为1:(0.08～0.16)，单位g/mol，硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷。

4.根据权利要求1中所述的基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的丙烯酸甲酯与乙二胺的摩尔比为1:1，丙烯酸甲酯与硅烷偶联剂的摩尔比为(1～7)：(1～2)，乙二胺与交联剂的摩尔比为(1～4):(1～16)。

5.根据权利要求1中所述的基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈；致孔剂为乙腈和\或甲醇。

6.根据权利要求1中所述的基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的模板分子在致孔剂的浓度为1～10mmol·l-1。

7.根据权利要求1中所述的基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的模板分子、甲基丙烯酸、交联剂三者的摩尔比为1:(1～5):(1～25)，引发剂的摩尔量为模板分子摩尔量的10％～20％。

8.根据权利要求1中所述的基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的模板分子和Fe3O4@TMPTA的用量比例为(0.1～0.5)/(30～60)，单位mmol/mg。

9.根据权利要求1中所述的基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于：步骤(2)所述的抗凝剂为肝素钠。

10.根据权利要求1中所述的基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于：步骤(2)所述的混合血浆上清液的取样量为200～500μl，所述的复溶溶剂为乙腈、甲醇体积比(1～5)：(5～9)混合，所述的解析溶液为醋酸甲醇混合溶液。

说明书

分子印记纳米磁珠分散固相萃取与质谱联用用于大鼠血浆中

虎杖代谢物质群的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中药虎杖代谢物质群的检测方法，具体涉及一种基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法。

背景技术

[0002] 中药代谢产物的研究获得了全世界的广泛关注，因其具有潜在的活性成分或生物标记物用于疾病诊断和治疗反应。特别是目标代谢物群的研究，对阐明药效物质基础和中药的有效成分具有重要意义。然而，由于中药代谢产物群的成分多样性，作用复杂性，基质背景干扰，且缺少适当的分析方法，这一部分的研究是远远不够的。因此，对中药目标代谢物群的研究迫切需要一种综合的评价方法和先进的分析战略。

[0003] 虎杖作为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根，广泛分布在亚洲和北美等地区。由于本身具有保肝降血脂、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等药理作用，尤其抗肿瘤活性，常常被作为肿瘤类和心脑血管疾病的化学预防剂。虎杖中富含以反式白藜芦醇苷(虎杖苷，polydatin)为代表的茋类和以大黄素(emodin)为代表的蒽醌类成分，在2010版中国药典中采用高效液相色谱法对上述两种指标成分进行质量控制。虎杖中的茋类成分主要为虎杖苷和反式白藜芦醇(trans-resveratrol)，具有显著的抗肿瘤、抗心脑血管疾病和神经保护的药理活性。虎杖苷及其苷元在体内代谢产物多为其葡萄糖醛酸苷或硫酸酯类化合物，其代谢产物的药理活性在不断深入研究和报道。虎杖中大黄素类成分的体内代谢研究表明，大黄素主要以原型、大黄素-O-8-β-D葡萄糖苷(emodin–8-O-β-D-glucoside)、大黄酸或大黄素甲醚等形式存在，其代谢产物具有显著的抑菌、保肝利胆、抗肿瘤和降血脂等药理活性。但目前研究仅能对原型及主要代谢产物进行定性定量分析，缺乏对体内外物质组的整体认识，从而导致一些微量的代谢产物往往检测不到或者丢失。为了更好地阐明其药效物质基础，需要一种选择性强专属性好的富集分离模式并建立基于整体观的体内外物质组表征方法。

[0004] 目前，各种分析技术如LC-MS、LC-MS以及基于基质干扰、微量成分损失等问题相 继出现的蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等样品预处理技术，已逐渐应用于中药代谢分析，但这些传统方法具有选择性低、干扰大、萃取效率低等缺点。因此，寻找一个有效的预处理方法和步骤对于减少干扰、提高灵敏度是至关重要的。

[0005] 近年来，具有构效预定性、选择识别性和广泛实用性特点的分子印记技术(molecular imprinting technology,MIT)发展迅速，分子印记聚合物(molecular imprinted polymers,MIPs)对模板分子空间结构“记忆”效应和作用位点的“识别”作用，能够高选择性的分离富集复杂体系微量成分。MIT的基本过程包括：(1)印记模板分子与功能单体预聚合；(2)交联剂固定模板分子周围的预组装结合基团；(3)除去模板分子，留下具有特定识别位点且三维结构匹配的空穴。由于MIPs具有选择识别性、稳定性好及使用寿命长等优点，在环境分析、生物传感器等许多领域得到应用。且研究表明，MIPs不仅可对模板分子选择性识别，而且对结构类似物亦具有较好的亲和力和选择识别性。MIPs用于中药体内复杂代谢成分的高选择性分离和检测研究具有令人瞩目的广阔前景。

[0006] 磁性分离技术是当今在生物化学和生物医学工程领域中发展起来一种新的分离技术。是基于磁性微球在外磁场作用下的磁泳运动，从而对目标物进行分离富集的技术，具有快速、高效、非玷污、集分离富集于一体等诸多优点。磁分离技术所面临的关键问题在于粒径大小均一、水中分散性好、磁响应性强、超顺磁性磁性材料的制备，以保证生物分离过程的重现性、可控性和高效性。本论文通过制备出具有高磁响应性的磁性纳米粒，为MIPs的制备省去离心、过滤等繁杂的操作，使其更加省时、方便。

[0007] 未经修饰的磁性纳米粒表面因其缺少官能基团使其应用大大受到限制，对其进行树枝状分子修饰后，可获得高度枝化的三维结构，其结构含有众多具有相同微环境的端基官能团和非缠绕链段，可对树枝状聚合物进行各种端基改性，以满足多种应用需求。树枝状结构有良好的可控制性、高度的分枝、丰富的功能基团，与传统的线型聚合物相比，提供了较大的比表面积，这为MIPs的制备提供了较多的印记位点。

[0008] 针对中药虎杖代谢产物的主要活性成分，发明人通过表面分子印记技术和磁性分离技术的交叉研究，制备出对虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷具有高灵敏度、高选择性印记磁珠，针对中药体内代谢物质结构特点，采用相应的印记磁珠“垂钓”体内代谢物质群，实现中药虎杖总提取物给药后的“多靶标富集”，对目标群进行LC/Q-TOF-MS的鉴定与分析，这与传统的有效部位给药后分析代谢物质的方法相比，更充分考虑中药整体(包括复杂的基质背景)作用的特点，有望揭示虎杖“原型成分-代谢物质群-活性”的相关性，为中药代谢物质群的研究建立了一个有效的分析平台。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取(MMIPs-DSPE)与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法。

[0010] 本发明的目的是通过以下方式实现的：

[0011] 一种基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取(MMIPs-DSPE)与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

[0012] (1)制备印记磁珠：a).将Fe3O4@SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入硅烷偶联剂，氮气条件下加热回流12～48h，经磁性分离后，洗涤，真空干燥；氮气保护下，以甲醇为溶剂，依次与丙烯酸甲酯和乙二胺各反应1次，每次反应24～36h，得到纳米磁珠Fe3O4@EDA；b)将Fe3O4@EDA分散于甲醇溶液，加入三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)，氮气条件下加热回流6～36h，经磁性分离后，洗涤，真空干燥，得Fe3O4@TMPTA；c).将模板分子虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷分别和Fe3O4@TMPTA置于致孔剂中室温下预聚1-2h，再加入甲基丙烯酸室温预聚0.5～2h，最后加入交联剂及引发剂，氮气保护下，依次在50℃下聚合6-24h后，60℃下聚合12-24h；d).所得聚合物分别用体积比为1:5-9的醋酸甲醇混合溶液洗脱模板分子，干燥，得到虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷分子印记磁珠，分别记为PD-MMIPs、EG-MMIPs；

[0013] (2)样品处理：按照给药量为4.0g/kg大鼠给药中药虎杖浸膏后，分别于给药后0分钟，5分钟，10分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，180分钟取血样，将血样分别放于含有抗凝剂的小管中，离心后取上清液得血浆，将每份样品取出相同的量制成混合血浆；随后混合血浆处理如下：取两份混合血浆，分别加入其3倍体积的甲醇，经涡旋、离心，分别取上清液氮气吹干，溶剂复溶，再分别加入PD-MMIPs和EG-MMIPs印记磁珠振摇，磁性分离，弃去上清液，甲醇洗去残留溶液后，加入解析溶液超声30分钟解析模板分子；优选涡旋振荡1分钟、15000r/min离心10分钟。

[0014] (3)样品分析：将上述解析液氮气吹干，复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。复溶用流动相和参考物染料木素，流动相使用量为与染料木素使用量重量比为100：0.05-0.5。

[0015] 步骤(3)中进行半定量分析采用的条件为：

[0016] 高效液相条件：流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：甲醇溶液；色谱柱型号：Hedera ODS-2C18column(4.6×250mm,5μm)；梯度条件：0-10min,30-40％B；10-25min, 40-
60％B；25-45min,60-80％B；45-60min,80-85％B或者0–5min,15–25％B；5–15min,25–35％B；15–25min,35–60％B；25–45min,60–70％B；45-60min,70-100％B或者0-15min,15-35％B；
15-25min,35-60％B；25-45min,60-70％B；45-60min,70-80％B；流速：0.5ml/min；柱温：25℃；进样体积：10μl。

[0017] 质谱条件：N2流速：10.0l/min；N2温度：320℃；雾化气：45psig；毛细管电压：3500[0018] V；碰撞电压：120V；碰撞能：30V。

[0019] 步骤(1)所述的Fe3O4@SiO2纳米粒与硅烷偶联剂用量的比例为1:(0.08～0.16)(g/mol)。，硅烷偶联剂优选为γ-氨丙基三乙氧基硅烷。

[0020] 步骤(1)所述的丙烯酸甲酯与乙二胺的摩尔比为1:1，丙烯酸甲酯与硅烷偶联剂的摩尔比为(1～7)：(1～2)，乙二胺与交联剂的摩尔比为(1～4):(1～16)；

[0021] 步骤(1)所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈；致孔剂为乙腈和\或甲醇，两者体积比(1～5)：(5～9)。

[0022] 步骤(1)所述的模板分子在致孔剂的浓度为1～10mmol l-1。

[0023] 步骤(1)所述的模板分子、甲基丙烯酸、交联剂三者的摩尔比为1:(1～5):(1～25)，引发剂的摩尔量为模板分子摩尔量的10％～20％。

[0024] 步骤(1)所述的模板分子和Fe3O4@TMPTA的用量比例为(0.1～0.5)/(30～60)(mmol/mg)。

[0025] 步骤(2)所述的抗凝剂为肝素钠。

[0026] 步骤(2)所述的混合血浆上清液的取样量为200～500μl。

[0027] 步骤(2)所述的复溶溶剂为乙腈、甲醇体积比(1～5)：(5～9)混合，复溶所用的体积为1～2ml。

[0028] 步骤(2)所述的印记磁珠的用量为10～50mg。

[0029] 步骤(2)所述的解析溶液为醋酸甲醇混合溶液，用量为1～5ml。

[0030] 与现有技术比较本发明的有益效果：

[0031] 1.本发明以Fe3O4作为纳米材料核心，使MIPs的制备和应用变得更加经济，便捷和环保，磁性纳米粒表面包裹的硅胶层不仅是Fe3O4纳米粒的改性剂和稳定剂，而且通过起表面接枝的定位效应使MIPs识别位点均匀分布，同时作为载体使MIPs纳米结构具有高度刚性和稳定性，磁性分离技术也为树枝状大分子及分子印记技术的发展提供新的思路。

[0032] 2.本发明以中药整体观、多组分、多靶点作用为指导，充分考虑中药整体代谢物群。

[0033] 3.本发明制备的分子印记磁珠，具有较好的动力学特征，有效利用率较高，吸附量高。

[0034] 4.本发明所提出的分子印记磁珠分散固相萃取(MMIPs-DSPE)与LC/Q-TOF-MS联用的检测方法，鉴定得到的代谢产物数量多，富集效果好，本发明所采用的MMIPs-DSPE与LC/Q-TOF-MS联用检测方法针对生物样品基质复杂的作用特点，可以通过富集代谢物质群，结合活性筛选，追溯中药原形成分，揭示中药虎杖“原形成分-代谢物质群-活性”的相关性，为阐明体内外药效物质关系和发现潜在先导化合物提供研究思路，有望广泛应用于中药活性代谢物质群的发现及药效物质基础研究。

附图说明

[0035] 图1：以PD-MMIPs为例，对大鼠血浆中茋类代谢物质群进行萃取的流程图。

[0036] 图2：不同方法处理大鼠血浆虎杖代谢产物得到的总离子流图(S1-S18为茋类代谢物，A1-A20为蒽醌类代谢产物，C1-C5为其它类别的代谢产物，*为参考物质染料木素)[0037] 图3：不同处理方法对九种对照品的ME:(1)PD，(2)氧化白藜芦醇，(3)白藜芦醇，(4)EG，(5)芦荟大黄素，(6)大黄酸，(7)大黄素，(8)大黄酚，(9)大黄素甲醚。

具体实施方式

[0038] 以下通过具体实施例对本发明做进一步阐述，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。

[0039] 实施例1

[0040] 1、制备Fe3O4@SiO2纳米磁珠：

[0041] 250ml三颈瓶中加入80ml除氧去离子水，氮气保护下加入4.72g FeCl3·6H2O和1.72g FeCl2·4H2O，800rmp/min搅拌，80℃逐滴加入浓氨水10ml,聚乙二醇2ml，反应1h，磁性分离得黑色的Fe3O4纳米磁珠，去离子水洗至中性备用；

[0042] 取0.5g Fe3O4纳米磁珠均匀分散于50ml乙醇和2ml去离子水中，保持200rmp/min搅拌速度，加入2ml浓氨水和5ml正硅酸四乙酯(TEOS)，室温反应12h，磁性分离得Fe3O4@SiO2纳米磁珠，去离子水洗至中性，烘干备用；

[0043] 2、Fe3O4@SiO2纳米磁珠功能化接枝：

[0044] 取0.1g Fe3O4@SiO2纳米磁珠(即Fe3O4@SiO2纳米粒)分散于50ml甲苯中，加入2mlγ-氨丙基三乙氧基硅烷，氮气下加热回流24～36h，经磁性分离，依次用甲苯、甲醇洗涤，真空干燥，得到功能化修饰的Fe3O4@SiO2纳米磁珠；

[0045] 3、表面树枝状纳米磁珠的制备：

[0046] 取功能化修饰的Fe3O4@SiO2纳米磁珠，加入50ml甲醇及3.75ml丙烯酸甲酯，在氮气保护下，加热回流24～36h，经磁性分离，用甲醇洗涤，真空干燥；随后，加入50ml甲醇及2.27ml乙二胺，在氮气保护下，加热回流24～36h，经磁性分离，用甲醇洗涤，真空干燥得Fe3O4@EDA。取0.5g Fe3O4@EDA分散于50ml甲醇中，加入22ml TMPTA，氮气条件下加热回流
6h，经磁性分离后，洗涤，真空干燥，即得表面树枝状纳米磁珠；

[0047] 实施例2

[0048] 1、制备Fe3O4@SiO2纳米磁珠：

[0049] 250ml三颈瓶中加入80ml除氧去离子水，氮气保护下加入4.72g FeCl3·6H2O和1.72g FeCl2·4H2O，800rmp/min搅拌，80℃逐滴加入浓氨水7ml,聚乙二醇2ml，反应1h，磁性分离得黑色的Fe3O4纳米磁珠，去离子水洗至中性备用；

[0050] 取1.0g Fe3O4纳米磁珠均匀分散于50ml乙醇和2ml去离子水中，保持200rmp/min搅拌速度，加入2ml浓氨水和4ml正硅酸四乙酯(TEOS)，室温反应12h，磁性分离得Fe3O4@SiO2纳米磁珠，去离子水洗至中性，烘干备用；

[0051] 2、Fe3O4@SiO2纳米磁珠功能化接枝：

[0052] 取0.1g Fe3O4@SiO2纳米磁珠分散于50ml甲苯中，加入3mlγ-氨丙基三乙氧基硅烷，氮气下加热回流24～36h，经磁性分离，依次用甲苯、甲醇洗涤，真空干燥，得到功能化修饰的Fe3O4@SiO2纳米磁珠；

[0053] 3、表面树枝状纳米磁珠的制备：

[0054] 取功能化修饰的Fe3O4@SiO2纳米磁珠，加入50ml甲醇及4.5ml丙烯酸甲酯(MA)，在氮气保护下，加热回流24～36h，经磁性分离，用甲醇洗涤，真空干燥；随后，加入50ml甲醇及4ml乙二胺(EDA)，在氮气保护下，加热回流24～36h，经磁性分离，用甲醇洗涤，真空干燥得Fe3O4@EDA。取0.5g Fe3O4@EDA分散于50ml甲醇中，加入44ml TMPTA，氮气条件下加热回流
6h，经磁性分离后，洗涤，真空干燥，即得表面树枝状纳米磁珠；

[0055] 实施例3

[0056] 1、制备Fe3O4@SiO2纳米磁珠：

[0057] 250ml三颈瓶中，加入80ml除氧去离子水，氮气保护下加入4.72g FeCl3·6H2O和1.72g FeCl2·4H2O，800rmp/min搅拌，80℃逐滴加入浓氨水10ml,聚乙二醇2ml，反应1h，磁性分离得黑色的Fe3O4纳米磁珠，去离子水洗至中性备用；

[0058] 取1.0g Fe3O4纳米磁珠，均匀分散于50ml乙醇和1ml去离子水中，保持200rmp/min搅拌速度，加入1ml浓氨水和5ml正硅酸四乙酯(TEOS)，室温反应12h，磁性分离得Fe3O4@SiO2纳米磁珠，去离子水洗至中性，烘干备用；

[0059] 2、Fe3O4@SiO2纳米磁珠功能化接枝：

[0060] 取0.1g Fe3O4@SiO2纳米磁珠分散于50ml甲苯中，加入3.7mlγ-氨丙基三乙氧基硅烷，氮气下加热回流24～36h，经磁性分离，依次用甲苯、甲醇洗涤，真空干燥，得到功能化修饰的Fe3O4@SiO2纳米磁珠；

[0061] 3、表面树枝状纳米磁珠的制备：

[0062] 取功能化修饰的Fe3O4@SiO2纳米磁珠，加入50ml甲醇及7ml丙烯酸甲酯(MA)，在氮气保护下，加热回流24～36h，经磁性分离，用甲醇洗涤，真空干燥；随后，加入50ml甲醇及8ml乙二胺(EDA)，在氮气保护下，加热回流24～36h，经磁性分离，用甲醇洗涤，真空干燥得Fe3O4@EDA。取0.5g Fe3O4@EDA分散于50ml甲醇中，加入88ml TMPTA，氮气条件下加热回流
6h，经磁性分离后，洗涤，真空干燥，即得表面树枝状纳米磁珠；

[0063] 实施例4

[0064] 1、PD-MMIPs的制备：

[0065] 100mg虎杖苷和55mg按照实施例1方法制备的表面树枝状纳米磁珠在50ml甲醇中室温下预聚1.5h，随后加入66μl甲基丙烯酸，室温下预聚1.5h，然后加入148μl乙二醇二甲基丙烯酸酯及30mg偶氮二异丁腈，在氮气保护下，依次在50℃下反应6h，60℃下反应24h。反应结束后，聚合物用醋酸甲醇(v:v＝1:5)混合溶液洗脱模板分子，真空干燥得到PD-MMIPs。

[0066] 2、EG-MMIPs的制备：

[0067] 100mg大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和55mg按照实施例1方法制备的表面树枝状纳米磁珠在50ml甲醇中室温下预聚1.5h，随后加入59μl甲基丙烯酸，室温下预聚1.5h，然后加入290μl乙二醇二甲基丙烯酸酯及30mg偶氮二异丁腈，在氮气保护下，依次在50℃下反应6h，
60℃下反应24h。反应结束后，聚合物用醋酸甲醇(v:v＝2:8)混合溶液洗脱模板分子，真空干燥得EG-MMIPs。

[0068] 实施例5

[0069] 1、PD-MMIPs的制备：

[0070] 100mg虎杖苷和50mg按照实施例2方法制备的表面树枝状纳米磁珠在50ml乙腈— 甲醇(9：1/v:v)中室温下预聚1h，随后加入88μl甲基丙烯酸，室温下预聚1h，然后加入197μl乙二醇二甲基丙烯酸酯及30mg偶氮二异丁腈，在氮气保护下，依次在50℃下反应6h，60℃下反应24h。反应结束后，聚合物用醋酸甲醇(即v:v＝1:9)混合溶液洗脱模板分子，真空干燥得到PD-MMIPs。

[0071] 2、EG-MMIPs的制备：

[0072] 100mg大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和55mg按照实施例2方法制备的表面树枝状纳米磁珠在50ml乙腈—甲醇(5：5/v:v)中室温下预聚1h，随后加入59μl甲基丙烯酸，室温下预聚1h，然后加入580μl乙二醇二甲基丙烯酸酯及30mg偶氮二异丁腈，在氮气保护下，依次在50℃下反应6h，60℃下反应24h。反应结束后，聚合物用醋酸甲醇(即v:v＝1:5)混合溶液洗脱模板分子，真空干燥得到EG-MMIPs。

[0073] 实施例6

[0074] 1、PD-MMIPs的制备：

[0075] 100mg虎杖苷和55mg按照实施例3方法制备的表面树枝状纳米磁珠在50ml甲醇中室温下预聚2h，随后加入66μl甲基丙烯酸，室温下预聚2h，然后加入443μl乙二醇二甲基丙烯酸酯及30mg偶氮二异丁腈，在氮气保护下，依次在50℃下反应24h，60℃下反应12h。反应结束后，聚合物用醋酸甲醇(v:v＝1:9)混合溶液洗脱模板分子，真空干燥得到PD-MMIPs。

[0076] 2、EG-MMIPs的制备：

[0077] 100mg大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和按照实施例3方法制备的55mg表面树枝状纳米磁珠在50ml乙腈—甲醇(5：5/v:v)中室温下预聚1h，随后加入79μl甲基丙烯酸，室温下预聚1h，然后加入348μl乙二醇二甲基丙烯酸酯及30mg偶氮二异丁腈，在氮气保护下，依次在50℃下反应6h，60℃下反应24h。反应结束后，聚合物用醋酸甲醇(即v:v＝1:5)混合溶液洗脱模板分子，真空干燥得到EG-MMIPs。

[0078] 实施例7

[0079] 1、样品处理：按照给药量为4.0g/kg大鼠给药中药虎杖浸膏后，分别于给药后0分钟，5分钟，10分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，180分钟取血样，血样分别放于含有抗凝剂肝素钠的小管中，离心后取上清液得血浆，将每份样品取出相同的量制成混合血浆，将适量混合血浆加入3倍体积的甲醇涡旋振荡1分钟、15000r/min离心10分钟后取200μl上清液氮气吹干，1ml体积比1：5的乙腈和甲醇混合溶剂复溶，加入10mg按照实施例4方法制备的EG-MMIPs印记磁珠摇床振摇30分钟后，磁性分离弃去上清液，适量 甲醇洗去残留溶液后，加入4ml醋酸甲醇混合溶液(v:v＝1:9)作为解析溶液超声30分钟解析模板分子。

[0080] 2、样品分析：将上述解析液氮气吹干，用100μl流动相和0.1μg染料木素复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。

[0081] 高效液相条件：流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：甲醇溶液；色谱柱型号：Hedera ODS-2C18column(4.6×250mm,5μm)；梯度条件：0-10min,30-40％B；10-25min,40-
60％B；25-45min,60-80％B；45-60min,80-85％B；流速：0.5ml/min；柱温：25℃；进样体积：
10μl。

[0082] 质谱条件：N2流速：10.0l/min；N2温度：320℃；雾化气：45psig；毛细管电压：3500V；碰撞电压：120V；碰撞能：30V。

[0083] 实施例8

[0084] 1、样品处理：按照给药量为4.0g/kg大鼠给药中药虎杖浸膏后，分别于给药后0分钟，5分钟，10分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，180分钟取血样，血样分别放于含有肝素钠的小管中，离心后取上清液得血浆，将每份样品取出相同的量制成混合血浆，将适量混合血浆加入3倍体积的甲醇涡旋振荡1分钟、15000r/min离心10分钟后取300μl上清液氮气吹干，2ml体积比1：5的乙腈和甲醇混合溶剂复溶，加入20mg按照实施例5方法制备的PD-MMIPs印记磁珠摇床振摇30分钟后，磁性分离弃去上清液，适量甲醇洗去残留溶液后，加入2ml醋酸甲醇混合溶液(醋酸与甲醇体积比1：5)作为解析溶液超声30分钟解析模板分子。

[0085] 2、样品分析：将上述解析液氮气吹干，用100μl流动相和0.1μg染料木素复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。

[0086] 高效液相条件：流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：甲醇溶液；色谱柱型号：Hedera ODS-2C18column(4.6×250mm,5μm)；梯度条件：0-5min,15-25％B；5-15min,25-
35％B；15-25min,35-60％B；25-45min,60-70％B；45-60min,70-100％B；流速：0.5ml/min；
柱温：25℃；进样体积：10μl。

[0087] 质谱条件：N2流速：10.0l/min；N2温度：320℃；雾化气：45psig；毛细管电压：3500V；碰撞电压：120V；碰撞能：30V。

[0088] 实施例9

[0089] 1、样品处理：按照给药量为4.0g/kg大鼠给药中药虎杖浸膏后，分别于给药后0分钟，5分钟，10分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，180分钟取血样，将血样分别放 于含有肝素钠的小管中，离心后取上清液得血浆，将每份样品取出相同的量制成混合血浆，将适量混合血浆加入3倍体积的甲醇涡旋振荡1分钟、15000r/min离心10分钟后取500μl上清液氮气吹干，2ml体积比1：5的乙腈和甲醇混合溶剂复溶，加入20mg按照实施例6方法制备的PD-MMIPs印记磁珠摇床振摇30分钟后，磁性分离弃去上清液，适量甲醇洗去残留溶液后，加入1ml醋酸甲醇混合溶液(醋酸与甲醇体积比1：9)作为解析溶液超声30分钟解析模板分子。

[0090] 2、样品分析：将得到的解析液氮气吹干，用100μl流动相和0.1μg参考物染料木素复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。

[0091] 高效液相条件：流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：甲醇溶液；色谱柱型号：Hedera ODS-2C18column(4.6×250mm,5μm)；梯度条件：0-15min,15-35％B；15-25min,35-
60％B；25-45min,60-70％B；45-60min,70-80％B；流速：0.5ml/min；柱温：25℃；进样体积：
10μl。

[0092] 质谱条件：N2流速：10.0l/min；N2温度：320℃；雾化气：45psig；毛细管电压：3500V；碰撞电压：120V；碰撞能：30V。

[0093] 上述实施例中虎杖浸膏的制备方法如下：将虎杖的根及根茎剪碎后浸泡在药材6-10倍体积的75％乙醇1小时，然后加热回流提取1-3小时，将提取液过滤，滤液60℃旋转蒸发干燥，得虎杖浸膏。

[0094] 大鼠给药时将虎杖浸膏用0.5％羧甲基纤维素钠溶解，制成350mg ml-1的混悬溶液，大鼠给药量为4.0g/kg。

[0095] 对上述实施例浸膏中虎杖晶IV号(PD)进行含量测定：在10mg浸膏中加入10ml甲醇，超声30分钟，然后15000rpm下离心10分钟，取上清液进行常规液相分析。结果表明，浸膏中虎杖晶IV号(PD)的含量大于9％。

[0096] 对比例：

[0097] 传统处理方法：

[0098] 蛋白沉淀(PP)：取适量混合血浆加入其3倍体积的乙腈涡旋振荡1分钟、15000r/min离心10分钟后取300μl上清液氮气吹干，用100μl流动相和0.1μg参考物染料木素复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。

[0099] 液液萃取(LLE)：取适量混合血浆加入其3倍体积的乙腈涡旋振荡1分钟、15000r/min 离心10分钟后取300μl上清液氮气吹干，500μl蒸馏水溶解，加2ml乙酸乙酯提取，最终取有机相氮气吹干，用100μl流动相和0.1μg参考物染料木素复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。

[0100] SPE:固相萃取小柱(1cc,30mg,Waters,USA)用2ml甲醇、2ml水活化平衡后，将300μl上清液氮气吹干，1lm蒸馏水复溶后载样，加入3ml蒸馏水和2ml甲醇：水(15:85,v/v)洗涤，随后用2ml甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用100μl流动相和0.1μg参考物染料木素复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。

[0101] 以下对上述方法进行基质效应(ME)考察和萃取容量的比较：

[0102] 一、基质效应(ME)考察：考察不同处理方法对九种对照品的ME。2μg ml-1的PD,氧化白藜芦醇,白藜芦醇,EG,大黄素,大黄酸,大黄素甲醚,大黄酚和芦荟大黄素甲醇溶液作为标准溶液。空白血浆经过不同方法处理后加入相同浓度标准溶液作为基质处理溶液。将上述溶液进LC/Q-TOF-MS分析。计算公式如下：ME(％)＝(1-空白基质处理后加入相同量药物所测的峰面积/相同量标准溶液的峰面积)*100％，详见图2。

[0103] 由图2可知，通过代谢产物个数的比较：PP共鉴别出24个代谢产物包括11个茋类代谢物，10个蒽醌类代谢产物和3个其它类别的代谢产物；LLE共鉴别出17个代谢产物包括7个茋类代谢物，9个蒽醌类代谢产物和1个其它类别的代谢产物；同样地，SPE共鉴别出22个代谢产物但没有明显的选择性。与上述方法相比，采用实施例PD-MMIPs鉴别出21个代谢产物包括17个茋类代谢物和4个蒽醌类代谢产物(丰度较低)。采用实施例EG-MMIPs鉴别出23个代谢产物包括19个蒽醌类代谢产物。可见MMIPs-DSPE不仅得到的代谢产物多，且具有较明显的选择性。

[0104] 二、萃取容量的比较：设参考物染料木素的响应值为1，计算出其它代谢产物的峰响应值。结果得出采用实施例PD-MMIPs对茋类代谢物的总峰响应值为7.29，采用实施例EG-MMIPs对蒽醌类代谢产物的总峰响应值为6.19，均比其它方法优越。详见图3。

[0105] 蛋白沉淀的ME(％)范围为12.43-43.95％，LLE的范围为7.88-25.94％，SPE的范围为3.41-16.00％。与上述传统方法相比，MMIPs-DSPE的ME(％)范围为1.52-8.96％。由此可见，MMIPs-DSPE能有效降低ME。